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Immunology and Infection

ネズミリンパ節間質細胞の単離

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

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リンパ節は、外国と自己抗原に対する適応免疫応答が開始され、調整されている特殊なコンパートメントである。ここに提示手順は、リンパ節単一細胞懸濁液を得て、いくつかの分子の表面発現を維持する実行可能な節間質細胞へのアクセスを得るために自動化された機械的ピペッティングと組み合わせる短い酵素消化を記載している。

リンパ節間質細胞、リンパ節の足場を形成し、三つの主要な機能を果たす:最初それらは存在する抗原、病原体およびそれらの病原体関連分子パターン(PAMPに)、ならびにサイトカインおよび危険性関連分子パターン(DAMPS)をサンプリングするために体液をフィルタリング体内で。第二に、それらが相互作用し、適応免疫応答を開始するための抗原提示細胞(APC)およびリンパ球を誘引し、指示する。第三に、それらは、リンパ球1の恒常性および分化のための構造的な環境を提供する-3。炎症リンパ節間質細胞は、成長因子、サイトカイン及びケモカインを産生中に、樹状細胞(DC)との相互作用を整理することにより、T-およびB細胞膨潤に適応する。免疫応答のオーケストレーションは、異なる間質細胞集団によって形成される複合体の構造的アーキテクチャにのみ可能である。

リンパ節間質細胞は、CD45陰性細胞で、線維芽細胞および内皮細胞においてCD31の発現またはGP38によって1-6を区別することができる。 GP38 + CD31が- (もFRCとしても知られ、TRC、:線維芽細胞細網細胞)、Tゾーンの網状細胞を定義して、GP38 + CD31 +がリンパ管内皮細胞(LEC)を定義して、GP38 - CD31 +は、血液内皮細胞(BEC)を定義します。さらに、集団の特徴付けは、他のリンパ節間質細胞の存在が明らかになった。実際、小周皮細胞様細胞集団内で特徴づけられたGP38 - CD31 -人口7。したがって、単離手順の適応は、異なるリンパ節間質細胞の機能的特性の同定および特徴付けのために有利である。

リンパ節間質細胞消化の開発の前にリンパ節間質細胞の研究は、組織切片や顕微鏡を用いてその場観察にに限られていたプロトコル。それにもかかわらず、構造的および機能的研究は、リンパ節間質細胞の重要な特徴を示した。リンパ節間質細胞は、高内皮へのリンパ節の被膜下洞からリンパおよび関連する低分子量タンパク質を輸送する導管システムと呼ばれる複雑な3次元構造を形成するポドプラニン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス(ECM)タンパク質と関連しているT細胞ゾーン8に静脈。 DCは、間質細胞と密接に接触している管状詐欺に突出観察することができるduit構造は、流体サンプルと抗原8を検出する。 DCとリンパ節間質細胞(TRCはとのLEC)の相互作用はケモカインCCL21とCCL19 9,10の放出および提示によって媒介される。 CCL19およびCCL21は、リンパ節のT細胞領域4,11に移行するDCおよびT細胞を促進するCCR7受容体によって認識される。類似したケモカインを使用しているにもかかわらず、DCとT細胞は、リンパ節12内に異なった移動ルートを持っている。その後、リンパ節および純粋なリンパ節間質細胞の単離の酵素消化を使用して、機能的研究は、異なるリンパ節間質細胞の役割とDCおよびT / B細胞6,13と相互作用するその能力に基づいて行った。まず、IFN-γ産生エフェクターT細胞及びリンパ節間質細胞間のクロストークは、二次リンパ器官14-16にT細胞応答および増殖を弱めることが示さ代謝産物一酸化窒素の産生を誘導する。第二に、リンパnはオード間質細胞は、IL-10の産17を介して規制DCサブセットの分化を支持すること、およびIL-7 6,18の産生を介してナイーブT細胞の恒常性を調節することが報告されている。第三に、リンパ節間質細胞におけるTLRの発現は、間質細胞は、組織傷害において放出、感染または自己分子に由来する信号の影響を受けやすいことを示唆している。実際に、TLR3ポリリガンドとリンパ節間質細胞の処理は、(I:C)は、結果として共阻害分子PD-L1のではなく、共刺激分子の主要組織適合性複合体クラスIの発現及び上方制御の控えめな上方制御を誘導する末梢組織抗原発現の19の劇的な変化。いくつかのグループが、リンパ節間質細胞は、末梢組織抗原を発現し、自己反応性T細胞19,21-27の寛容を誘導することが示されている。したがって、リンパ節間質細胞および他の遊走および再間の相互作用を理解することsidentリンパ節細胞は、炎症の間に活性化または免疫応答の抑制を可能にする新たな標的分子を見つけるために役立つ。したがって、リンパ節の公開酵素分離の実施が必要である。

以前公開されたプロトコルは、低機械的ストレス6,19,20とコラゲナーゼベースの酵素消化の異なる組み合わせを使用しています。しかし、消化酵素または消化酵素の異なる組み合わせの長いインキュベーションは、活性化状態を分析するために、新たなリンパ節間質細胞を同定するために必要な各種表面分子を劣化させるかもしれない。間質細胞分析の種類に応じて、リンクプロトコルまたはフレッチャー·プロトコルは、より適しているかもしれません。記載された手順では、わずかに短い酵素消化は、実行可能なリンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限にするために自動化された機械的解離と組み合わされる。この手順では、再現性の高い分離を可能にし、低い変動性と95%以上の生存率を有するリンパ節間質細胞集団の区別。新たに単離したリンパ節間質細胞は、 インビトロで直接機能アッセイを実行するために、表面マーカー発現、タンパク質分析、および転写の研究、ならびに間質細胞株の樹立のために使用することができる

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Protocol

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このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物手順は州立機関バーゼル=シュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。

1。リンパ節の準備と消化

  1. 加熱プレートとマグネチックスターラー上で37℃にビーカー内の前の熱水。
  2. 次のような基本的なミディアムを準備したDMEM培地(ピルビン酸なし)、2%FCSを補充し、1.2mMのCaCl 2およびペニシリン/ストレプトマイシン(ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μgの)。
  3. 使用前にすべての解剖器具を滅菌する。
  4. CO 2窒息あたりのリンパ節ドナーマウスを安楽死し、無菌的にリンパ節を解剖。周囲の脂肪を解剖しないでください。注:このプロトコルは、末梢皮膚流入領域リンパ節(鼠径、上腕、腋窩)に最適化されています。
  5. 2ミリリットルの氷冷塩基性媒体を含む滅菌ペトリ皿にリンパ節を配置します。
  6. リンパ節CAを混乱させる1mlシリンジに固定された2つの25のGの針を使用してpsule。
  7. 1 mg / mlのコラゲナーゼIVおよび40μg/ mlのDNアーゼIを補充した750μlの基本培地を含む5ミリリットルのポリプロピレン丸底チューブ内の破壊されたリンパ節組織を転送
  8. 各チューブ内の1つの無菌磁気攪拌機を追加します。
  9. 37℃でビーカー内の場所チューブは、水を予熱し、30分間ゆっくりとした速度(1ラウンド/秒)で、チューブをかき混ぜる。
  10. 加熱板と磁気攪拌機からチューブを外し、リンパ節の断片が安定しましょう​​。
  11. 慎重に「非間質細胞」が濃縮された上清を除去。注:T、B、樹状細胞およびCD45を分析する場合- GP38 - CD31 -は予見され、「非間質細胞」部分を保存します。
  12. 洗浄は750μlの基本培地で1回リンパ節組織を残り。注:この手順は、免疫能力のあるマウスを操作する場合にのみ必要です。
  13. リンパ節断片が沈降しましょう​​。
  14. 削除する非間質細胞浮遊割合。
  15. リンパ節フラグメントに750μlの基本3.5ミリグラムを添加した培地/ mlのコラゲナーゼDを追加し、40 / mlのDNアーゼI。
  16. バックを37℃予熱した水を入れたビーカー内チューブを配置します。
  17. ゆっくり攪拌しながら5分間リンパ節組織を消化。
  18. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で10サイクル700μlの混合。注:これは消化を改善するためにリンパ節組織を破壊する。
  19. 37℃の予熱された水で戻ってビーカー内チューブを配置します。
  20. ゆっくりと撹拌しながらさらに10分間、リンパ節組織断片を消化。
  21. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で99回混合する。
  22. 単一細胞懸濁液の維持を確実にするために、0.5MのEDTA 7.5を添加する。
  23. パイプによってリンパ節組織断片を分解準自動化されたマルチチャンネルピペットを用いて、最大のスピードで99サイクルで混合。
  24. 750μlの塩基性媒体を追加し、70μmのナイロンメッシュを通して細胞を渡します。
  25. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を5分間。
  26. 間質細胞は現在、さらなる分析のために使用することができる。

リンパ節間質細胞の染色2。

  1. 成功したTRC、LEC、BECおよびDN細胞を認識するために抗CD45、抗ポドプラニン(GP38)、抗CD31抗体の組み合わせを使用してください。
  2. 2を含む100μlのHBSS中の抗GP38-PE(1:200)、抗CD31-APC(200 1):ライブ/デッドトラッカー、抗CD45-FITC(200 1)で消化したリンパ節組織をインキュベート暗所で少なくとも20分間%のFCS、4°C、。
  3. 2%FCSを含むHBSSの500リットルを追加し、細胞を洗浄
  4. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を3分。
  5. 2%FCSを含むHBSS100μl中に再懸濁する。
  6. equippフローサイトメーターで染色された細胞を実行します以下の光学系とED:励起最大3つのレーザーを持つソース:青(488nmで、空冷式、20 mWのソリッドステート)、赤(633nmで、17 mWのヘリウムネオン)、バイオレット(405nmで、30 mWのソリッドステート) 。
  7. 門CD45 -細胞は造血細胞を排除する。
  8. ダブレットと死細胞を除外するためのゲート·シングレット(FSC-W)と生細胞(LIVE / DEADトラッカー)。
  9. 、LEC(GP38 + CD31 +)、BEC(GP38 - CD31 +)およびDN(GP38 - CD31 - )細胞( 図1参照) - TRC(GP38 + CD31)を可視化する、CD31 プロットGP38。

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Representative Results

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現在のプロトコルが原因自動化されたマルチチャンネルピ ​​ペットで機械的に解離に短い消化時間(45分以内)にリンク 、2007 6によって公開修正された消化プロトコルです。また、手順はより標準化され、異なるリンパ節間質細胞上の表面マーカーの劣化を最小限に抑え、同時に複数のサンプルの処理を可能にする。

コラゲナーゼIVおよびコラゲナーゼDリンクプロトコル6と現在のプロトコルまたはコラゲナーゼP内およびディスパーゼFletchersプロトコルでの13リンパ節間質細胞の生存率を維持し、CD45、GP38およびCD31を含むいくつかの表面マーカーの消化を惜しま。テストするために現在のプロトコル、腋窩、上腕および鼠径リンパ節を取り出し、それらの間質細胞を単離するために消化した。 CD45、GP38およびCD31発現の分析を、C57BL / 6メートルから分離されたTRC、LEC、BECおよびDN細胞の存在を実証した氷( 図1、ゲート戦略)。

機械的ストレスが消化中リンパ節間質細胞の生存率を減少させるかもしれない。三つの異なるプロトコルを使用して、間質細胞の単離集団の生存率を比較すると、それは現在のプロトコルはより良い表示が、生存率は、現在のプロトコルとリンクプロトコル( 図2A)の両方にフレッチャープロトコルにおける95%よりも高いが、より低いことがわかったBEC亜集団での生存率は、プロトコルをリンクします。全細胞数は、リンパ節間質細胞サブセットのポスト消化を回収するリンクプロトコルおよびフレッチャープロトコル( 図2A)と比較して現在のプロトコルでわずかに高かった。これらの結果は、現在のプロトコルは、公開されたプロトコルに類似するリンパ節間質細胞の生存能力を維持することを実証する。 3つのプロトコルの主な違いを表1に記載されています。

表面マーカーaをフローサイトメトリーによるリンパ節間質細胞を特徴付けるために、セルソーティングによってそれらを分離するために必要な再。 TRCはとLECが、リンクおよびフレッチャープロトコルはIA b 、CD140a、CD80、PD-L1およびCD40発現のために現在を比較した孤立ビア。すべての3つのプロトコルにより間質細胞を単離した後、私たちは、IA b 、CD80、CD140a、PD-L1の発現を発見し、CD40はTRCをとのLEC( 図2B)の両方でのCPおよびLPでの消化の際に高かった。これらの結果は、コラゲナーゼIVおよびDは、いくつかの表面分子の劣化がコラゲナーゼPおよびディスパーゼの場合ほど強​​いことを示唆している。

まとめると、現在のプロトコルは、生存リンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限にするために自動化された機械的脱凝集と組み合わせた短い消化を含む。

"/>
C57BL / 6マウスから、図1のTRC、LEC、BEC、およびDN細胞の染色、ゲーティング、および定量。リンパ節は、現在のプロトコルに従って消化し ​​、TRC、LECを定義するために、CD45、GP38およびCD31、/ライブデッドで染色したフローサイトメトリーによるBEC、およびDN細胞。データは、染色の代表的な結果を示しています。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

図2
リンパ節間質細胞の図2。生存率および表面マーカー発現。C57BL / 6マウスからのリンパ節は、Linkの(LP)とフレッチャーのプロトコル(FP)とCD45、GP38およびCD31で染色し、定義する電流(CP)は、次の消化し ​​たフローサイトメトリーによるTRC、LEC、BECおよびDN細胞。A)Viabil性と生/死染色後、すべてのリンパ節間質細胞集団の総細胞数。B)IA b 表面発現の分析(APC-Cy7で)、CD140a(nは≥5、2つの独立した実験のプールされたデータが、バーはSEMを表す) (PerCPを-Cy5.5の)、CD80(PerCPを-Cy5.5の)、PD-L1(PE-Cy7で)とTRCを上のCD40(PE-Cy7は)とのLECた(n = 6、LP及びCPのためのFPであり、n = 11 、2つの独立した実験、バーはSEMを表す)のデータをプールした。 LEC-APC-Cy7での幾何MFIの自家蛍光値:324±97、LEC-PECy7:163±82.5、LEC-PerCpCy5.5:156±36、TRC-APC-Cy7で:349±152、TRC-PECy7:117 121±45:TRC-PerCPを-Cy5.5のは、54±。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

現在のプロトコル、酵素現在のプロトコルリンクプロトコル酵素リンク·プロトコル Fレッチャープロトコル酵素フレッチャー·プロトコル
コラゲナーゼIV、DNアーゼI 30分、37℃、攪拌コラゲナーゼIV、DNアーゼI 30分間、37°C コラゲナーゼP、ディスパーゼ、DNアーゼI 20分、37°C​​で、5分毎に反転
コラゲナーゼD、DNアーゼI 5分、37℃で、撹拌、再懸濁コラゲナーゼD、DNアーゼI 20分、37°C コラゲナーゼP、ディスパーゼ、DNアーゼI 10分間、37°C​​で、30秒間再懸濁
10分、37℃、攪拌コラゲナーゼD、DNアーゼI 37℃、完全消化するまで10分ごとに再懸濁コラゲナーゼP、ディスパーゼ、DNアーゼI 37℃、完全消化するまで5分毎に再懸濁
自動化された機械的な再懸濁

表のCP、LPの1短い要約、FPの使用される酵素とプロトコル。

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Discussion

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リンパ節間質細胞の研究は、最近公開された消化による2プロトコル6,13の開発に研究の焦点となった。両方のプロトコルは、単一のリンパ節間質細胞を獲得するのに十分であるが、消化酵素と消化の時間の使い方が異なります。間質細胞およびそれらの表面マーカーは、酵素消化および機械的応力に敏感であるため、最適化されたプロトコルが必要とされる。

新鮮に解剖し、リンパ節から実行可能なリンパ節間質細胞の単離は、表現型および機能解析を実行するための最初のステップです。したがって、慎重に安定した温度及び示された時間のために、酵素の規定された濃度で消化することが重要である。二つ消化プロトコルがしかしかなり長い消化ステップで、6,13に記載されている。消化の時間を短縮するために、機械的な分解が含まれ、マルチチャネルピペットを用いて標準化した。上の現在のプロトコルの利点の電子はしたがって、消化酵素とのインキュベーション時間を最小限に、わずか45分で間質細胞の単離を可能にすることである。また、消化中の一定の撹拌は、リンパ節構造への消化酵素の最適なアクセスを可能にする。また、消化容積は、使用する酵素の量を最小μlの750に減少した。

過度の機械的な力は、タイトジャンクショ​​ンを破壊が、同時に細胞死を引き起こす可能性があります。このような理由から、私たちは再懸濁サイクルと異なる解離デバイスのいくつかの組み合わせをテストした。私たちは、自動化されたマルチチャンネルピペットの使用は、99サイクルの2アプリケーション内で解離を可能にすることを見出した。細胞に一定の圧力を適用し、これが最適な生存能力を有する単一の細胞懸濁液をもたらす。 4〜6個の試料を混合し、リンパ節間質細胞単離の時間を低減すると同時にピペッティングすることができる。

ontent ">消化プロトコルは、ほとんどすべての分子の表面発現を維持しなければならない;集団は、均一または不均一である場合にのみ、このようにいくつかのマーカーとの併用染色を明らかにすることができ、例えば、中BP-3およびCD35の使用。 TRCのGP38 + CD31 - 。髄TRC(Sanjivルター、私信)の可視化および単離が可能になりさらに、特徴付けが乏しいDN画分を、さらに7で検討インテグリンα7(、陽性の細胞のようなアイレ+細胞および周皮細胞を含むものとして特徴付けられた13)。従って、本プロトコルは、公開されたものと比較した。公開のものと比較して、現在のプロトコルを用いて得られた結果は、同様の周波数およびリンパ節間質細胞の数に示すように、単離されたTRCの興味深いことに、頻度および数最高現在のプロトコルに比べて、TRC構造のより良い解離を示唆しているフレッチャープロトコルを使用していたし、リンクプロトコル。さらに、さまざまな表面分子の発現は、フレッチャープロトコルに比べて現在のプロトコルで増強された。消化法におけるこれらの差異は、リンパ節間質細胞研究6,19,21においてわずかに異なる発現パターンの理由かもしれない。それが原因各プロトコルの利点の異なる消化プロトコルをテストするために役に立つかもしれません。フレッチャープロトコルは転写解析のための実行可能な細胞の高い数値を単離するために有用であるかもしれないが(マルホトラ 7に掲載されるように)現在のプロトコルは、表面発現解析のためのより良いかもしれません。したがって、すべての3つの消化プロトコルを比較するリンパ節間質細胞の単離後に最適な結果を得るために重要であり得ると相補的であると見なされるべきである。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

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References

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ネズミリンパ節間質細胞の単離
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Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

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