Introduction
Os linfonodos são compartimentos especializados onde as respostas imunes adaptativas contra-antígenos próprios estrangeiros e são iniciadas e coordenadas. O processo aqui apresentado descreve uma digestão enzimática curto combinado com pipetagem automatizada mecânica para obter linfonodo suspensão de células individuais e obter acesso às células viáveis do estroma de nódulos linfáticos, que mantêm a expressão de várias moléculas da superfície.
Formar células do estroma linfonodo cadafalso do linfonodo e cumprir três funções principais: primeiro eles filtram líquidos do corpo para provar antígenos, patógenos e sua patógeno padrão molecular associado (PAMPs), bem como as citocinas e perigo associado padrão molecular (amortece) presente no corpo. Em segundo lugar, eles atraem e instruir as células apresentadoras de antígenos (APC) e linfócitos para interagir e iniciar respostas imunes adaptativas; e em terceiro lugar, que proporcionam um ambiente estrutural para a homeostase e diferenciação dos linfócitos 1-3. Durante a inflamação células do linfonodo estromais produzem fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, adaptar-se, assim, o inchaço organizar a interação entre células dendríticas (DCs), T e células B. A orquestração das respostas imunitárias só é possível devido a arquitectura estrutural complexo formado por diferentes populações de células do estroma.
As células do estroma de nódulos linfáticos são células CD45 negativas e pode ser distinguida da expressão de CD31 ou gp38 em células fibroblásticas e endoteliais 1 -6. GP38 + CD31 - define as células da zona T reticulares (TRC, também conhecidos como FRC: células fibroblásticas reticulares), gp38 + CD31 + define células endoteliais linfáticas (LEC), gp38 - CD31 + define as células endoteliais do sangue (BEC). Além disso, a caracterização das subpopulações revelou a existência de outras células do estroma de nódulos linfáticos. De facto, uma pequena população de células-pericyte como foi caracterizado nagp38 - CD31 - população 7. Portanto, a adaptação do procedimento de isolamento é vantajosa para a identificação e caracterização das propriedades funcionais diferentes de células do estroma de nódulos linfáticos.
Antes do desenvolvimento de linfonodo células estromais digestão protocolos que o estudo de células estromais de linfonodos foi limitado a observações in situ usando secção de tecido e microscopia. No entanto, estudos estruturais e funcionais apresentaram características importantes de células estromais de linfonodos. As células do estroma de nódulos linfáticos são associados com podoplanina, colagénio e proteínas (ECM) de matriz extracelular de modo a formar uma estrutura tridimensional complexa 3 chamado sistema de conduta, a qual transporta as proteínas linfáticas e massa molecular associada menor do seio subcapsular do nó de linfa para o alto endotélio vênulas na zona de células T 8. DCs estão em contato com células do estroma e pode ser observado saliente no con tubularestrutura duit a amostra de fluido e detectar antigénios 8. A interação das células do estroma dos nódulos linfáticos (TRCs e LECs) com DCs é mediada pela liberação e apresentação das quimiocinas CCL21 e CCL19 9,10. CCL19 e CCL21 são reconhecidos pelo receptor CCR7 facilitar DCs e as células T migrem para a zona das células T linfonodo 4,11. Apesar de usar quimiocinas semelhantes, as células T e DCs têm diferentes rotas de migração para os linfonodos 12. Mais tarde, utilizando a digestão enzimática do nódulo linfático e isolamento de células do estroma de nódulos linfáticos puros, estudos funcionais foram realizados sobre o papel dos diferentes células do linfonodo estroma e a sua capacidade para interagir com DC e células T / B 6,13. Em primeiro lugar, a interferência entre as células produtoras de IFN-T efectoras e células estromais γ nódulos linfáticos induz a produção do óxido nítrico metabolito mostrado para amortecer as respostas das células T e a proliferação dos órgãos linfóides secundários 14-16. Em segundo lugar, n linfaAs células do estroma ode ter sido relatado para suportar a diferenciação de subconjuntos de DC de regulação através da produção de IL-10, 17, e para modular a homeostase da célula T ingénuos através da produção de IL-7 6,18. Em terceiro lugar, a expressão de TLR em células do estroma de nódulos linfáticos sugerem que as células do estroma são susceptíveis ao sinal obtido a partir de uma infecção ou de auto-moléculas libertado durante a lesão de tecidos. De facto, o tratamento de células do estroma de nódulos linfáticos com o ligando de TLR3 de poli (I: C) induz uma regulação positiva modesta de grande expressão de histocompatibilidade classe I e complexa regulação positiva da molécula co-inibidor PD-L1, mas não das moléculas de co-estimulação, resultando em mudanças dramáticas no tecido periférico antígenos expressão 19. Diversos grupos têm apontado células do estroma dos nódulos linfáticos expressar antígenos de tecidos periféricos e induzir tolerância das células T auto-reactivas 19,21-27. Portanto, a compreensão das interacções entre células do estroma dos nódulos linfáticos e outro re migratório ecélulas do linfonodo sident vai ajudar a encontrar novas moléculas alvo para permitir a ativação ou supressão de respostas imunes durante a inflamação. Portanto, é necessária a implementação da separação enzimática publicado do linfonodo.
Protocolos previamente publicados usar diferentes combinações de digestão enzimática à base de colagenase com baixo esforço mecânico 6,19,20. No entanto, longas incubações com enzimas da digestão ou a combinação de diferentes tipos de enzima de digestão pode prejudicar várias moléculas de superfície necessárias para analisar o status de ativação e identificar novas células estromais de linfonodos. Dependendo do tipo de análise de células do estroma, o protocolo de ligação ou Fletcher protocolo pode ser mais adequado. No processo descrito, de uma digestão enzimática ligeiramente mais curto é combinado com a desagregação mecânica automatizado para minimizar a degradação da superfície marcador linfáticos viável células estromais nó. Este procedimento permite que o isolamento altamente reprodutível edistinção de nódulos linfáticos de populações de células do estroma com uma baixa variabilidade e de mais do que 95% de viabilidade. As células do estroma de nódulos linfáticos isolados de fresco pode ser usado directamente para a expressão do marcador de superfície, a análise de proteínas, e estudos de transcrição, bem como o estabelecimento de linhas de células estromais de realizar os ensaios funcionais in vitro.
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Protocol
Nesta publicação de vídeo e protocolo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovados pela Autoridade Cantonal Basel-Stadt, Suíça.
1. Linfonodos Preparação e Digestão
- Pré-aquecimento de água num copo a 37 ° C num agitador magnético com placa de aquecimento.
- Prepare médio básico como se segue: DMEM (sem piruvato) suplementado com 2% de FCS, 1,2 mM CaCl2 e Pen / Strep (100 unidades de penicilina, 100 ug de estreptomicina).
- Esterilizar todos os instrumentos de dissecção antes do uso.
- Eutanásia camundongos linfonodo doadores por asfixia com CO2 e assepticamente dissecar os gânglios linfáticos. Não dissecar a gordura ao redor. NOTA: Este protocolo é otimizado para o nó periférico de drenagem linfática da pele (inguinal, braquial, axilar).
- Coloque gânglios linfáticos em uma placa de Petri esterilizada, contendo 2 ml de meio de base de gelo frio.
- Interromper o linfonodo capsule usando duas agulhas 25 G fixos em 1 ml seringa.
- Transferir o tecido de linfonodos interrompido num tubo de polipropileno de 5 ml de fundo redondo contendo 750 ul meio básico complementado com 1 mg / ml de colagenase IV, e 40 ug / ml de ADNase I.
- Adicionar um agitador magnético estéril em cada tubo.
- Colocar o tubo no recipiente com 37 ° C pré-aquecido de água e agita-se os tubos a uma velocidade lenta (1 volta / seg) durante 30 min.
- Remover o tubo do agitador magnético com placa de aquecimento e deixar fragmentos de linfonodos resolver.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante enriquecido em "células não-estromal". NOTA: Se a análise de T, B, células dendríticas e CD45 - gp38 - CD31 - está prevista, salvar a fração "células não-estromais".
- Lavar o tecido restante linfonodo uma vez com 750 ul meio básico. NOTA: Esta etapa é necessária somente se a trabalhar com camundongos imunocompetentes.
- Vamos fragmentos de linfonodos resolver.
- Remover ofracção flutuante de células não-estromal.
- Adicionar aos fragmentos de nódulos linfáticos meio básico de 750 ul suplementadas com 3,5 mg / ml de colagenase D e 40 ug / ml de ADNase I.
- Colocar o tubo de volta na taça que contém a 37 ° C pré-aquecido a água.
- Digerir o tecido do linfonodo para 5 min, enquanto lentamente mexendo.
- Linfáticos fragmentos de tecido nó desagregados por pipetagem e misturando 700 mL para 10 ciclos em máxima velocidade usando uma pipeta multicanal automatizada. NOTA: Isso atrapalha linfonodo para melhorar a digestão.
- Colocar o tubo de volta no recipiente com água a 37 ° C pré-aquecido.
- Fragmentos de tecidos de linfonodo Digest para mais 10 min, enquanto lentamente agitação.
- Desagregar fragmentos de tecidos de nódulos linfáticos por pipetagem e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada.
- Adicionar 7,5 mL de 0,5 M de EDTA para garantir a manutenção da suspensão de célula única.
- Fragmentos de tecidos de linfonodo desagregados por tubotting e mistura por 99 ciclos a velocidade máxima utilizando uma pipeta multicanal automatizada.
- Adicionar meio básico de 750 ul e as células passam através de uma malha de nylon de 70 ^ m.
- Centrifugar a suspensão de células de 5 min a 1500 xg, 4 ° C.
- As células do estroma pode ser agora usado para posterior análise.
2 Coloração de Linfonodo células estromais
- Use uma combinação de anti-CD45, anti-podoplanina (gp38), os anticorpos anti-CD31 para reconhecer com sucesso células TRC, LEC, BEC e DN.
- Incubar o tecido linfático nó digerido com vivo inoperante rastreador /, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) em 100 uL de HBSS contendo 2 % FCS para, pelo menos, 20 min, 4 ° C, no escuro.
- Lave as células adicionando 500 l de HBSS contendo 2% de FCS
- Centrifugar a suspensão de células a 3 minutos a 1500 xg, 4 ° C.
- Re-suspender em 100 uL de HBSS contendo 2% de FCS.
- Executar as células marcadas num citómetro de fluxo equed, com as seguintes óptica: fonte de excitação com até três lasers: azul (488 nm, arrefecido a ar, de 20 mW de estado sólido), vermelho (633 nm, 17 mW HeNe), e violeta (405 nm, 30 mW de estado sólido) .
- Portão de CD45 - células para excluir as células hematopoiéticas.
- Singlets Portão (FSC-W) e de células vivas (VIVO / rastreador DEAD) para excluir doublets e células mortas.
- Plot gp38 contra CD31 para visualizar TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) células (ver Figura 1) e DN (gp38 - - CD31).
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Representative Results
O presente protocolo é um protocolo de digestão modificada publicada por ligação et al., 2007 6 com um menor tempo de digestão (45 minutos no máximo), devido à desagregação mecânica com uma pipeta multicanal automatizado. Além disso, o processo é mais padronizado, minimiza a degradação de marcadores de superfície em diferentes células do estroma de nódulos linfáticos e permite a manipulação de mais de uma amostra ao mesmo tempo.
Colagenase IV e colagenase D em links de protocolo 6 e protocolo atual ou colagenase P e Dispase em protocolo Fletchers 13 manter linfonodo estromal viabilidade das células e poupar a digestão de vários marcadores de superfície, incluindo CD45, gp38 e CD31. Para testar os nós de protocolo, axilar, braquial e linfáticos inguinal atuais foram removidos e digerido para isolar suas células estromais. Análise de CD45, gp38 e CD31 demonstraram a presença de expressão de TRC, LEC, BEC e DN células isoladas a partir de ratinhos C57BL / 6 mgelo (Figura 1, a estratégia de gating).
O esforço mecânico pode reduzir a viabilidade das células linfáticas nó do estroma durante a digestão. Comparando-se a viabilidade de subpopulações isoladas de células do estroma, utilizando os três protocolos diferentes, verificou-se que a viabilidade foi superior a 95% no protocolo de Fletcher, mas inferior para o protocolo atual e protocolo Link (Figura 2A), embora o protocolo atual show melhor sobrevivência na subpopulação BEC então Link protocolo. O número total de células recuperado pós digestão do linfonodo subpopulações de células do estroma foi ligeiramente superior no protocolo atual em relação ao protocolo Link e protocolo Fletcher (Figura 2A). Estes resultados demonstram que o protocolo atual mantém a viabilidade das células estromais de linfonodos semelhantes aos protocolos publicados. As principais diferenças entre os três protocolos estão listados na Tabela 1.
Marcadores de superfície de um re necessária para caracterizar linfáticos células estromais nó por citometria de fluxo e isolá-las por separação de células. TRCs e LEC isolado via atual, os protocolos de ligação e Fletcher foram comparados por IA b, CD140a, CD80, PD-L1 e expressão de CD40. Após isolar células do estroma por todos os três protocolos, encontramos a expressão de IA b, CD80, CD140a, PD-L1, e CD40 foi maior após a digestão com CP e LP em ambos os TRCs e LEC (Figura 2B). Estes resultados sugerem que a degradação de algumas moléculas da superfície com colagenase IV e D são menos forte do que com colagenase e Dispase P.
Tomados em conjunto, o protocolo atual inclui um curto digestão combinado com desagregação mecânica automatizada para minimizar a superfície marcador degradação dos linfáticos viável células estromais nó.
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Figura 1 nós TRC, as células LEC, BEC, e DN coloração, gating, e quantificação. Linfáticos de camundongos C57BL / 6 foram digeridos seguindo o protocolo atual e corados com CD45, gp38 e CD31, Live / Dead to definir TRC, LEC, BEC e DN células por citometria de fluxo. Os dados mostram resultados representativos da coloração. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
Figura 2 Viabilidade e superfície expressão do marcador de células estromais de linfonodos. Linfonodos de camundongos C57BL / 6 foram digeridos após a atual (PB), do protocolo de Fletcher (FP) e corados com CD45, gp38 e CD31 (LP) Link e definir TRC, LEC, BEC e DN células por citometria de fluxo. A) Viabildade e número total de células de todos os subpopulações de células dos linfonodos estromal após coloração Live / Dead (n ≥ 5, dados agrupados de dois experimentos independentes, barras representam SEM). B) Análise de expressão de superfície de IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) e CD40 (PE-Cy7) em TRCs e LEC (n = 6 para FP e n = 11 para LP e CP , dados agrupados de dois experimentos independentes, barras representam SEM). Geométricas das IFM valores auto-fluorescência para LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Clique aqui para ver a imagem ampliada.
| Atual Protocol-Enzimas | Protocolo atual | Protocolo de Ligação de enzimas | Protocolo de ligação | FLetcher Protocolo de enzimas | -Protocolo Fletcher |
| Colagenase IV, DNase I | 30 min, 37 ° C, sob agitação | Colagenase IV, DNAse I | 30 min, 37 ° C | Colagenase P, Dispase, DNAse I | 20 min, 37 ° C, 5 min cada inverter |
| Colagenase D, Dnase I | 5 min, 37 ° C, sob agitação, ressuspender | Colagenase D, DNAse I | 20 min, 37 ° C | Colagenase P, Dispase, DNAse I | 10 min, 37 ° C, 30 seg ressuspender |
| 10 min, 37 ° C, sob agitação | Colagenase D, DNAse I | 37 ° C, ressuspender a cada 10 minutos até que a digestão completa | Colagenase P, Dispase, DNAse I | 37 ° C, ressuspender a cada 5 min, até a digestão completa | |
| ressuspensão mecânico automatizado |
Tabela 1. resumos curtos de CP, LP, enzimas PF usado e protocolos.
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Discussion
O estudo das células do estroma dos nódulos linfáticos recentemente tornou-se um foco de investigação devido ao desenvolvimento de dois protocolos de digestão publicados 6,13. Ambos os protocolos são adequados para obter único nó de linfa de células estromais, mas diferem na utilização de enzimas de digestão e tempo de digestão. Uma vez que as células estromais e seus marcadores de superfície são sensíveis à digestão enzimática e tensão mecânica, um protocolo optimizado é necessária.
O isolamento das células do nódulo linfático do estroma viáveis de linfonodo recentemente dissecados é o primeiro passo para executar fenotípica e análise funcional. Portanto, é importante para digerir cuidadosamente com a concentração definida de enzimas, a uma temperatura estável e durante o tempo indicado. Dois protocolos de digestão foram descritos 6,13, no entanto, com os passos de digestão relativamente longos. Para reduzir o tempo de digestão, a desagregação mecânica foi incluida e padronizados utilizando uma pipeta multicanal. Em e das vantagens do protocolo actual é que ele permite o isolamento de células do estroma, em apenas 45 minutos, minimizando assim o seu tempo de incubação com as enzimas de digestão. Além disso, sob agitação constante durante a digestão permite o acesso óptimo das enzimas de digestão para a estrutura de nó de linfa. Além disso, o volume foi reduzido a digestão de 750 ul minimizando a quantidade de enzima utilizada.
Força mecânica excessiva perturba junções apertadas, mas pode causar a morte de células ao mesmo tempo. Por esta razão, nós testamos várias combinações de ciclos de re-suspensão e diferentes dispositivos de dissociação. Nós descobrimos que a utilização de uma pipeta de canais múltiplos automatizado permite a dissociação em 2 aplicações de 99 ciclos; aplicar uma pressão constante para as células e isto resultará em suspensão de células individuais, com a viabilidade óptima. Quatro a seis amostras pode ser misturada e pipetada, ao mesmo tempo, reduzir o tempo do nó de linfa de isolamento de células do estroma.
EOR "> O protocolo de digestão tem de manter a expressão na superfície de quase todas as moléculas;. somente desta maneira concomitante com a coloração de vários marcadores podem revelar se uma população homogénea ou heterogénea, por exemplo, o uso de BP-3 e CD35 na TRC gp38 + CD31 -. permite a visualização e isolamento de medular TRC (Sanjiv Luther, comunicação pessoal) Além disso, a fracção de DN mal caracterizados foi ainda caracterizado como contendo células Aire + e pericitos, como células positivas para a integrina α7 (revisto em 7, 13). Portanto, o presente protocolo foi comparado aos publicados. Conforme mostrado nos resultados, frequências e de números de células estromais de linfonodos semelhantes foram obtidos com o protocolo atual em comparação com os publicados. Curiosamente, a frequência eo número de isolados TRC Foram mais alto usando o protocolo Fletcher sugerindo uma melhor dissociação das estruturas TRC que no protocolo atual eProtocolo Link. Além disso, a expressão de várias moléculas de superfície foi reforçada com o protocolo atual em relação ao protocolo de Fletcher. Estas diferenças no método de digestão pode ser a razão para um pouco diferentes padrões de expressão nos estudos com células do estroma dos nódulos linfáticos 6,19,21. Pode ser útil para testar diferentes protocolos de digestão, por causa das vantagens de cada protocolo. O protocolo de corrente pode ser melhor para a análise da expressão de superfície, enquanto que o protocolo Fletcher pode ser útil para o isolamento de um elevado número de células viáveis para análises de transcrição (tal como publicado em Malhotra et al. 7). Portanto comparando os três protocolos de digestão pode ser importante para obter os melhores resultados após o isolamento de células do estroma dos nódulos linfáticos e devem ser vistas como complementares.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
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