Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering av murint Lymph Node stromaceller

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfkörtlar är specialiserade fack där adaptiva immunsvar mot utländska och självantigener initieras och samordnas. Det förfarande som presenteras här beskriver en kort enzymatisk spjälkning kombinerat med automatiserad mekanisk pipettering att få lymfkörtel enda cell fjädring och få tillgång till livskraftiga lymfkörtel stromaceller som upprätthåller ytan uttryck för flera molekyler.

Lymfkörtel stromal cell bildar ställningen i lymfkörteln och uppfylla tre viktiga funktioner: först de filtrerar kroppsvätskor att prova antigener, patogener och deras patogen associerade molekylära mönster (PAMPs) samt cytokiner och fara molekylära mönster (dämpas) före i kroppen. För det andra, de locka och instruera antigenpresenterande celler (APC) och lymfocyter att interagera och initiera adaptiva immunsvar; och tredje, de ger en strukturell miljö för homeostas och differentiering av lymfocyter en-3. Under inflammations lymfkörtel stromala celler producerar tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner, anpassa sig till svullnad därigenom anordna interaktionen mellan dendritiska celler (DC), T-och B-celler. Orkestreringen av immunresponser är endast möjlig på grund av den komplexa strukturella arkitektur bestående av olika stromala cellpopulationer.

Lymfkörtel stromaceller är CD45 negativa celler och kan särskiljas genom uttrycket av CD31 eller gp38 i fibroblastiska och endotelceller 1 -6. Gp38 + CD31 - definierar T zon retikulära celler (TRC, även känd som FRC: fibroblastiska retikulära celler), gp38 + CD31 + definierar lymfatiska endotelceller (LEC), gp38 - CD31 + definierar blod endotelceller (BEC). Vidare karakterisering av delpopulationer avslöjade förekomsten av andra lymfkörtel stromaceller. I själva verket var en liten pericyte liknande cellpopulation känne inomgp38 - CD31 - befolkningen 7. Därför är anpassning av isoleringsförfarandet fördelaktig för identifiering och karakterisering av de funktionella egenskaperna hos olika lymfkörtel stromaceller.

Innan utvecklingen av lymfkörtel stromaceller matsmältningen protokoll studiet av lymfkörtel stromaceller var begränsad till in situ-observationer med hjälp av vävnadssnitt och mikroskopi. Icke desto mindre, strukturella och funktionella studier visade viktiga egenskaper hos lymfkörtel stromaceller. Lymph node stromaceller är associerade med podoplanin, kollagen och extracellulär matrix (ECM)-proteiner för att bilda ett komplex 3 dimensionell struktur som kallas ledningssystem, som transporterar lymfa och tillhörande lägsta molekylmass proteiner från subkapsulär sinus av lymfkörteln till den höga endotel venoler i T-celler zon 8. DCs är i nära kontakt med stromaceller och kan observeras skjuter in i rörformiga conduit struktur för att prova vätska och upptäcka antigener 8. Samspelet mellan lymfkörtel stromaceller (TRCs och LECS) med DC förmedlas genom frisättning och presentation av kemokiner CCL21 och CCL19 9,10. CCL19 och CCL21 känns igen av CCR7 receptorn underlättar DCs och T-celler att migrera till lymfkörtel T-cellzonen 4,11. Trots att använda liknande kemokiner, DCs och T-celler har olika vandringsvägar i lymfkörtlarna 12. Senare, med hjälp av enzymatisk nedbrytning av lymfkörteln och isolering av rena lymfkörtel stromaceller, var funktionella studier utförts på den roll de olika lymfkörtel stromaceller och deras förmåga att interagera med DCs och T / B-celler 6,13. Först överhörningen mellan IFN-γ producerande effektor-T-celler och lymfkörtel stromaceller inducerar produktionen av metaboliten kväveoxid visat att dämpa T-cellssvar och proliferation i de sekundära lymfoida organ 14-16. För det andra, lymfa node stromaceller har rapporterats att stödja differentiering av reglerande DC delmängder via produktionen av IL-10 17, och för att modulera naiv T-cell homeostas via produktionen av IL-7 6,18. För det tredje föreslår TLR uttryck i lymfkörtel stromaceller att stromalceller är känsliga för signalen kommer från en infektion eller själv molekyler frigörs vid vävnadsskada. Faktiskt, behandling av lymfkörtel stromaceller med liganden av TLR3 poly (I: C) inducerar en måttlig uppreglering av MHC klass I-expression och uppreglering av sam-inhiberande molekyl PD-L1, men inte av samstimulerande molekyler, vilket resulterar i dramatiska förändringar i perifer vävnad antigener uttryck 19. Flera grupper har visat lymfkörtel stromaceller uttrycker perifera vävnadsantigener och inducera tolerans av självreaktiva T-celler 19,21-27. Därför att förstå samspelet mellan lymfkörtel stromaceller och andra flyttande och reSident lymfnodceller hjälper att hitta nya målmolekyler för att tillåta aktivering eller undertryckande av immunsvar vid inflammation. Därför behövs för genomförandet av den publicerade enzymatisk separation av lymfkörteln.

Tidigare publicerade protokoll använder olika kombinationer av kollagenas-baserad enzymatisk spjälkning med låg mekanisk påkänning 6,19,20. Dock kan långa inkubationer med matsmältningen enzymer eller olika kombinationer av matsmältningen enzym försämra olika ytmolekyler krävs för att analysera aktiveringsstatus och att identifiera nya lymfkörtel stromaceller. Beroende på vilken typ av analys för stromacells-, kanske Länkprotokoll eller Fletcher protokoll vara mer lämpade. I det beskrivna förfarandet, är en något kortare enzymatisk nedbrytning kombinerat med automatiserad mekanisk disaggregering att minimera ytmarkör nedbrytningen av viabelt lymfkörtel stromaceller. Detta förfarande möjliggör mycket reproducerbar isolering ochskillnaden av lymfkörtel stromala cellpopulationer med låg variabilitet och mer än 95% viabilitet. De nyisolerade lymfkörtel stromaceller kan direkt användas för ytmarkör expression, proteinanalys, och transkriptionella studier samt etablering av stromala cellinjer att utföra funktionella analyser in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den här videon publikation och protokoll, alla djurförsök utförs i enlighet med djur protokollet godkänts av kantonala myndigheten Basel-Stadt, Schweiz.

1 lymfkörtlar Förberedelser och Digestion

  1. Värm vatten i en bägare till 37 ° C på en magnetomrörare med värmeplatta.
  2. Förbered Basic Medium enligt följande: DMEM-medium (utan pyruvat) kompletterat med 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 och Pen / Strep (100 enheter penicillin, 100 | ig streptomycin).
  3. Sterilisera alla dissektion instrument före användning.
  4. Euthanize lymfkörtel donatormöss per CO2 kvävning och aseptiskt dissekera lymfkörtlarna. Inte dissekera den omgivande fett. OBS: Detta protokoll är optimerat för perifer hud-dränerande lymfkörteln (ljumskbråck, brachialis, armhålan).
  5. Placera lymfkörtlar i en steril petriskål innehållande 2 ml iskall basiskt medium.
  6. Störa lymfkörteln capsule med två 25 G nålar fästa på 1 ml spruta.
  7. Överför den störde lymfkörtelvävnad i en 5 ml polypropylen rundbottnad rör innehållande 750 | il basmedium kompletterat med 1 mg / ml kollagenas IV och 40 ^ g / ml DNAse I.
  8. Lägg en steril magnetisk omrörare i varje rör.
  9. Placera röret i bägaren med 37 ° C förvärmd vatten och rör om rören i långsam takt (1 v / s) i 30 min.
  10. Ta bort röret från den magnetiska omröraren med värmeplattan och låt lymfkörtelfragment lösa.
  11. Ta försiktigt bort supernatanten anrikat på "icke-stromal cell". OBS: Om analysen av T, B, dendritiska celler och CD45 - gp38 - CD31 - planeras, spara "icke-stromaceller" fraktionen.
  12. Tvätta återstående lymfkörtelvävnad gång med 750 ul basiskt medium. OBS: Detta steg är nödvändigt bara om att arbeta med immun-kompetenta möss.
  13. Låt lymfkörtelfragment lösa.
  14. Ta borticke-stromal flytande fraktion.
  15. Lägg till lymfkörtel fragmenten 750 l basiskt medium kompletterat med 3,5 mg / ml kollagenas D och 40 mikrogram / ml DNas I.
  16. Placera röret tillbaka i bägaren innehållande 37 ° C förvärmd vatten.
  17. Matsmältning lymfkörtelvävnad under 5 minuter under långsam omröring.
  18. Dela upp lymfkörtel vävnad fragment genom pipettering och blanda 700 pl i 10 cykler vid maximal hastighet med hjälp av en automatiserad flerkanalspipett. OBS: Detta stör lymfkörtelvävnad för att förbättra matsmältningen.
  19. Placera röret tillbaka i bägaren med 37 ° C förvärmt vatten.
  20. Digest lymfkörtel vävnadsfragment i ytterligare 10 min under långsam omröring.
  21. Dela upp lymfkörtel vävnad fragment genom pipettering och blandning under 99 cykler vid maximal hastighet med hjälp av en automatiserad flerkanalspipett.
  22. Lägg 7,5 pl av 0,5 M EDTA för att säkerställa upprätthållande av enkelcellsuspension.
  23. Dela upp lymfkörtel vävnad fragment genom röretmma och blandning under 99 cykler vid maximal hastighet med hjälp av en automatiserad flerkanalspipett.
  24. Lägg 750 l basiskt medium och passera celler genom en 70 pm nylonnät.
  25. Centrifugera cellsuspensionen 5 min vid 1500 xg, 4 ° C.
  26. Stromaceller kan nu användas för vidare analys.

2 Färgning av lymfkörtel stromaceller

  1. Använd en kombination av anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31-antikroppar för att framgångsrikt identifiera TRC, LEC, BEC och DN-celler.
  2. Inkubera rötas lymfkörtelvävnad med Live / Dead tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) i 100 ^ HBSS innehållande 2 % FCS i minst 20 min, 4 ° C, i mörker.
  3. Tvätta cellerna lägga 500 l av HBSS innehållande 2% FCS
  4. Centrifugera cellsuspensionen 3 min vid 1500 xg, 4 ° C.
  5. Återsuspendera i 100 pl av HBSS innehållande 2% FCS.
  6. Kör de färgade cellerna i en flödescytometer equipped med följande optik: excitationskälla med upp till tre lasrar: blå (488 nm, luftkyld, 20 mW solid state), röd (633 nm, 17 mW HeNe), och violett (405 nm, 30 mW solid state) .
  7. Gate CD45 - celler att utesluta hematopoietiska celler.
  8. Gate sing (FSC-W) och levande celler (LIVE / DEAD tracker) att utesluta dubbletter och döda celler.
  9. Plot gp38 kontra CD31 att visualisera TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) och DN (gp38 - CD31 -)-celler (se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det nuvarande protokollet är en modifierad matsmältningen protokoll publicerats av et al. Link, 2007 6 med kortare koktiden (45 min max) på grund av mekaniska uppdelning med en automatiserad multikanalpipett. Dessutom är förfarandet mer standardiserade, minimerar nedbrytning av ytmarkörer på olika lymfkörtel stromaceller och tillåter hantering av mer än ett prov vid samma tidpunkt.

Kollagenas IV och kollagenas D i Links protokoll 6 och aktuellt protokoll eller kollagenas P och dispas i Fletchers protokoll 13 upprätthålla lymfkörtel stromal celler livskraft och skona rötning av flera ytmarkörer inklusive CD45, gp38 och CD31. För att testa det nuvarande protokollet, armhålan, brachialis och ljumsk lymfkörtlar togs bort och rötas för att isolera sina stromaceller. Analys av CD45, gp38 och CD31 uttryck påvisat TRC, LEC, BEC och DN celler isolerade från C57BL / 6 mis (Figur 1, grindstrategi).

Mekanisk belastning kan minska under matsmältningen livskraft lymfkörteln stromaceller. Jämföra livskraft isolerade subpopulationer av stromaceller med hjälp av tre olika protokoll, visade det sig att lönsamheten var högre än 95% i Fletcher-protokollet, men lägre för både Aktuellt protokoll och Link-protokollet (Figur 2A), även om nuvarande protokollet visar bättre överlevnad i BEC subpopulation Länka sedan protokollet. Återhämtade Den totala celler antal inlägg nedbrytning av lymfkörtel stromal cellundergrupper var något högre i Current protokoll jämfört med Link-protokoll och Fletcher-protokoll (Figur 2A). Dessa resultat visar att det nuvarande protokollet behåller livskraft lymfkörtel stromaceller liknar publicerade protokoll. De stora skillnaderna mellan de tre protokollen anges i tabell 1.

Ytmarkörer a re krävs för att karakterisera lymfkörtel stromaceller med flödescytometri och för att isolera dem genom cellsortering. TRCs och LECS isolerad via Current, Link och Fletcher protokoll jämfördes för IA b, CD140a, CD80, PD-L1 och CD40 uttryck. Efter isolering stromalceller av alla tre protokoll, hittade vi ett uttryck för IA b, CD80, CD140a, PD-L1 och CD40 var högre efter uppslutning med CP och LP i både TRCs och LECS (Figur 2B). Dessa resultat tyder på att nedbrytningen av vissa ytmolekyler med kollagenas IV och D är mindre stark än med kollagenas P och Dispase.

Sammantaget omfattar det nuvarande protokollet en kort uppslutning i kombination med automatiserad mekanisk uppdelning för att minimera ytmarkör nedbrytning av livskraftiga lymfkörtel stromaceller.

"/>
Figur 1 TRC, LEC, BEC, och DN-celler färgning, grind och kvantifiering. Lymfkörtlar från C57BL / 6 möss klövs efter det nuvarande protokollet och färgas med CD45, gp38 och CD31, Live / Dead definiera TRC, LEC, BEC, och DN-celler med flödescytometri. Data visar representativa resultat av färgning. Klicka här för att se en större bild.

Figur 2
Figur 2 livskraft och ytmarkör uttryck för lymfkörtel stromaceller. Lymfkörtlar från C57BL / 6 möss klövs efter Ström (CP), Links (LP) och Fletcher protokoll (FP) och färgades med CD45, gp38 och CD31 för att definiera TRC, LEC, BEC och DN celler med flödescytometri. A) Viabilhet och totalt cell antalet alla lymfkörtel stromal cell subpopulationer efter Live / Dead färgning (n ≥ 5, sammanslagna data från två oberoende experiment, barer representerar SEM). B) Analys av ytan uttryck för IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) och CD40 (PE-Cy7) på TRCs och LECS (n = 6 för FP och n = 11 för LP och CP , sammanslagna data från två oberoende experiment, barer representerar SEM). Geometriska MFI autofluorescensvärden för LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Klicka här för att se en större bild.

Aktuell protokoll-enzymer Ström-protokoll Link Protocol-enzymer Link-protokoll FLetcher Protocol-enzymer Fletcher-protokoll
Kollagenas IV, Dnase I 30 min, 37 ° C, under omröring Kollagenas IV, DNAse I 30 min, 37 ° C Kollagenas P, Dispase, DNAse I 20 min, 37 ° C, invertera varje 5 min
Kollagenas D, Dnase I 5 min, 37 ° C, under omröring, resuspendera Kollagenas D, DNAse I 20 min, 37 ° C Kollagenas P, Dispase, DNAse I 10 min, 37 ° C, återsuspendera 30 sek
10 min, 37 ° C, under omröring Kollagenas D, DNAse I 37 ° C, återsuspendera varje 10 min tills fullständig digestion Kollagenas P, Dispase, DNAse I 37 ° C, resuspendera var 5 min tills fullständig nedbrytning
automatiserad mekanisk resuspension

Tabell 1. Korta sammanfattningar av CP, LP, FP enzymer som används och protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Studien av lymfkörtel stromaceller nyligen blev ett forskningsfokus på grund av utvecklingen av två publicerade matsmältning protokoll 6,13. Båda protokollen är tillräckliga för att få enstaka lymfkörtel stromaceller men skiljer sig i användningen av rötnings enzymer och tiden för matsmältningen. Eftersom stromaceller och deras ytmarkörer är känsliga för enzymatisk nedbrytning och mekanisk påverkan, är ett optimerat protokoll som krävs.

Isoleringen av viabla lymfkörtel stromaceller från nyligen dissekeras lymfkörtel är det första steget för att utföra fenotypiska och funktionella analyser. Därför är det viktigt att noga smälta med den definierade koncentrationen av enzym, vid en stabil temperatur och under den angivna tiden. Två rötnings protokoll har beskrivits 6,13, dock med ganska långa rötningssteg. För att minska tiden för matsmältningen, var mekanisk uppdelning ingår och standardiserats med hjälp av en flerkanalspipett. På e av fördelarna med det nuvarande protokollet är att det tillåter isolering av stromaceller i bara 45 min, alltså minska deras inkubationstid med matsmältningen enzymer. Dessutom konstant omrörning under uppslutning tillåter optimal tillgång av de uppslutnings enzymer till lymfkörteln strukturen. Vidare konsuppslutningsvolymen minskas till 750 | il minimera den mängd enzym som används.

Överdriven mekanisk kraft stör tight junctions men kan orsaka celldöd samtidigt. Därför testade vi flera kombinationer av återfjädringscykler och olika dissociation heter. Vi fann att användningen av en automatiserad flerkanalspipett medger dissociationen inom två tillämpningar av 99 cykler; applicera ett konstant tryck till cellerna och detta kommer att resultera i enkelcellsuspension med optimal lönsamhet. Fyra till sex prover kan blandas och pipetteras samtidigt minska tiden för lymfkörtel stromal cellisolering.

ontent "> The matsmältningen protokollet måste bibehålla ytans uttryck för nästan alla molekyler;. endast på detta sätt samtidig färgning med flera markörer kan avslöja om en befolkning är homogen eller heterogen Exempelvis användningen av BP-3 och CD35 i TRC gp38 + CD31 -. möjliggör visualisering och isolering av medullär TRC (Sanjiv Luther, personlig kommunikation) Dessutom dåligt karaktäriserade DN fraktionen vidare karaktäriseras som innehåller Aire + celler och pericyte liknande celler positiva för grin α7 (över 7, 13). Därför var det nuvarande protokollet jämfört med de publicerade. Som framgår av resultaten, liknande frekvenser och nummer för lymfkörtel stromaceller erhölls med det nuvarande protokollet jämfört med de publicerade. Intressant, frekvens och antal isolerade TRC var högst använder Fletcher protokoll tyder på en bättre dissociation av TRC strukturer än i det nuvarande protokollet ochLänk-protokollet. Dessutom var ett uttryck för olika ytmolekyler förstärkt med det nuvarande protokollet jämfört med Fletcher-protokollet. Dessa skillnader i matsmältningen metoden kan vara orsaken till något olika uttrycksmönster i lymfkörtel stromal cellstudier 6,19,21. Det kan vara bra att testa olika rötningsprotokoll på grund av fördelarna med varje protokoll. Det nuvarande protokollet kan vara bättre för ytan expressionsanalys, medan Fletcher-protokollet kan vara användbara för isolering av höga antalet livskraftiga celler för transkriptionsanalys (som publicerats i Malhotra et al. 7). Därför jämföra alla tre rötningsprotokoll kan vara viktigt att få optimala resultat efter isolering av lymfkörtel stromaceller och bör ses som ett komplement.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
Isolering av murint Lymph Node stromaceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter