Introduction
La disfunzione olfattiva è legata a una serie di malattie neurodegenerative tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer e il morbo di Huntington 1. Nel PD, menomazioni olfattive comprendono deficit di identificazione odore, la rilevazione e la discriminazione e si trovano in fino al 70-95% dei pazienti 2-5. Questi deficit possono precedere i sintomi motori cardinale di PD fino a 4 anni, indicando che la disfunzione olfattiva può segnalare prime fasi del PD 6-10. La comparsa precoce di deficit olfattivi nel PD ha portato ad un forte interesse per la disfunzione olfattiva ed i meccanismi sottostanti coinvolti. In studi preclinici nei roditori, la disfunzione olfattiva potrebbe essere una misura di esito sensibile per prevedere il potenziale terapeutico di nuove strategie terapeutiche.
Molti test sono stati progettati e ampiamente utilizzato per caratterizzare menomazioni sensomotorie in modelli di roditori di PD e di TESt il potenziale terapeutico di nuovi trattamenti 11-15. Anche se i deficit olfattivi sono ben documentati nel PD, la funzione olfattiva non è stata misurata di routine in molti modelli. Questo punto di vista sta cambiando anche se con la scoperta di forme genetiche del PD e la nozione più accettato che il PD è una malattia sistemica che colpisce più di una semplice funzione sensomotoria. Attualmente, ci sono numerosi studi in modelli genetici murini di PD e di altre malattie neurodegenerative che ora includono l'analisi del dell'olfatto nella caratterizzazione 16-24. Dato il crescente interesse della disfunzione olfattiva in patologie neurodegenerative, abbiamo cercato di montare una batteria di test olfattivi che possono essere utilizzati per caratterizzare nuovi modelli di neurodegenerazione e prova potenziali terapie modificanti la malattia in studi preclinici. Le prove descritte nel presente studio sono stati utilizzati sia la caratterizzazione e studi preclinici 18,25.
Le prove Highlighted in questo studio hanno dimostrato di essere sensibile nel rilevare la disfunzione olfattiva in un frequente utilizzato alfa-sinucleina modello murino sovraesprimenti della malattia di Parkinson 18. Essi comprendono il test sepolta pellet 26,27, una versione adattata del test blocco 23,24,28,29, e il test di assuefazione / Dishabituation 30. E 'importante notare che ci sono diversi adattamenti dei test descritti in questo studio che sono misure sensibili della funzione olfattiva nei topi, quelli evidenziati in questo studio sono i test di laboratorio ha più esperienza con e utilizzare routine.
Protocol
Tutte le fasi del protocollo seguono la cura degli animali e l'uso di linee guida e regolamenti stabiliti dal IACUC dell'Università di Cincinnati.
1. Considerazioni generali
- Se possibile, testare topi durante la fase attiva del ciclo buio. Tipicamente, eseguire test in condizioni di scarsa luce e almeno 1 ora nel ciclo buio. Tuttavia, se il test nel ciclo buio non è fattibile, eseguire tutti e tre i test durante il ciclo di luce. Tenete a mente che i tempi di sniffing può diminuire quando i topi sono testati durante il loro ciclo di sonno. NOTA: Durante le prove possono essere eseguite durante il ciclo sonno i topi possono mostrare meno interesse per il pellet sepolta, blocchi, o la cartuccia profumata.
- Al fine di ridurre eventuali effetti di stimoli olfattivi di fuori, indossare un paio di guanti di base in qualsiasi momento nel corso di ogni prova e poi posto un paio pulito di guanti sopra la coppia di base per ogni mouse e ogni prova. Come regola generale, in caso di dubbio, messo su un set pulito di guanti. Hanno una scatola di guanti leggereily disponibile in quanto saranno cambiati frequentemente. NOTA BENE: Usiamo guanti di nitrile per tutta la movimentazione degli animali.
- Pulizia materiali di prova e le gabbie tra soggetti con un disinfettante / sterilizzante è anche un passo importante in questa serie di test al fine di ridurre il rischio di diffusione della malattia, nonché rimuovere stimoli olfattivi indesiderati.
2 Buried Pellet di prova
- Almeno due giorni prima del test, registrare il peso di ogni mouse e poi il cibo limitare al 90% del peso corporeo. Prima della prova e durante la restrizione alimentare, dare ogni mouse 1-2 pezzi di pellet da utilizzare durante la prova (ad esempio, un pezzo di cereali zuccherati). Non saltare questo passaggio perché i topi sono neophobic con il cibo e non possono cercare il pellet durante il test se non hanno mangiato il pellet in precedenza.
- Su tutti i giorni di test, abituare i topi per 1 ora prima della prova ponendo loro gabbia in sala prove con bottiglia per l'acqua o l'alimentatore bin. loro casa nella loro gabbia a casa con un semplice coperchio superiore del filtro.
- Durante l'assuefazione, riempire una gabbia pulita topo ~ 3 cm di altezza con lenzuola pulite assicurandosi la biancheria da letto viene distribuito uniformemente in tutta la gabbia. Impostare un timer per 5 min.
- Dopo 1 ora di assuefazione, seppellire 1 zuccherate pellet di cereali 0,5 centimetri sotto la biancheria da letto in modo che non sia visibile.
- Rimuovere il mouse prova dalla gabbia casa, posizionarlo al centro della gabbia di prova, collocare il coperchio superiore del filtro sulla gabbia e avviare il timer.
- Arrestare il timer quando il mouse scopre il pellet e inizia mangiarlo. Annotare il tempo per scoprire il pellet sepolta.
- Se il mouse non trova il pellet entro 5 min, terminare il processo e notare un punteggio di 300 sec per questo mouse. Spostare il pellet alla parte superiore della biancheria da letto in modo che il mouse ha accesso ad esso, e lasciare il mouse per mangiare il pellet.
- Dopo la prova, riportare il mouse per sua gabbia a casa.
- Svuotare la biancheria dalla gabbia di prova e pulire il cetà, con soluzione detergente stanza degli animali.
- Ripetere i passaggi 2,4-2,9 per ogni mouse, e cambiare i guanti prima e dopo ogni mouse.
- Dopo che tutti i topi sono testati, dare loro abbastanza cibo per mantenerli al 90% del peso corporeo.
- Eseguire il test nei giorni 2-5 allo stesso modo come il giorno di test 1 con una sola eccezione; seppellire il pellet in un punto diverso nella gabbia per ogni prova.
- Il giorno 6 test, eseguire il processo pellet superficie.
- Per la prova di pellet di superficie, seguire la stessa procedura per la giornata di test 1, ma invece di seppellire i pellet sotto la biancheria da letto è posto sulla parte superiore della biancheria da letto. Registrare il tempo per il mouse per trovare e iniziare a mangiare il pellet.
3 Block Test
- Casa individualmente topi in gabbie pulite e mettere 5 blocchi nella gabbia (etichetta AE), cambiare i guanti prima di configurare ogni gabbia.
- Eseguire il test di 24 ore più tardi. Spostare i topi di prova per l'area di prova, rimuovere la bottiglia di acqua e alimentatore bin, e posizionare all 5 isolati dalla gabbia insieme ad una manciata di biancheria da letto in un sacchetto di plastica etichettata con l'identificazione dell'animale. Posizionare il sacchetto di plastica sigillato sulla parte superiore della casa gabbia del mouse.
- Abituare gli animali nella loro gabbia casa senza la bottiglia d'acqua, alimentatore bin, e blocchi per 1 ora prima del test.
- Cambiare i guanti tra ogni gabbia in modo che i profumi non vengono scambiati tra animali / blocchi.
- Allineare le gabbie del mouse accanto all'altro su un tavolo con almeno 10 cm tra ogni gabbia. Posizionare una videocamera in modo che la parte anteriore della gabbia (non il lato lungo della gabbia) è chiaramente visibile.
- Impostare il timer per 30 secondi e l'etichetta di una scheda con i dettagli importanti esperimenti (data, ID del mouse, prova, ecc). Videotape l'etichetta per 2-3 sec.
- Rimuovere i blocchi dC dal sacchetto di plastica con l'identificazione che il mouse e metterli al centro della gabbia in modo che siano ben visibili sulla videocamera. Assicurarsi che vi sia ~ 1 cm Øf spazio tra ciascuno dei blocchi. Posizionare la parte superiore del filtro sulla gabbia. Avviare il timer e videotape per 30 sec.
- Dopo 30 sec, interrompere la registrazione e rimuovere i blocchi dalla gabbia e metterli nuovamente dentro il sacchetto di plastica.
- Cambiare i guanti e poi passare a quello successivo del mouse, ripetendo la stessa procedura utilizzata per la prima prova. Fate questo per un totale di 6 prove per ogni mouse assicurandosi che vi sia un intervallo inter-trial di ~ 5 min.
- Al 7 ° prova, seguire la stessa procedura per le prove 1-6 tranne che invece di mettere blocco D dalla propria gabbia del mouse Aggiungi blocco E dalla gabbia di un altro mouse in modo che il mouse è esposto a blocchi A, B, C e dalla sua propria gabbia di casa e blocco E dalla gabbia di un altro mouse. Nota nel libro laboratorio il cui blocco E ogni mouse è esposto al blocco e alternativo dove E è posto in gabbia di ogni mouse (ad esempio, ABCE o AEBC). Prendere blocco e da un mouse dello stesso sesso, ma non da un cagemate originale. Videotape per 30 sec.
- Dopo le 7 prove, ritorno animali ad una nuova gabbia pulita con i loro cagemates originali. Pulire blocchi utilizzati nel test con detergente delicato e acqua e lasciare asciugare all'aria per l'uso in test successivi.
4. assuefazione / Dishabituation
- Eseguire il test di assuefazione / Dishabituation in un modo simile al test di blocco, ma invece di usare blocchi che hanno l'odore di un topo, utilizzare cartucce di tessuto in possesso di cotone profumato con diverse coppie di estratti.
- Seguire i passaggi 3,1-3,4 utilizzando una sola cartuccia, inodore tessuti al posto dei blocchi.
- Abituare topi in sala prove.
- Preparare le cartucce dei tessuti profumati in una stanza separata. Mettere un piccolo batuffolo di cotone in una cartuccia pulita e poi aggiungere 5 ml di estratto (ad esempio, l'estratto di mandorla) nel cotone. Agganciare la parte superiore della cartuccia sopra il cotone e posto in un box dedicato o borsa etichettato con quel profumo.
- Eseguire la stessa procedura fo un secondo profumo (ad esempio, estratto di anice). Cambiare i guanti tra gestione di diversi profumi. Assicurarsi che il batuffolo di cotone è completamente racchiuso nella cartuccia del tessuto. NOTA: Esposto fibre della palla di cotone possono causare l'animale ad avere interesse per la palla di cotone per scopi di nidificazione, piuttosto che il profumo stesso.
- Quindi, seguire i passaggi 3,6-3,10 utilizzando una cartuccia tessuto profumato per le prime sei prove, e la seconda cartuccia tessuti profumati per la settima prova.
5 Analisi delle Videocassette
- Per il blocco e test di assuefazione / Dishabituation, hanno una cieca rater a condizione sperimentale misurare il tempo trascorso ad annusare ogni blocco, con sniffing definito come contatto nasale con quel blocco. Se lo si desidera, misurare altri comportamenti come il tempo di avvicinarsi al blocco romanzo (E) durante la prova di 7 e l'attività totale (il numero di movimenti effettuati per tutta la lunghezza e la larghezza della gabbia casa) durante ogni prova. Punteggio ottenuto il tempo trascorso sniffing untempo d per avvicinarsi dalla videocassetta con un cronometro.
- Allo stesso modo, per il test di assuefazione / Dishabituation, hanno una cieca rater a condizione sperimentale misurare il tempo trascorso ad annusare la cartuccia, il tempo di avvicinarsi alla cartuccia, e l'attività locomotoria.
6. Statistiche
- Analizzare il test pellet sepolto utilizzando statistiche non parametriche perché la latenza per trovare il pellet punteggi tendono a mostrare l'eterogeneità della varianza. Nella media la latenza per individuare il pellet attraverso giorni 3-5 e poi confrontare tra i gruppi di topi con una Mann-Whitney U-test. Analogamente, per la parte pellet superficie del test, analizzare la latenza per trovare il pellet con un Mann-Whitney U-test per confrontare genotipi.
- Per la prova di blocco, analizzare i dati provenienti da Trial 7 (introduzione del blocco romanzo profumato). In genere, utilizzare le analisi non parametrici per spiegare l'eterogeneità della varianza. Al fine di analizzare le differenze di tempo trascorso sniffing the romanzo blocco così come il tempo di affrontare i blocchi per i diversi gruppi sperimentali, utilizzare il Mann-Whitney U-test. Utilizzare il Wilcoxon rank test Firmato a confrontare il tempo speso ad annusare il romanzo blocco di tempo speso ad annusare i blocchi familiari.
- Per la prova di assuefazione / Dishabituation, comportamento parametrico analisi su prove 1, 6 e 7, simile a studi precedenti 20. Se i topi mostrano poco o nessun sniffing, utilizzare le analisi non parametrici.
Representative Results
I pellet, blocco, e test assuefazione / Dishabituation sepolti sono tutte valutazioni estremamente vantaggiose dell'olfatto nei topi. Utilizzando questi test, abbiamo trovato cambiamenti significativi olfatto in diversi modelli murini genetica della malattia di Parkinson, tra cui alfa-sinucleina sovraesprimenti (Thy1-Asyn) 18 e Atp13a2 topi knockout. Entrambi Thy1-Asyn e Atp13a2 topi knockout impiegano più tempo per trovare il pellet sepolto rispetto ai controlli 18. Figure 1-3 mostrano i dati raccolti dal tipo selvatico e Atp13a2 topi knockout. Nel test pellet sepolta, Atp13a2 topi knockout mostrano un aumento di latenza per trovare il pellet sepolta rispetto ai topi di controllo di tipo selvatico (Figura 1). Nella prova di blocco sia di tipo selvatico e Atp13a2 topi knockout per annusare il blocco romanzo da gabbia di un altro topo rispetto a isolati dalla propria gabbia di casa (Figura 2). Nei topi di prova assuefazione / Dishabituation tipo selvatico mostrare assuefazione ad un odore e poi aumentata sniffing quando un romanzo odore è introdotto (Figura 3).
Figura 1 Sepolto pellet di prova. Latenza per trovare il pellet in di tipo selvatico (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 14) a 20-27 m di età. * P <0.05, Mann-Whitney U.
Figura 2 prova Block ora annusando il blocco romanzo (E) nel test di blocco di tipo selvatico (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 12) topi femmina a 20 -. 27m di età. ΔΔ rappresenta p <0.01 rispetto ai blocchi A, B, e C dello stesso genotipo. Mann-Whitney U.
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Figura prova 3 assuefazione / Dishabituation. Tempo medio fiutando una cartuccia profumata nei topi di tipo selvatico (9 m età, n = 7) su 6 prove e l'introduzione di una cartuccia con una nuova fragranza in prova 7.
Discussion
Ciascuno dei test descritti in questo studio misurano diversi aspetti della funzione olfattiva nei topi. Il test di pellet sepolta misura l'aspetto motivazione cibo di olfatto, testare la capacità di fame (cibo limitato, non cibo privati) topi per rilevare un pezzo appetibile di cereali zuccherati sepolto sotto biancheria da letto. Il test blocco misura più dell'aspetto sociale della funzione olfattiva, per valutare la capacità dei topi di discriminare tra loro profumo e quella di un conspecifici. Il test di assuefazione / Dishabituation valuta la capacità del mouse per discriminare tra odori familiari e innocui romanzo,. L'utilizzo di più test è importante nella caratterizzazione di un nuovo modello perché anomalie nei motivazione cibo o la paura potrebbero contribuire alle differenze osservate nei topi mutanti rispetto ai controlli. Ad esempio, se solo il test del blocco viene eseguito e diminuito sniffing del blocco che ha l'odore di un altro mouse è osservato, non è chiaro se vi sia un Olfactdeficit ory o una risposta di paura migliorato per la conspecifici che può portare a scanso di quel blocco. Quando più i test vengono eseguiti e deficit si osservano in tutti i test, si sostiene con forza l'interpretazione di impairment olfattiva. Tuttavia, se le differenze si osservano in un solo test, ma non gli altri, poi ci può essere una perdita olfattiva più sottile ma sarà indispensabile per escludere altre spiegazioni (ad esempio, una maggiore paura o motivazione cibo ridotto). Altri fattori importanti da tenere a mente durante la prova topi funzione olfattiva includono il ceppo di sfondo e il sesso dei topi. Diversi ceppi background genetico (cioè, C57BL / 6, DBA, ecc) possono avere effetti profondi sul comportamento del mouse quindi, si consiglia di adattare ogni protocollo in topi di tipo selvatico dello stesso fondo prima di eseguire l'intero esperimento. Si raccomanda inoltre che topi maschi e femmine essere provati separatamente gli uni dagli altri, perché il sistema olfattivo maschile è altamente sensibile alle femmine in estro e la rilevazione olfattiva di una femmina in estro potrebbe interferire con le prestazioni in tutti e tre i test.
Alcuni passi sono assolutamente fondamentale da seguire durante la prova dell'olfatto nei topi. E 'importante essere consapevoli degli odori sperimentatore sta introducendo agli animali. Indossare i guanti per le procedure è richiesta cambio essenziale e frequente dei guanti tra gli animali. E 'sempre una buona pratica per lo sperimentatore di non indossare colonia o profumo nei giorni di test olfatto. Mentre alcune parti del procedimento sono inflessibili, ci sono altre parti che possono essere modificati e adattati senza ridurre la validità o la sensibilità del test. Ad esempio, il numero di prove assuefazione può essere aumentata o diminuita a seconda del ceppo di topi in prova e in quanto tempo si abituano agli stimoli. La principale limitazione di questi test è che sono tutti guidati da una qualche forma di motivazione, sia esso cibo o sociale, rendendodifficile escludere completamente anomalie in motivazione come una spiegazione quando una risposta alterata osservato. Questo può essere minimizzato analizzando parametri aggiuntivi, come l'attività durante il test e il tempo di avvicinarsi stimoli.
Una volta masterizzato, le prove possono essere facilmente utilizzati per esaminare il fenotipo di modelli nuovi murini di malattie neurodegenerative. Inoltre, i test che hanno la più alta potenza possono essere incluse in studi preclinici test potenziali terapie (per esempio vedi rif. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
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