Summary
Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.
Abstract
Riparazione del DNA difettoso porta ad una maggiore instabilità genomica, che è la causa principale delle mutazioni che portano alla tumorigenesi. Analisi della frequenza e il tipo di aberrazioni cromosomiche in diversi tipi cellulari permette difetti nei percorsi di riparazione del DNA da chiarire. Comprensione mammiferi riparazione del DNA biologia è stato molto aiutato dalla produzione di topi con ko in geni specifici. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica nei linfociti B del mouse. Etichettatura dei telomeri con sonde PNA-FISH (peptide di acido nucleico - ibridazione fluorescente in situ) facilita l'analisi rapida di instabilità genomica degli spread metafase cromosomiche. Cellule B hanno vantaggi specifici relativi ai fibroblasti, perché hanno ploidia normale e un indice mitotico superiore. Cultura a breve termine di cellule B consente quindi la misurazione precisa di instabilità genomica in una popolazione di cellule primarie, che rischia di avere mutazione genetica secondaria menos di quello che è tipicamente presenti nei fibroblasti trasformati o linee cellulari di pazienti.
Introduction
Il cancro è causato da un accumulo di mutazioni che interessano i geni che regolano la crescita delle cellule normali. La mutazione è una conseguenza di modifiche alla struttura e la sequenza del genoma causato da danni al DNA. Danno al DNA può avvenire attraverso una varietà di processi, compresi gli agenti esogeni come radiazioni ionizzanti, e come un sottoprodotto del normale metabolismo cellulare, come deaminazione spontanea di basi nucleotidiche o danni che si verificano per contatto con le specie reattive dell'ossigeno 1.
Anche se le cellule di mammifero in possesso di una serie di attività di riparazione che può invertire il danno del DNA o ripristinare la sequenza in siti rottura, le mutazioni si accumulano comunque per tutta la durata di una cella. Danno al DNA può contribuire inoltre alla senescenza e la perdita di efficacia delle cellule staminali, due processi che sono associati con la malattia associata all'invecchiamento 2. Comprendere la riparazione dei danni al DNA è quindi di fondamentale importanza per affrontare due segnoquestioni ificant nella salute pubblica. Una crescente evidenza suggerisce che mammiferi percorsi di riparazione del DNA possono contribuire all'evoluzione del genoma delle cellule di cancro 3,4, il che rende ancora più indispensabile per capire i processi coinvolti nella soppressione mutazione a livello molecolare.
Visualizzazione diretta di aberrazioni cromosomiche è un potente e quantitativi mezzi per determinare il grado di instabilità genomica in un particolare tipo di cellula. Cromosomi abbreviato da cellule in metafase possono essere isolate e ispezionati utilizzando la luce o la microscopia a fluorescenza. Tali approcci citogenetiche sono stati in pratica per diversi decenni e può essere utilizzato per dimostrare l'aspetto di traslocazioni o specifici tipi di aberrazioni cromosomiche associate alla perdita di attività di riparazione del DNA. Il protocollo si presta a diversi potenziali estensioni: i cromosomi possono essere etichettati con sonde per cariotipo spettrale (SKY) o multicolor fluorescente in situ ibridazione(MFISH) per identificare traslocazioni 5,6. Queste tecniche permettono anche la frequenza di traslocazioni cromosomiche e la struttura di traslocazioni cromosomiche complesse da determinare, che fornisce informazioni aggiuntive di là di quanto è possibile con questo protocollo. In alternativa, sonde sequenza-specifiche possono essere generati e utilizzati per testare la frequenza di rottura del DNA in siti genomici selezionati 7.
In questo protocollo, si descrive la preparazione del cromosoma metafase diffonde da linfociti B. Un peptide acido nucleico (PNA) sonda fluorescenza marcata per le ripetizioni telomeriche viene utilizzato, che segna in modo efficiente telomeri in metafase cromosoma si diffonde Questo protocollo ha diversi vantaggi. Cellule B possono essere indotte a crescere ad alto indice mitotico in modo che gli spread di alta qualità possono essere prodotti in modo coerente. Cellule B da topi geneticamente modificati sono anche molto meno probabile che contengono mutazioni genetiche secondarie che possono confondere l'analisi del contributodi geni specifici per l'integrità genomica. L'approccio PNA-FISH può essere completato in un giorno, e permette il punteggio più accurata delle rotture cromosomiche. Usando questo approccio, in particolare in combinazione con attrezzature specifiche descritte in questo protocollo, è possibile produrre molto consistenti, spread alta qualità e analizzare rapidamente la velocità e il tipo di instabilità genomica.
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Protocol
Questa procedura è stata approvata dal Comitato di cura e l'uso degli animali Istituzionale presso la Rutgers, l'Università statale del New Jersey. I topi sono stati trattati in conformità con la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli scienziati dovrebbero consultare i loro organizzazioni nazionali ed istituzionali animali per linee guida stabilite e approvate.
Prima di iniziare, preparare le soluzioni elencate nella tabella 1.
1 B Isolamento cellulare e attivazione
Euthanize un mouse utilizzando CO 2 seguita da dislocazione cervicale. Posizionare il mouse in modo che il lato sinistro del corpo è alto e spruzzare il mouse con etanolo al 70% fino a quando il pelo è umido. Sezionare la milza e posto in un piatto di coltura tissutale 35 mm con tampone di lavaggio 2 ml. In una cappa a flusso laminare, delicatamente rompere la milza nel piatto di coltura di tessuti utilizzando la parte piatta di una siringa da 5 ml.
- Inserire una rete di nylon di 70 micron in un 50Tubo ml e trasferire il campione milza in 2 ml tampone di lavaggio nella rete di nylon. Interrompere delicatamente la milza nella rete utilizzando la parte piatta della siringa.
- Risciacquare retro della siringa e la placca 35 mm, con 8 ml di tampone di lavaggio e filtrata attraverso la maglia di nylon 70 micron. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di tampone di lisi ACK. Pipettare su e giù brevemente per interrompere grumi e incubare per 5 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet toccando il fondo della provetta poi pipettando in 1 ml di tampone di lavaggio. Aggiungere 50 ml di anti-CD43 MACS micro-perline e incubare in ghiaccio per 30 min. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Impostare unMini-MACS colonna posizionando una colonna sul magnete MACS. Posizionare un marcato tubo da 15 ml di sotto della colonna. Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio alla colonna e lasciar correre attraverso il tubo da 15 ml.
- Aspirare il surnatante e risospendere in 1 ml di tampone di lavaggio. Caricare il campione nella colonna dopo che il tampone di lavaggio è eseguito attraverso.
- Dopo che il campione è percorrere la colonna, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio per lavare la colonna. Aggiungere 7 ml di tampone di lavaggio direttamente al campione prelevato nella provetta da 15 ml.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Trasferire il volume richiesto di cellule necessarie per 5.000.000 cellule / pozzetto in una provetta da 50 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Supplemento medio delle cellule B con LPS 1: 500 e IL4 1: 1.000.
- Aspirare il surnatante e aggiungere il volume appropriato di supporto integrato delle cellule B necessaria per la concentrazione finale di 1.000.000 cellule / ml.
- Cellule piastra in piastre da 6 pozzetti con 5 ml di cellule a 1.000.000 cellule / ml e posto in un umidifiEd coltura cellulare incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2.
2 B Cella di fissaggio
- Aggiungere 50 ml di Colcemid al pozzo contenente 5 ml di cellule B (per una concentrazione finale di 100 ng / ml) e incubare 1 ora a 37 ° C. Preriscaldare soluzione KCl 75 mM in un bagno di 37 ° C Acque. Trasferire le cellule B ad una etichetta tubo 15 ml. Coprire l'etichetta con nastro e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere il pellet pipettando. Aggiungere 5 ml della preriscaldata KCl goccia a goccia, mentre toccando o pulsare in un vortice.
- Aggiungere 10 ml di KCl e mescolare capovolgendo. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 15 min. Aggiungere 5 gocce di fissativo fresco e mescolare capovolgendo. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml nella provetta e risospendere pellet pipettando su e giù.
- Aggiungere 5 ml di fissativo fresco goccia a goccia, mentre toccando o pulsante su un VORtex. Aggiungere altri 10 ml di fissativo e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante lasciando 1 ml in provetta e risospendere da pipettaggio. Aggiungere 14 ml di fissativo fresco e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Ripetere il punto 2.7 altre due volte.
- Aggiungere 14 ml di fissativo fresco. Sigillare i tappi con Parafilm e conservare una notte a -20 ° C.
3 Preparazione di metafase spread cromosomi
- Impostare una camera ambientale regolata a 22,9 ° C e 52% di umidità.
- Centrifugare le cellule B fissato a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare fissativo lasciando 70 microlitri nel tubo e risospendere da pipettaggio.
- Posizionare i vetrini etichettati in camera umida con un angolo di 35 °. Goccia 35 ml di cellule B risospese su un vetrino e rilasciare due scivoli per campione. Lasciare i vetrini si asciughino in camera umida per 30 minuti poi memorizzare le diapositivein una scatola di diapositive a 37 ° C.
4. telomeri PNA FISH
- Preparazione della sonda
- Pre-caldo formammide deionizzata a 37 ° C. Mescolare 2 ml di sonda PNA telomeri con 7 microlitri formammide deionizzata preriscaldata e incubare a 37 ° C con agitazione per 1 ora.
- Pre-caldo mix FISH maestro a 37 ° C. Aggiungere 7 ml di pre-riscaldato mix FISH maestro alla miscela dal punto 4.1.1 e incubare a 37 ° C per 1-3 ore.
- Denaturare la miscela sonda per 8 minuti a 80 ° C. Pre-temprare la sonda per 1 ora a 37 ° C.
- Pretrattamento dei vetrini cromosomi
- Pre-riscaldare un barattolo di vetro scorrevole colorazione contenente 50 ml di HCl 0,01 M a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Collocare i vetrini in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2 ml di pepsina magazzino al vetro pre-riscaldato slide-colorazione barattolo e mescolare capovolgendo. Trasferire i vetrini di questo vetro sljar ide-colorazione e incubare 90 sec a 37 ° C.
- Lavare i vetrini 2x in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente, agitando. Quindi lavare i vetrini per 5 min in PBS 1x / MgCl 2 a temperatura ambiente, agitando.
- Trasferire i vetrini in un vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente appena preparato 1% di formaldeide / 1x PBS / MgCl 2 per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini per 5 min in un altro vaso di vetro scorrevole-colorazione contenente 1x PBS a temperatura ambiente, agitando.
- Preparare una serie di disidratazione di etanolo avendo in vetro separata vasetti di slide-colorazione contenenti il 70%, 90% e il 100% di etanolo.
- Trasferire i vetrini per ogni barattolo per 3 min, iniziando con etanolo al 70%, quindi il 90% di etanolo, e poi il 100% di etanolo. Posizionare vasetti etanolo a -20 ° C una volta terminato.
- Lasciare i vetrini all'aria secca toccando eccesso di etanolo su un tovagliolo di carta e puntellare le diapositive con un angolo di 35 °. Una volta asciutto, mark un'area 18 x 18 mm per ibridazione sul retro delle diapositive utilizzando una penna diamante.
- Denaturazione delle diapositive per FISH
- Applicare 120 microlitri formammide 70% deionizzata / 2X SSC a un coprioggetto 24 x 60 mm. Toccare la diapositiva per il coprioggetto. Denaturare il vetrino a 80 ° C su una piastra calda per 90 sec.
- Far scorrere velocemente e con cura il vetrino e porre il vetrino in ghiaccio freddo etanolo al 70% per 3 minuti, seguito da 90% di etanolo, e il 100% di etanolo ciascuno per 3 min. Lasciare i vetrini all'aria secca.
- Preparare una camera umida allineando una scatola di plastica con un coperchio stretto e carta velina bagnata. La carta deve essere umido, ma non saturo d'acqua.
- In una camera umida, applicare la miscela pre-ricotto sonda dal passo 4.1.3 per l'area contrassegnata sul vetrino, coprire con un coperchio 18 x 18 mm, antiscivolo e incubare a 37 ° C per 1 ora.
- Lavaggi post-incubazione
- Preriscaldare il 50% formammide / 2x SSC, SSC 1x, 4x e SSC / 0,1% Tween-20 in un 45 °; C bagnomaria.
- Rimuovere con attenzione il coprioggetto e lavare i vetrini in pre-riscaldato 50% formammide / 2x SSC 3xfor 5 minuti ciascuna nel buio e agitando. Lavare i vetrini in pre-riscaldato 1x SSC 3xfor 5 minuti ciascuno, tremante. Infine, lavare i vetrini in pre-riscaldato 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 minuti ciascuno.
- Colorare i vetrini per 3 min in DAPI in una luce protetta vetrino-colorazione vaso.
- Lavare i vetrini per 5 min in 2x SSC, tremante. Applicare 35 ml di mezzo di montaggio Mowiol, coprire con 24 x 60 mm coprioggetto e conservare le diapositive a 4 ° C.
5 Analisi microscopica di cromosomi
- Analizzare le diapositive metafase utilizzando un microscopio a fluorescenza standard. Utilizzare una piattaforma di imaging con una fase automatizzata, ad esempio la piattaforma METASYSTEMS Metafer per ottenere migliori risultati. Per ogni spread metafase, raccogliere un'immagine per DAPI fluorescenza di visualizzare cromosomi, e un'immagine per il segnale fluorescente dal telomero probe. (Ad esempio, Cy3- altri fluors sono disponibili e funzionano altrettanto bene.)
- Sovrapponete le immagini con un programma di analisi di immagine e analizzare.
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Representative Results
Cromosomi in metafase derivati da una cella dovrebbe formare un cluster discreto contenente 40 cromosomi (se si utilizza cellule di topo) (Figura 1A). Ogni cromosoma ha un centromero ad una estremità, che è visibile come una sfera azzurro. In cromosomi normali, due segnali telomeri sono visti alla fine dei cromatidi e due segnali di ciascun centromero. Nuclei in interfase saranno presenti sul vetrino pure. Questi saranno visibili come sfere blu, con segnali telomeri rosse, ma non cromosomi condensati (vedi ad esempio la Figura 1B). I nuclei in interfase possono essere ignorati ai fini della quantificazione instabilità genomica.
Si osserva un certo numero di diversi tipi di aberrazioni cromosomiche. Rotture di cromatidi sono interruzioni uno dei due cromatidi fratelli che compongono ogni cromosoma in metafase. Possono essere segnato se lo sperimentatore vede una discontinuità in un cromatide, o la perdita di un singolo segnale telomero da un capo ofa cromosoma (vedi esempi in Figura 1B). Rotture cromosomiche sono identificati, cercando per la perdita di segnali telomeri da una estremità di un cromosoma (esempio in Figura 1C). In alcuni casi, l'estremità rotta del cromosoma può essere osservata come un frammento con segnali telomeri nella stessa spread metafase (come nel caso della Figura 1C). In altri casi, la fine cromosoma può non essere presente.
Si possono osservare diversi tipi di riarrangiamenti cromosomici. Cromosomi radiali prendere un certo numero di forme, caratterizzato da riarrangiamenti complessi che coinvolgono due cromosomi (tre esempi sono indicati con le frecce rosse nella Figura 1D). Cromosomi radiali includono anche riarrangiamenti più complessi, che coinvolgono tre o più cromosomi. I cromosomi possono anche diventare uniti per formare i cromosomi dicentrici, che appaiono come una fusione end-to-end di cromosomi con centromeri su entrambe le estremità (indicato con una freccia bianca in figura 1D </ Strong>). Traslocazioni robertsoniane sono un tipo di traslocazione tra i centromeri dei due cromosomi, che appaiono come quattro braccia cromatidi fratelli collegati a un singolo centromero (visto in Figura 1E).
Figura 1F mostra una metafase che non ha segnali telomeri presenti. L'assenza di segnali telomeri può avvenire da errori nella preparazione sonda o bolle d'aria nel coprioggetto durante l'ibridazione.
Figura 1 aberrazioni cromosomiche in cellule di topo B come visualizzate dal PNA FISH telomeri. A) La struttura dei cromosomi di una cellula normale topo B in metafase. 40 cromosomi sono visibili, con due segnali telomeri alle estremità. B) Una cellula che mostrano due rotture di cromatidi (frecce verdi). C) D) Una cellula visualizzazione di 3 cromosomi radiale (frecce rosse) e un cromosoma dicentrici (freccia bianca). E) Uno spread metafase con un cromosoma con una traslocazione Robertsoniana (freccia gialla ). F) Un esempio di ibridazione fallito, mostrando cromosomi senza segnali telomeri. La barra della scala rappresenta 10 micron di ogni immagine. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Considerando che i linfociti B attivati sono particolarmente adatti alla preparazione degli spread cromosomi mitotici, possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule. Linfociti T condividere molti dei vantaggi delle cellule B, in quanto possono essere purificati dai nodi milza o linfonodi, e hanno un elevato indice mitotico, quando stimolato dalla crescita in terreno contenente mitogeni appropriate 8. Le cellule staminali embrionali (cellule ES) sono adatti anche per l'analisi della metafase cromosoma 9. Se questi non sono disponibili, fibroblasti possono essere usate, anche se un trattamento più lungo con Colcemid (ad esempio, 16 h con Colcemid ad una concentrazione finale di 10 ng / ml) è raccomandato per intrappolare più cellule in metafase prima fissazione.
Troviamo che la consistenza della preparazione di metafase spread è molto facilitato facendo cadere i cromosomi fissati in una camera di umidità controllata, come il CDS-5 Thermotron citogenetica camera di essiccazione, ma è possibile ottenere buoni risultati while lavoro in un banco a seconda dell'umidità e temperatura ambiente di laboratorio. Per ottenere risultati attendibili, si consiglia di segnare aberrazioni cromosomiche da almeno 100 metafasi per campione. Poiché il processo delle immagini manualmente ogni metafase in ogni canale può essere laborioso, acquisiamo metafasi utilizzando un sistema di microscopia automatizzata Metasystem Metafer4, che può trovare rapidamente e con precisione la scansione di un gran numero di cromosomi in metafase.
Analisi dei cromosomi in metafase marcati con sonde telomero è ideale per misurare cromosomiche e cromatidiche, ei segnali telomeri anche aiutare l'identificazione di riarrangiamenti cromosomici complessi come fusioni e le strutture radiali. La colorazione dei cromosomi in metafase fisse con soluzione di Giemsa è adatto anche per quantificare aberrazioni cromosomiche, e offre il vantaggio di non richiedere la microscopia a fluorescenza 10. Etichettatura telomeri con una sonda pantelomeric PNA estende il range di aberrazioni cromosomiche che possono essere quantificati, permettendo l'identificazione di fusioni telomeri, che derivano, ad esempio, nelle cellule provenienti da topi knockout DNAPKcs-11. PNA-FISH può essere utilizzato anche per misurare le frequenze di anomalie cromosomiche telomeri, tra cui duplicazioni telomeri e cromatidi perdita dei telomeri 12,13. Perdita di un segnale telomero può essere causato da telomeri nonché da rotture cromosomiche. PNA-FISH può essere utilizzato per misurare la sensibilità lunghezza dei telomeri con Q-FISH (FISH quantitativa) 14.
Le cellule prive di diverse attività di riparazione del DNA tendono ad accumulare diversi tipi di aberrazioni cromosomiche. Ad esempio, la carenza del fattore di risposta al danno al DNA 53BP1, comporta l'accumulo di cromosoma si rompe 15. Per contro, una percentuale elevata di strutture radiali cromosomiche complesse si osservano nelle cellule prive BRCA1 4. Questi riarrangiamenti cromosomici sono varie nella loro esatta struttura,ma sempre coinvolgere fusione di materiale da due o più cromosomi. Quando le cellule hanno livelli molto alti di instabilità genomica, come ad esempio si verifica dopo il trattamento con alte dosi di agenti che causano rotture del DNA, diventa sempre più difficile segnare singole aberrazioni cromosomiche, che mette un limite alla gamma dinamica dell'esperimento.
Quantificazione delle rotture cromosomiche e riarrangiamenti degli spread metafase è utile per testare se specifici geni hanno un ruolo nella riparazione del DNA. Un potenziale problema con analisi della metafase cromosomica per questo scopo è che le cellule che mancano di attività di riparazione del DNA non possono crescere normalmente. Se le cellule di riparazione-carenti non raggiungono metafase, l'importanza di un gene per mediare la riparazione del DNA può essere sottovalutato. Ad esempio, RNF8 - / - cellule, che sono oggetto di senescenza p53-dipendente, mostrano un modesto livello di instabilità cromosomica, mentre RNF8 - / - p53 - / - cellule doppio knockout mostrano many aberrazioni cromosomiche più, perché la soppressione di p53 consente una migliore crescita delle cellule 16. E 'quindi importante abbinare misure di instabilità cromosomica con un saggio ciclo cellulare, per mostrare che le popolazioni di cellule KO possono crescere normalmente e contenere una percentuale significativa di cellule mitotiche.
L'osservazione di instabilità genomica, non lo fa per sé dare comprensione l'esatta funzione di una attività di riparazione fornito da un gene specifico, ma semplicemente agisce come un punto di partenza per ulteriori studi meccanicistici. Infine, anche se questo approccio è utile per misurare rotture cromosomiche e riarrangiamenti complessi, l'uso di mFISH o SKY è raccomandato per quantificare le traslocazioni cromosomiche. Queste tecniche iniziano anche con spread metafase cromosomiche, ma usano un cocktail di sonde che 'vernice' ogni cromosoma con una specifica combinazione di fluorofori. Una di queste tecniche è raccomandato per misurare l'intero spettro del cromosoma instabilità a riparare le cellule carenti.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi contrastanti.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da NIH concedere R00 CA160574 (SFB) e da una borsa di studio del programma di formazione Biotecnologie Rutgers (a SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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