Summary
Vías de reparación del ADN son esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica y la prevención de la mutación y el cáncer. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica mediante la observación directa de las aberraciones cromosómicas en metafase se propaga a partir de células B de ratón utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH) para las repeticiones teloméricas de ADN.
Abstract
Reparación del ADN defectuoso provoca un aumento de la inestabilidad genómica, que es la causa raíz de las mutaciones que conducen a la tumorigénesis. Análisis de la frecuencia y tipo de aberraciones cromosómicas en diferentes tipos de células permite defectos en las vías de reparación del ADN no se ha dilucidado. Entender la biología de reparación del ADN de los mamíferos se ha ayudado en gran medida por la producción de ratones con nocauts en genes específicos. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica en los linfocitos B de ratón. Etiquetado de los telómeros con sondas PNA-FISH (ácido nucleico peptídico - hibridación fluorescente in situ) facilita el análisis rápido de la inestabilidad genómica en las extensiones de cromosomas en metafase. Células B tienen ventajas específicas relativas a los fibroblastos, porque tienen la ploidía normal y un índice mitótico superior. Cultivo a corto plazo de las células B, por tanto, permite la medición precisa de la inestabilidad genómica en una población celular primaria que es probable que tenga mutación genética secundaria menoss de lo que se encuentra típicamente en fibroblastos transformados o líneas de células de pacientes.
Introduction
El cáncer es causado por la acumulación de mutaciones que afectan a genes que regulan el crecimiento celular normal. La mutación es una consecuencia de cambios en la estructura y la secuencia del genoma causado por el daño al ADN. Daño del ADN puede ocurrir a través de una variedad de procesos, incluyendo agentes exógenos tales como la radiación ionizante y, como un subproducto del metabolismo celular normal, tales como desaminación espontánea de bases de nucleótidos o daños que se producen por el contacto con especies reactivas de oxígeno 1.
Aunque las células de mamíferos poseen una gama de actividades de reparación que puede revertir el daño de ADN o restaurar la secuencia en los sitios de ruptura, sin embargo, las mutaciones se acumulan durante toda la vida de una célula. Daño del ADN puede contribuir además a senescencia y pérdida de potencia de las células madre, dos procesos que están asociados con la enfermedad de envejecimiento asociado 2. La comprensión de la reparación del daño en el ADN es, por tanto, de vital importancia en el tratamiento de dos signocuestiones ificant en la salud pública. La evidencia creciente sugiere que las vías de reparación del ADN de mamíferos pueden contribuir a la evolución del genoma de células de cáncer 3,4, lo que hace aún más imprescindible para entender los procesos implicados en la supresión de la mutación a nivel molecular.
La visualización directa de las aberraciones cromosómicas es un potente y cuantitativos medio de determinar el grado de inestabilidad genómica en un tipo de célula particular. Cromosomas condensados a partir de células en metafase se pueden aislar e inspeccionados usando luz o microscopía fluorescente. Tales enfoques citogenéticos han sido en la práctica desde hace varias décadas y se pueden utilizar para demostrar la aparición de translocaciones o tipos específicos de aberraciones cromosómicas asociadas con la pérdida de las actividades de reparación del ADN. El protocolo se presta a varias prórrogas posibles: los cromosomas se pueden marcar con sondas para cariotipo espectral (SKY) o fluorescente multicolor de hibridación in situ(MFISH) para identificar las translocaciones 5,6. Estas técnicas permiten también la frecuencia de las translocaciones cromosómicas y la estructura de las translocaciones cromosómicas complejas por determinar, que proporciona información adicional más allá de lo que es posible con este protocolo. Alternativamente, las sondas específicas de secuencia pueden ser generados y utilizados para probar la frecuencia de rotura del ADN en sitios genómicos seleccionados 7.
En este protocolo, se describe la preparación de los cromosomas en metafase se propaga a partir de linfocitos B. Se utiliza un ácido nucleico (PNA) péptido-sonda marcada con fluorescencia para las repeticiones teloméricas, que marca de manera eficiente los telómeros en el cromosoma en metafase se extiende Este protocolo tiene varias ventajas. Las células B pueden ser inducidas a crecer a alto índice mitótico de modo que los diferenciales de alta calidad consistentemente pueden ser producidos. Células B de ratones genéticamente modificados son también mucho menos probable que contenga mutaciones genéticas secundarias que pueden confundir el análisis de la contribuciónde genes específicos a la integridad genómica. El enfoque PNA-FISH se puede completar en un día, y permite anotar más precisa de roturas cromosómicas. Mediante el uso de este enfoque, sobre todo en combinación con el equipo específico que se describe en este protocolo, es posible producir, los diferenciales de alta calidad muy consistentes y analizar rápidamente la velocidad y el tipo de inestabilidad genómica.
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Protocol
Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en Rutgers, la Universidad Estatal de Nueva Jersey. Los ratones fueron tratados de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los científicos deberían consultar a sus organizaciones animalistas nacionales e institucionales de las normas establecidas y aprobadas.
Antes de comenzar, preparar las soluciones enumeradas en la Tabla 1.
Aislamiento Celular 1 B y Activación
La eutanasia a un ratón utilizando CO 2 seguido por dislocación cervical. Coloque el ratón para que el lado izquierdo del cuerpo está en marcha y rociar el ratón con etanol al 70% hasta que la piel está húmeda. Diseccionar el bazo y el lugar en un 35 mm placa de cultivo de tejidos con tampón de lavado 2 ml. En una campana de flujo laminar, romper suavemente el bazo en la placa de cultivo de tejidos utilizando el extremo plano de una jeringa de 5 ml.
- Inserte una malla de nylon de 70 micras en un 50tubo ml y transferir la muestra de bazo en 2 ml de tampón de lavado al interior de la malla de nylon. Interrumpir suavemente el bazo en la malla utilizando el extremo plano de la jeringa.
- Enjuague la parte posterior de la jeringa y la placa de 35 mm con 8 ml de tampón de lavado y filtrado a través de la malla de nylon 70 micras. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 3 ml de tampón de lisis ACK. Pipetear hacia arriba y abajo para interrumpir brevemente montones e incubar durante 5 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado y se centrifuga a 300 g durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar y desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado tocando el fondo del tubo y luego con la pipeta en 1 ml de tampón de lavado. Añadir 50 l de anti-CD43 MACS micro-cuentas e incubar en hielo durante 30 min. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Añadir 10 ml de tampón de lavado, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Establecer unColumna Mini-MACS mediante la colocación de una columna en el imán MACS. Coloque un tubo cónico de 15 ml etiquetados bajo la columna. Añadir 1 ml de tampón de lavado a la columna y dejar correr a través de al tubo de 15 ml.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de lavado. Cargar la muestra en la columna después el tampón de lavado se ha ejecutado a través.
- Después de que la muestra ha ejecutar a través de la columna, añadir 1 ml de tampón de lavado para lavar la columna. Añadir 7 ml de tampón de lavado directamente a la muestra recogida en el tubo de 15 ml.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro. Transferir el volumen requerido de células necesarias para 5.000.000 células / pocillo en un tubo de 50 ml. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Suplemento medio de células B con LPS 1: 500 y 1 IL4: 1000.
- Aspirar el sobrenadante y añadir el volumen apropiado de medio de células B suplementado necesaria para la concentración final de 1.000.000 células / ml.
- Células de la placa en placas de 6 pocillos con 5 ml de células a 1.000.000 de células / ml y colocar en un humidified incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% de CO 2.
Fijación Cell 2 B
- Añadir 50 l de colcemid al pozo que contiene 5 ml de las células B (para una concentración final de 100 ng / ml) y se incuba 1 hora a 37 ° C. Precalentar 75 mM KCl solución en un baño a 37 ° C. Transferencia de las células B a un tubo de 15 ml etiquetados. Cubra la etiqueta con cinta y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet mediante pipeteo. Añadir 5 ml de la caída de KCl precalentado a gota mientras golpea o pulsante en un vórtice.
- Añadir 10 ml de KCl y mezclar invirtiendo. Incubar en un 37 ° C baño de agua durante 15 min. Añadir 5 gotas de fijador fresco y mezcla por inversión. Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en el tubo y resuspender el pellet pipeteando arriba y abajo.
- Añadir 5 ml de fijador fresco gota a gota mientras golpea o pulsante en un vortex. Añadir otros 10 ml de fijador y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante dejando 1 ml en tubo y resuspender con la pipeta. Añadir 14 ml de fijador fresco y centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Repita el paso 2.7 en dos ocasiones más.
- Añadir 14 ml de fijador. Selle los tapones con Parafilm y almacenar toda la noche a -20 ° C.
3 Preparación de las extensiones de cromosomas en metafase
- Establezca una cámara ambiental regulada a 22,9 ° C y 52% de humedad.
- Centrifugar las células B fijado a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar fijador dejando 70 l en el tubo y resuspender mediante pipeteo.
- Coloque las diapositivas marcadas en la cámara de humedad en un ángulo de 35 °. Gota 35 l de las células B resuspendidas en un portaobjetos y soltar dos portaobjetos por muestra. Deje que los portaobjetos se sequen en la cámara de humedad durante 30 minutos y luego guardar las diapositivasen una caja de portaobjetos a 37 ° C.
4. telómeros PNA FISH
- Preparación de la sonda
- Pre-caliente formamida desionizada a 37 ° C. Mezclar 2 l de sonda de APN de los telómeros con 7 l de formamida desionizada precalentada y se incuba a 37 ° C con agitación durante 1 hr.
- Pre-caliente mezcla maestra FISH a 37 ° C. Añadir 7 l precalentado mezcla maestra FISH a la mezcla del paso 4.1.1 y se incuba a 37 ° C durante 1-3 horas.
- Desnaturalizar la mezcla de la sonda durante 8 minutos a 80 ° C. Pre-hibridar la sonda durante 1 hora a 37 ° C.
- Pretratamiento de portaobjetos cromosómicos
- Pre-calentar un tarro de cristal deslizable tinción que contiene 50 ml de HCl 0,01 M a 37 ° C en un baño de agua.
- Colocar los portaobjetos en un tarro de cristal deslizable tinción diferente que contiene 2x SSC durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir 2 l de pepsina de stock al vidrio precalentado slide-tinción frasco y mezclar invirtiendo. Transferir las diapositivas a este sl vidriojar ide-tinción e incubar 90 segundos a 37 ° C.
- Lave las diapositivas 2x en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente, agitando. A continuación, lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 1x PBS / MgCl2 a temperatura ambiente, agitando.
- Transferir los portaobjetos a un tarro de cristal deslizante de tinción recién preparada que contenía 1% de formaldehído-/ 1x PBS / MgCl $ 2 durante 10 min a temperatura ambiente.
- Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de vidrio deslizable tinción diferente que contiene 1x PBS a temperatura ambiente, agitando.
- Preparar una serie de deshidratación de etanol por tener vidrio separada frascos de deslizamiento de tinción que contienen 70%, 90% y 100% de etanol.
- Transferir los portaobjetos a cada frasco durante 3 min, empezando con etanol al 70%, luego 90% de etanol, y luego etanol al 100%. Coloque los tarros de etanol a -20 ° C cuando haya terminado.
- Permitir las diapositivas se sequen al aire tocando el exceso de etanol en una toalla de papel y apuntalar las diapositivas en un ángulo de 35 °. Una vez seco, mark un área de 18 x 18 mm para la hibridación en la parte posterior de las diapositivas utilizando una pluma de diamante.
- La desnaturalización de las diapositivas para FISH
- Aplicar formamida 120 l 70% desionizada / 2X SSC a un cubreobjetos de 24 x 60 mm. Toca la diapositiva a la cubreobjetos. Desnaturalizar la diapositiva a 80 ° C en una placa caliente durante 90 segundos.
- Rápida y cuidadosamente deslice el cubreobjetos y colocar el portaobjetos en hielo frío etanol al 70% durante 3 min, seguido de etanol 90% y etanol al 100% durante 3 min cada uno. Permitir las diapositivas se sequen al aire.
- Preparar una cámara húmeda por el forro una caja de plástico con tapa hermética y un pañuelo de papel mojado. El papel debe estar húmedo, pero no saturado con agua.
- En una cámara húmeda, aplique la mezcla de sondas pre-recocido desde el paso 4.1.3 a la zona marcada en el portaobjetos, cubra con una tapa deslizante mm 18 x 18 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora.
- Los lavados post-incubación
- Pre-caliente 50% de formamida / SSC 2x, 1x SSC, y 4x SSC / 0,1% de Tween-20 en unos 45 °; C baño de agua.
- Retire con cuidado el cubreobjetos y lavar los portaobjetos en pre-calentado 50% formamida / 2 × SSC 3xfor 5 minutos cada uno en la oscuridad y temblando. Se lavan los portas en pre-calentado 1x SSC 3xfor 5 minutos cada uno, temblando. Finalmente, lavar los portaobjetos en pre-calentado 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min cada uno.
- Teñir las diapositivas durante 3 min en DAPI en una luz protegida vidrio deslizable tinción frasco.
- Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en 2x SSC, temblando. Aplique 35 l de medio de montaje Mowiol, cubrir con 24 x 60 mm cubreobjetos y almacenar las diapositivas a 4 ° C.
5. microscópica Análisis de Cromosomas
- Analizar las diapositivas en metafase utilizando un microscopio de epi-fluorescencia estándar. Utilice una plataforma de imágenes con una etapa automatizada como la plataforma MetaSystems Metafer para obtener mejores resultados. Para cada extensión metafase, recoger una imagen de fluorescencia DAPI para visualizar los cromosomas, y una imagen de la señal fluorescente del telómero pbata. (Por ejemplo, Cy3 otros compuestos fluorescentes están disponibles y funcionan igual de bien.)
- Superposición de las imágenes con un programa de análisis de imagen y analizar.
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Representative Results
Los cromosomas en metafase de una célula derivados deben formar un clúster discreta que contiene 40 cromosomas (si usando células de ratón) (Figura 1A). Cada cromosoma tiene un centrómero en un extremo, que es visible como una esfera de color azul claro. En cromosomas normales, dos señales de los telómeros son vistos en el extremo de las cromátidas y dos señales por cada centrómero. Núcleos en interfase estarán presentes en la diapositiva también. Estos serán visibles como esferas azul, con señales de telómero rojo, pero no hay cromosomas condensados (véase por ejemplo la Figura 1B). Los núcleos en interfase pueden ser ignorados para los propósitos de cuantificación de la inestabilidad genómica.
Un número de diferentes tipos de aberraciones cromosómicas se puede observar. Roturas de cromátidas son roturas en una de las dos cromátidas hermanas que forman cada cromosoma en metafase. Pueden ser marcados si el investigador ve una discontinuidad en cromátida, o la pérdida de una sola señal de los telómeros de un extremo ofa cromosoma (ver ejemplos en la Figura 1B). Roturas cromosómicas son identificados mediante la búsqueda de pérdida de las señales de los telómeros de un extremo de un cromosoma (ejemplo en la Figura 1C). En algunos casos, el extremo roto del cromosoma se puede observar como un fragmento con las señales de los telómeros en la misma propagación de metafase (como es el caso en la Figura 1C). En otros casos, el cromosoma final puede no estar presente.
Se pueden observar varios tipos de reordenamientos cromosómicos. Cromosomas radiales toman una serie de formas, que se caracteriza por reordenamientos complejos que implican dos cromosomas (tres ejemplos se muestran con flechas rojas en la Figura 1D). Cromosomas radiales también incluyen reordenamientos más complejas, que involucran tres o más cromosomas. Los cromosomas también pueden ser unidos para formar cromosomas dicéntricos, que aparecen como una fusión de extremo a extremo de los cromosomas con centrómeros en ambos extremos (que se muestra con una flecha blanca en la Figura 1D </ Strong>). Translocaciones de Robertson son un tipo de translocación entre los centrómeros de dos cromosomas, que aparecen como cuatro brazos de cromátidas hermanas unidas a un único centrómero (visto en la figura 1E).
Figura 1F muestra una metafase que no tiene señales de telómeros presente. Ausencia de señales de los telómeros puede ocurrir por errores en la preparación de la sonda o burbujas de aire en el cubreobjetos durante la hibridación.
Figura 1. aberraciones cromosómicas en células de ratón B como visualizaron por PNA FISH de los telómeros. A) La estructura de los cromosomas de una célula B de ratón normal en metafase. 40 cromosomas son visibles, con dos señales de los telómeros en los extremos. B) Una célula que muestran dos roturas de cromátidas (flechas verdes). C) D) Una célula se presentan 3 cromosomas radiales (flechas rojas) y un cromosoma dicéntricos (flecha blanca). E) Una extensión metafase con un cromosoma con una translocación Robertsoniana (flecha amarilla ). F) Un ejemplo de una hibridación fallado, que muestra los cromosomas sin señales de los telómeros. La barra de escala representa el 10 micras en cada imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que los linfocitos B activados son particularmente adecuados para la preparación de extensiones de cromosomas mitóticos, también se pueden utilizar otros tipos de células. Linfocitos T compartir muchas de las ventajas de las células B, ya que pueden ser purificados a partir de los nodos de bazo o de los ganglios, y tienen un alto índice mitótico cuando son estimuladas por el crecimiento en medio que contiene mitógenos apropiados 8. Las células madre embrionarias (células ES) también son adecuados para el análisis de cromosomas en metafase 9. Si estos no están disponibles, las células de fibroblastos se pueden utilizar, aunque un tratamiento más prolongado con colcemid (por ejemplo, 16 horas con colcemid a una concentración final de 10 ng / ml) se recomienda para atrapar más células en metafase antes de la fijación.
Nos encontramos con que la consistencia de la preparación de la metafase para untar se facilita en gran medida por la caída de los cromosomas fijos en una cámara de humedad controlada, como los CDS-5 Thermotron citogenético cámara de secado, pero es posible obtener buenos resultados while de trabajo en un banco dependiendo de la humedad y la temperatura del entorno de laboratorio. Para obtener resultados fiables, es recomendable marcar aberraciones cromosómicas de al menos 100 metafases por muestra. A medida que el proceso de las imágenes manualmente cada metafase en cada canal puede ser laborioso, adquirimos metafases utilizando un sistema de microscopía automatizada Metasystems Metafer4, que puede encontrar rápidamente y analizar un gran número de cromosomas en metafase con precisión.
El análisis de los cromosomas en metafase marcadas con sondas telómero es ideal para medir el cromosoma y cromátida se rompe, y las señales de los telómeros también ayudar a la identificación de reordenamientos cromosómicos complejos tales como fusiones y estructuras radiales. La tinción de cromosomas en metafase fijos con solución de Giemsa también es adecuado para la cuantificación de aberraciones cromosómicas, y ofrece la ventaja de no requerir microscopía fluorescente 10. Etiquetado de los telómeros con una sonda PNA pantelomeric extiende el range de las aberraciones cromosómicas que pueden cuantificarse, por lo que permite la identificación de las fusiones de los telómeros, que ocasionan, por ejemplo, en las células de los ratones knock-out DNAPKcs 11. PNA-FISH también se puede utilizar para medir las frecuencias de las anomalías de los telómeros, incluyendo duplicaciones de los telómeros de los cromosomas y 12,13 pérdida de telómeros de cromátidas. La pérdida de una señal de los telómeros puede ser causada por el acortamiento de los telómeros, así como por la rotura de cromosomas. PNA-FISH se puede usar para medir la longitud de los telómeros con sensibilidad utilizando Q-FISH (FISH cuantitativa) 14.
Las células que carecen diferentes actividades de reparación del ADN tienden a acumular los distintos tipos de aberraciones cromosómicas. Por ejemplo, la deficiencia en el factor de 53BP1 respuesta al daño del ADN, conduce a la acumulación del cromosoma 15 se rompe. Por el contrario, una alta proporción de complejas estructuras cromosómicas radial se observó en células que carecen de BRCA1 4. Estos reordenamientos cromosómicos son variados en su estructura exacta,pero siempre implicar la fusión de material a partir de dos o más cromosomas. Cuando las células tienen niveles muy altos de la inestabilidad genómica, como por ejemplo ocurre después del tratamiento con altas dosis de agentes que causan roturas en el ADN, se hace cada vez más difícil de marcar aberraciones cromosómicas individuales, que pone un límite en el rango dinámico del experimento.
Cuantificación de rupturas cromosómicas y reordenamientos de los diferenciales en metafase es útil para probar si los genes específicos tienen un papel en la reparación del ADN. Un problema potencial en el uso de análisis de los cromosomas en metafase para este propósito es que las células que carecen de las actividades de reparación del ADN pueden no crecer normalmente. Si las células de reparación deficiente no alcanzan la metafase, la importancia de un gen para mediar en la reparación del ADN puede ser subestimada. Por ejemplo, RNF8 - / - células, que están sujetos a la senescencia dependiente de p53, muestran un modesto nivel de inestabilidad cromosómica, mientras que RNF8 - / - p53 - / - células doble knockout muestran many aberraciones cromosómicas más, porque la supresión de p53 permite un mejor crecimiento celular 16. Es por lo tanto importante para emparejar las mediciones de la inestabilidad cromosómica con un ensayo del ciclo celular, para mostrar que las poblaciones de células knockout pueden crecer normalmente y contener una proporción significativa de células mitóticas.
La observación de la inestabilidad genómica en sí no dan una idea de la función exacta de una actividad de reparación proporcionado por un gen específico, sino que simplemente actúa como un punto de partida para estudios más mecanicistas. Finalmente, aunque este enfoque es útil para medir cromosoma se rompe y las reorganizaciones del complejo, se recomienda el uso de MFISH o SKY para la cuantificación de translocaciones cromosómicas. Estas técnicas también comienzan con extensiones de cromosomas en metafase, pero el uso de un cóctel de sondas que "pintura" cada cromosoma con una combinación específica de los fluoróforos. Cualquiera de estas técnicas se recomienda para medir el espectro completo del cromosoma instability en reparar las células deficientes.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses en conflicto.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el NIH subvención R00 CA160574 (SFB) y por una beca del Programa de Entrenamiento de Biotecnología Rutgers (a SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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