Summary
DNA修复途径对于维持基因组的完整性，防止基因突变和癌症至关重要。该协议的目的是通过直接观察染色体畸变的量化基因组不稳定性在中期从原位杂交（FISH）对端粒DNA重复使用荧光小鼠B细胞的扩散。
Abstract
有缺陷的DNA修复导致增加的基因组不稳定性，这是基因突变，导致肿瘤发生的根本原因。在不同类型的细胞的频率和染色体畸变的类型的分析，可以在DNA修复途径缺陷待阐明。理解哺乳动物DNA修复生物学已经由生产小鼠用在特定的基因敲除极大地帮助。此协议的目的是量化小鼠B淋巴细胞的基因组不稳定性。使用PNA-FISH探针（肽核酸-荧光原位杂交）的端粒的标签有利于基因组不稳定性的中期染色体利差的快速分析。 B细胞有相对的成纤维细胞特定的优势，因为他们有正常的染色体倍性和较高的有丝分裂指数。因此，B细胞的短期培养使基因组不稳定性的精确测量在原代细胞群这很可能具有较少的次级基因突变总比什么通常发现在转化的成纤维细胞或患者的细胞系。
Introduction
癌症是通过影响基因调节正常细胞生长的突变的积累而引起的。突变是变化所引起的DNA损伤的基因组的结构和序列的结果。 DNA损伤的发生原因，通过各种方法，包括外源试剂如电离辐射，和作为正常细胞的代谢，如通过与活性氧1接触存在的核苷酸碱基或损害自发脱氨的一种副产品。
虽然哺乳动物细胞中具有一系列的维修活动的可逆转的DNA损伤或恢复在断裂位点的序列，突变仍然积累在整个细胞的寿命。 DNA损伤可进一步促进衰老和干细胞的效能损失，其中两个是与衰老相关的疾病相关联的进程。在处理两个符号理解DNA损伤的修复，因此至关重要ificant问题的公众健康。越来越多的证据表明，哺乳动物DNA修复途径可以向肿瘤细胞的基因组3,4的演变，使得它更有必要了解参与抑制突变在分子水平上的处理。
染色体畸变的直接可视化是一个强大的和定量测定特定细胞类型的基因组不稳定性的程度手段。从细胞中冷凝的染色体在分裂中期，可以分离并利用光或荧光显微镜检查。这样的细胞遗传学方法已经在实践了几十年，并且可以用于证明易位或特定类型与DNA修复活性的损失相关联的染色体畸变的出现。该协议适合于一些潜在的扩展：染色体可以标记探针光谱核型分析（SKY）或多色荧光原位杂交（mFISH）确定易位5,6。这些技术也使染色体易位的频率和复杂的染色体易位结构来确定，这超出了能够与本协议提供的附加信息。备选地，序列特异性探针可产生和使用在选择的基因组位点7来测试DNA断裂的频率。
在这个协议中，我们描述了编制中期染色体由B淋巴细胞传播。荧光标记的肽核酸（PNA）探针，端粒重复序列的情况下，其有效标记的端粒在分裂中期染色体扩散该协议具有几个优点。 B细胞可以被诱导生长在高有丝分裂指数，使高品质的差可以持续进行制备。从转基因小鼠的B细胞也不太可能包含次要的基因突变，可以颠倒的贡献的分析特定基因的基因组的完整性。在PNA-FISH方法可以在一天内完成，并允许染色体断裂的更准确的得分。通过使用这种方法，特别是与在此协议中描述的特定设备的组合，所以能够产生非常一致的，高品质的差和快速分析的速率和基因组不稳定性的类型。
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Protocol
这个过程是经新泽西州的州立大学实验动物管理和使用委员会在罗格斯。小鼠按照美国国立卫生研究院指南实验动物护理和使用处理。科学家应咨询自己的国家和机构的动物组织建立和批准的准则。
开始之前，制备表1中列出的解决方案。
1，B细胞分离和激活
安乐死采用的CO 2颈椎脱位鼠标。将鼠标这样身体的左侧是向上和喷鼠标，用70％的乙醇，直至毛发是湿的。解剖脾和地方35毫米组织培养皿用2ml洗涤缓冲液。在层流罩，用5毫升注射器的平头，轻轻的向上突破，在组织培养皿脾。
- 插入一个70微米的尼龙网成50毫升管和脾脏样品在2毫升的洗涤缓冲液转移到尼龙筛。轻轻地扰乱使用注射器的扁平端的脾脏中的网格。
- 冲洗注射器的后面和35毫米的钢板用8ml的洗涤缓冲液，并通过70微米尼龙筛过滤。离心机在300×g离心在4℃下10分钟。
- 吸出并弃去上清，重悬沉淀物在3ml的ACK裂解缓冲液中。移液器上下简要地破坏团块，并孵育5分钟。加入10毫升的洗涤缓冲液和离心分离机，在300×g离心在4℃下10分钟。
- 吸出并弃去上清液，并通过在1ml的洗涤缓冲液轻敲试管底部，然后通过移液重悬沉淀。加入50μl的抗CD43 MACS微珠并在冰上孵育30分钟。加入10毫升的洗涤缓冲液，轻轻混匀，离心300×g离心4℃10分钟。加入10毫升的洗涤缓冲液，轻轻混匀，离心300×g离心4℃10分钟。
- 设立迷你MACS柱放置一列上的MACS磁铁。定位标记的15毫升锥形管列如下。加入1毫升的洗涤缓冲液对柱，并允许向15ml试管中运行通过。
- 吸去上清，重悬在1ml的洗涤缓冲液。加载样品在柱后的洗涤缓冲液中已运行通过。
- 后的样品通过色谱柱运行，加入1 ml的洗涤缓冲液洗柱。加7毫升的洗涤缓冲液，直接向在15ml试管中收集的样品。
- 计数使用血球细胞。传送/孔所需的500万细胞到50ml管细胞所需的体积。离心机在300×g离心在4℃下10分钟。补充B细胞中与LPS 1：500和IL-4 1：1,000。
- 吸出上清液，并添加所需的百万个细胞/ ml的终浓度添加的B细胞培养基中的适当体积。
- 板的细胞在6孔板中，用5ml的细胞在百万细胞/毫升，将其放入humidifi编细胞培养培养箱中于37℃，5％CO 2。
2，B细胞固定
- 加入50μl的秋水仙胺的对好含有5ml的B细胞（为100纳克/毫升的终浓度）孵育1小时，在37℃下。 Prewarm 75 mM的KCl溶液在37℃水浴。转移B细胞标记15ml试管中。用胶带和离心标签在300 XG，在4℃下10分钟。
- 吸出上清液留1毫升的管中，通过移液重悬沉淀。加入5毫升预热氯化钾一滴一滴的同时点击或脉冲的旋涡。
- 加入10 ml的KCl和通过反转混合。孵育在37℃水浴15分钟。加入5滴新鲜固定液和混合通过反转。离心机在300×g离心在4℃下10分钟。吸出上清液留1毫升的管，重悬沉淀用移液器上下吹吸。
- 加入5毫升新鲜固定液一滴一滴的同时点击或脉冲在VORTEX。增加一个额外的10毫升固定液和温育30分钟，在室温下进行。
- 离心机在300×g离心在4℃下10分钟。吸出上清液留1毫升管，重悬吹打。 ，增加14毫升新鲜固定液和离心机在300×g离心在4℃下10分钟。
- 重复步骤2.7的两倍以上。
- ，增加14毫升新鲜固定液。密封瓶盖封口膜过夜存放于-20℃。
3，制备中期染色体价差
- 设定一个监管环境室22.9°C和52％的湿度。
- 离心机在4℃下固定的B细胞，在300×g离心10分钟。吸出固定液留下70微升的管子，重悬吹打。
- 放置在湿度箱标记的幻灯片以35°的角度。降35微升悬浮B细胞上一张幻灯片，每滴样品两张幻灯片。允许的幻灯片中的湿度室中干燥30分钟，然后保存在幻灯片在37℃的幻灯片框。
4，端粒PNA FISH
- 探针的制备
- 预温去离子甲酰胺至37℃。拌2微升端粒PNA探针与7微升去离子预热甲酰胺和孵育在37℃下振荡1小时。
- 预温鱼预混至37℃。从步骤4.1.1添加7微升预热的鱼预混到混合物中，在37℃下进行1-3小时。
- 变性的探针混合物8分钟，在80℃。在37℃下预退火的探针1小时。
- 染色体幻灯片的预处理
- 预温热含有50ml的0.01M的HCl中和至37℃的水浴中载玻片染色缸。
- 地方载玻片在含有2×SSC 5分钟，在室温下具有不同的载玻片染色缸。
- 加入2微升蛋白酶库存到预热的载玻片染色缸和通过反转混合。传送滑动到该玻璃SLIDE-染色缸和孵化90秒，在37℃。
- 洗涤载玻片2倍于含有1x PBS，每次5分钟，在室温下，振摇不同的载玻片染色缸。然后在室温下清洗载玻片5分钟，在1×PBS / MgCl 2的，摇动。
- 传送的幻灯片到含有新鲜制备的1％甲醛/ 1X PBS / MgCl 2的，在室温下10分钟的载玻片染色缸。
- 为5分钟，在含有1x PBS在室温下具有不同的载玻片染色缸洗载玻片，振摇。
- 由具有含70％，90％和100％的乙醇分离载玻片染色罐制备乙醇脱水系列。
- 传送滑动到每个罐3分钟，开始用70％乙醇，然后90％乙醇中，然后加入100％乙醇。完成后，将乙醇罐在-20℃。
- 通过点击过量的乙醇到纸巾上，并以35度角支撑幻灯片允许的幻灯片风干。干燥后，马RK 18×18毫米面积上用金刚石笔幻灯片的后面杂交。
- 变性幻灯片鱼
- 适用于120微升70％去离子甲酰胺/ 2×SSC为24 x 60毫米盖玻片。触摸滑动盖玻片。变性的滑动，在80℃的热板上进行90秒。
- 很快，小心滑出盖玻片，并放置在冰冷的70％乙醇中的幻灯片为3分钟，接着进行90％乙醇和100％乙醇中各3分钟。使载玻片在空气中干燥。
- 由衬塑料盒，密封的盖子，湿纸巾准备湿热试验箱。该文件应该是潮湿，但不饱和水。
- 在潮湿的室内，申请步骤4.1.3预退火探针混合物来标记的区域在幻灯片上，盖上一个18×18毫米盖玻片，并在37℃1小时。
- 后孵化淘
- 预温50％甲酰胺/ 2×SSC，1×SSC，以及4x SSC / 0.1％吐温20的45°;水浴。
- 小心取出盖玻片，并在预热的50％甲酰胺/ 2×SSC 3xfor 5分钟洗载玻片每个在黑暗和摇晃。在预热的1×SSC中洗幻灯片3xfor每次5分钟，摇晃。最后，洗玻片在预热的4倍的SSC / 0.1％Tween-20的3xfor每次5分钟。
- 染色玻片3分钟的DAPI在避光载玻片染色缸。
- 洗幻灯片5分钟的2X SSC，颤抖。申请35微升的Mowiol安装介质，覆盖24×60毫米的盖玻片，并存储在幻灯片在4℃下。
染色体的5微观分析
- 分析使用的是标准的落射荧光显微镜中期幻灯片。使用一种成像平台与自动阶段如METASYSTEMS Metafer平台，以获得最佳效果。对于每个中期扩展，收集一个图像为DAPI荧光可视化的染色体，并用于从端粒P上的荧光信号的一个图像长袍。 （ 例如 ，Cy3标记的其他荧光剂是可用的，并同样很好地工作。）
- 用图像分析程序叠加图像，并分析。
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Representative Results
从一个细胞衍生中期染色体应形成包含40条染色体（如果使用小鼠细胞）（ 图1A）的离散簇。每个染色体具有着丝点的一端，它是作为一个淡蓝色球体可见。在正常的染色体，2端粒信号被视为在染色单体和两个信号由每个着丝粒的末端。间期核将存在于滑动为好。这些将作为蓝色球体，用红色端粒信号，但是没有稠染色体（例如，参见图1B）中可见。在间期核中，可以忽略用于定量基因组不稳定性的目的。
可以观察到许多不同类型的染色体畸变的。染色体断裂是在两条姐妹染色单体组成每个中期染色体中的一个中断。他们可以当研究者看到一个不连续的单一端粒信号的一个染色单体，或损失从一端Ø攻入发染色体（参见图1B中的示例）。染色体断裂识别通过寻找端粒信号的损失从染色体中（例如，在图1C）的一端。在一些情况下，染色体的断裂端部可以观察到，与在同一个中期扩展端粒信号的片段（如在图1C的情况下）。在其他情况下，该染色体端可以不存在。
几种类型的染色体重排的可观察到的。径向染色体采取许多形式，其特征在于包括两条染色体复杂重排（三个例子示出在图1D红色箭头）。径向染色体也包括更复杂的重排，包括三个或更多的染色体。染色体也可能成为连接形成双着丝粒染色体，其显示为一个终端到终端的融合染色体着丝粒的两端（用白色箭头在图1D <示/ STRONG>）。罗伯逊易位是一种类型的两个染色体着丝粒，这似乎是连接到一个单一的着丝粒（ 见图1E）四姐妹染色单体之间的武器易位。
图1F示出了不具有端粒信号存在 于中期。端粒信号的缺席可以发生从在杂交过程中探针制备或气泡在盖玻片的错误。
在小鼠B细胞图1染色体畸变作为可视化用PNA端粒鱼。 A）在中期正常小鼠B细胞的染色体结构。 40染色体是可见的，与两端。 二）2端粒信号的细胞显示两个染色单体断裂（绿色箭头）。C） ）。D）显示3径向染色体（红色箭头）和一个双着丝粒染色体（白色箭头）。 五）中期扩展了一条染色体与罗伯逊易位的细胞（黄色箭头）F）发生故障的杂交的一个例子，示出染色体没有端粒信号。比例尺代表10微米的每个图像。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
而活化的B淋巴细胞是特别适合于制备的有丝分裂染色体涂抹物，其它类型的细胞也可使用。 T淋巴细胞有许多共同的B细胞的优点，因为它们可以从脾或淋巴结进行纯化，并具有高的有丝分裂指数，当由生长在含有适当的促细胞分裂剂8中等刺激。是胚胎干细胞（ES细胞），也适合于中期染色体分析9。如果这些都无法使用，成纤维细胞可以使用，虽然用秋水仙胺更长的治疗（ 例如 ，16小时以秋水仙胺时为10纳克/毫升最终浓度）被固定之前被推到陷阱更多的细胞分裂中期。
我们发现，制备中期的一致性价差大大滴加固定染色体中的受控湿度腔室如Thermotron的CDS-5细胞遗传学干燥室容易，但它有可能获得良好的结果的whILE在根据实验室环境的湿度和温度的替补工作。获得可靠的结果，最好是从每个样品至少100个中期分裂得分染色体畸变。由于手动成像在每个通道的每个中期可以费力的过程中，我们获得了使用METASYSTEMS Metafer4自动化显微系统，它可以迅速找到准确的扫描大量中期染色体中期分裂。
标记端粒探针中期染色体分析是理想的测量染色体和染色体断裂和端粒信号也有助于复杂的染色体重排等融合和径向结构鉴定。固定中期染色体用Giemsa溶液的染色也适用于定量染色体畸变，并提供不需要的荧光显微镜10的优点。标记端粒与pantelomeric PNA探针延伸响ë可量化，通过使端粒融合，而产生，例如，在细胞内从DNAPKcs敲除小鼠11的识别染色体畸变。 PNA-FISH也可用于测量端粒异常的频率，包括染色体的端粒重复和染色体端粒损耗12,13。端粒信号的损失可以通过端粒缩短，以及由染色体断裂而引起。 PNA-FISH可使用Q-FISH（定量FISH）14灵敏测量端粒长度。
细胞缺乏不同的DNA修复活动往往积累不同类型的染色体畸变。例如，缺失的DNA损伤应答因子53BP1，导致染色体的累积破坏15。相比之下，复合径向染色体结构比例高在细胞缺乏BRCA1 4观察。这些染色体重排在他们确切的结构多种多样，但总是从两个或多个染色体涉及融合的材料。当细胞具有非常高的水平的基因组不稳定性的，例如用高剂量的药物，导致DNA断裂治疗后发生时，它变得越来越难以得分个体染色体畸变，这使限制在实验的动态范围。
染色体断裂和重排的中期扩展量化是用于测试特定的基因是否有在DNA修复中的作用非常有用。在使用中期染色体分析用于此目的的一个潜在的问题是，缺乏DNA修复活性的细胞不能正常生长。如果修复缺陷的细胞没有达到中期，调解DNA修复基因的重要性可能被低估。例如，RNF8 - / -细胞，这是受到p53依赖性的衰老，表现出染色体不稳定的温和水平，而RNF8 - / - P53 - / -双敲除细胞显示马纽约更染色体畸变，因为缺失p53基因可以更好细胞生长16。因此重要的是配对的染色体不稳定性的测量结果与细胞周期分析，表明基因敲除的细胞群也能正常生长，并且包含有丝分裂细胞的有意义的比例。
基因组不稳定性的观察本身并不深入了解由特定基因提供了一种修复活性的确切功能，但只作为一个起点，更机理研究。最后，虽然这种方法是测量染色体断裂和复杂的重排是有用的，使用mFISH或天空被推荐用于定量染色体易位。这些技术也开始与中期染色体的价差，但用探针的混合物即“画图”每条染色体有荧光的特定组合。无论这些技术被推荐用于测定染色体instab的全谱能性修复缺陷的细胞。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R00 CA160574（SFB）和由罗格斯大学生物技术培训计划（到SMM）的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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