Summary
DNA-reparation veje er afgørende for opretholdelse af genomisk integritet og forhindre mutation og kræft. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet ved direkte observation af kromosomafvigelser i metafasespredninger fra muse-B-celler ved hjælp af fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) til telomeriske DNA gentagelser.
Abstract
Defekt DNA-reparation fører til øget genomisk ustabilitet, som er den egentlige årsag til mutationer, der fører til tumorigenese. Analyse af hyppighed og type af kromosomafvigelser i forskellige celletyper tillader defekter i DNA-reparation veje til at blive belyst. Forståelse pattedyr DNA-reparation biologi er blevet stærkt hjulpet af produktion af mus med huller i specifikke gener. Målet med denne protokol er at kvantificere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Mærkning af telomerer anvender PNA-FISH prober (peptidnukleinsyreenheder - fluorescerende in situ hybridisering) letter hurtig analyse af genomisk instabilitet i metafase kromosom opslag. B-celler har specifikke fordele i forhold til fibroblaster, fordi de har normal ploiditet og en højere mitotisk indeks. Kortsigtet kultur af B-celler muliggør derfor præcis måling af genomisk instabilitet i en primær celle befolkning, der er tilbøjelige til at have færre sekundær genetisk mutations, end hvad der typisk findes i transformerede fibroblaster eller patientens cellelinier.
Introduction
Kræft er forårsaget af ophobning af mutationer påvirker gener, som regulerer normal cellevækst. Mutation er en konsekvens af ændringer i strukturen og rækkefølgen af genomet forårsaget af skader på DNA. DNA-beskadigelse kan forekomme gennem en række, herunder exogene midler, såsom ioniserende stråling, og som et biprodukt af normal cellulær metabolisme, såsom spontan deaminering af nukleotidbaser eller skader, der forekommer ved kontakt med reaktive oxygenarter 1.
Selv pattedyrceller i besiddelse af en række reparations aktiviteter, der kan vende DNA skader eller genoprette sekvensen ved brud steder, mutationer alligevel ophobes i hele deres levetid af en celle. DNA-skader kan desuden bidrage til fremadskridende alderdom og tab af styrke af stamceller, to processer, der er forbundet med aldring-associeret sygdom 2. Forståelse reparation af DNA-skader er derfor af central betydning i håndteringen to tegnvæsentlig in dvirknin g spørgsmål i folkesundheden. Stigende tyder på, at pattedyr DNA-reparation veje kan bidrage til udviklingen af kræft cellegenomet 3,4, hvilket gør det endnu mere nødvendigt at forstå de involverede i at undertrykke mutation på det molekylære niveau processer.
Direkte visualisering af kromosomafvigelser er en kraftfuld og kvantitative midler til at bestemme omfanget af genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserede kromosomer fra celler ved metafase kan isoleres og inspiceres ved hjælp af lys eller fluorescerende mikroskopi. Sådanne cytogenetiske tilgange har været i praksis i flere årtier og kan anvendes til at påvise forekomsten af translokationer eller specifikke typer kromosomafvigelser forbundet med tab af DNA reparation aktiviteter. Protokollen egner sig til flere potentielle udvidelser kromosomerne kan mærkes med prober for spektral karyotypering (SKY) eller flerfarvet fluorescerende in situ-hybridisering(MFISH) for at identificere omplantning 5,6. Disse teknikker gør det også muligt hyppigheden af kromosom translokationer og strukturen af komplekse kromosom translokationer, der skal bestemmes, som giver yderligere oplysninger ud over, hvad der er muligt med denne protokol. Alternativt kan sekvensspecifikke prober genereres og anvendes til at teste hyppigheden af DNA-brud på udvalgte genomiske steder 7.
I denne protokol, vi beskriver fremstilling af metafase kromosom spreder sig fra B-lymfocytter. En fluorescens-mærket peptid-nukleinsyre (PNA) probe til telomer gentagelser anvendes, som effektivt markerer telomerer i metafase kromosom spreder Denne protokol har flere fordele. B-celler kan induceres til at vokse ved høje Mitoseindekset så høj kvalitet smørematerialer kan konsekvent fremstilles. B-celler fra genetisk modificerede mus er også langt mindre tilbøjelige til at indeholde sekundære genetiske mutationer, der kan forvirre analysen af bidragetspecifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilgang kan afsluttes på én dag, og giver mulighed for mere præcis scoring af kromosombrug. Ved at bruge denne fremgangsmåde, især i kombination med særligt udstyr, der er beskrevet i denne protokol, er det muligt at fremstille meget konsekvent høj kvalitet spænd og hurtigt analysere hastigheden og typen af genomisk ustabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Rutgers, State University of New Jersey. Musene blev behandlet i overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Forskere bør konsultere deres nationale og institutionelle animalske organisationer for etablerede og godkendte retningslinjer.
Inden du begynder, forberede de løsninger, der er anført i tabel 1.
1. B celleisolering og aktivering
Aflive en mus ved hjælp af CO 2 efterfulgt af cervikal dislokation. Anbring musen så den venstre side af kroppen er op og spray mus med 70% ethanol, indtil pelsen er fugtig. Dissekere milt og sted i en 35 mm vævsdyrkningsskål med 2 ml vaskebuffer. I en laminær strømning, forsigtigt bryde op milten i vævsdyrkningsskål ved hjælp af den flade ende af en 5 ml sprøjte.
- Indsæt en 70 um nylonnet i en 50ml rør og overføre milt prøve i 2 ml vaskepuffer i nylonnet. Forstyrre forsigtigt milten i nettet ved hjælp af den flade ende af sprøjten.
- Skyl bagsiden af sprøjten og 35 mm plade med 8 ml vaskebuffer og filtreres gennem 70 um nylonnet. Der centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer og kassér supernatanten, og pellet resuspenderes i 3 ml ACK lysisbuffer. Pipette op og ned kortvarigt at forstyrre klumper og inkuberes i 5 min. Der tilsættes 10 ml vaskebuffer og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer og kassér supernatanten, og pellet resuspenderes ved at trykke på bunden af røret så ved pipettering i 1 ml vaskebuffer. Der tilsættes 50 ul af anti-CD43 MACS mikro-kugler, og der inkuberes på is i 30 minutter. Tilsæt 10 ml vaskepuffer, bland forsigtigt og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Tilsæt 10 ml vaskepuffer, bland forsigtigt og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Opsætning af enMini-MACS kolonne ved at placere en kolonne på den MACS magnet. Anbring et mærket 15 ml konisk rør under kolonnen. Der tilsættes 1 ml vaskebuffer kolonne og tillade at køre igennem til 15 ml rør.
- Aspirer supernatanten og resuspender i 1 ml vaskebuffer. Indlæs prøven i kolonnen efter vask bufferen er løbet igennem.
- Efter at prøven er løbet igennem søjlen, tilsættes 1 ml vaskebuffer for at vaske kolonnen. Tilføj 7 ml vaskebuffer direkte til den indsamlede prøve i 15 ml rør.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Overfør den nødvendige mængde af celler, der er nødvendige til 5.000.000 celler / brønd i et 50 ml rør. Der centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Supplement B-celle-medium med LPS 1: 500 og IL4 1: 1.000.
- Aspirer supernatanten og tilsæt den passende mængde suppleret B cellemedium nødvendig for endelig koncentration på 1.000.000 celler / ml.
- Plate celler i 6-brønds plader med 5 ml celler ved 1.000.000 celler / ml og sted i en humidified cellekultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
2. B-celle Fiksering
- Der tilsættes 50 ul colcemid til brønden indeholdende 5 ml af B-celler (til en slutkoncentration på 100 ng / ml) og inkuber i 1 time ved 37 ° C. Forvarm 75mM KCI-opløsning i et 37 ° C vandbad. Overfør B-celler til et mærket 15 ml rør. Dæk mærket med tape og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten forlader 1 ml i slangen og pellet resuspenderes ved pipettering. Der tilsættes 5 ml forvarmet KCl dråbe for dråbe, mens trykke eller pulserende på en hvirvel.
- Der tilsættes 10 ml KCl og blandes ved at vende. Inkuberes i et 37 ° C vandbad i 15 min. Tilsæt 5 dråber frisk fiksativ og blandes ved at vende. Der centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forlader 1 ml i slangen og resuspender pellet ved at pipettere op og ned.
- Der tilsættes 5 ml frisk fiksativ dråbe for dråbe, mens trykke eller pulserende på en VORtex. Tilføj yderligere 10 ml fixativ og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forlader 1 ml i rør og resuspender ved pipettering. Tilføj 14 ml frisk fiksativ og centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Gentag trin 2.7 to gange mere.
- Tilføj 14 ml frisk fiksativ. Forsegl hætter med Parafilm og opbevares natten over ved -20 ° C.
3. Fremstilling af Metafase Kromosomfejl Spreads
- Indstil en reguleret miljøkammer til 22,9 ° C og 52% fugtighed.
- Centrifuger faste B-celler ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Aspirer fiksativ efterlader 70 gl i røret og resuspender ved pipettering.
- Placer mærkede dias i fugtigt kammer ved en 35 ° vinkel. Drop 35 pi af de resuspenderede B-celler på et dias og slip to dias per prøve. Lad objektglassene tørre i fugtigt kammer i 30 min derefter gemme diasi et dias kasse ved 37 ° C.
4. telomer PNA FISH
- Fremstilling af probe
- Pre-varme deioniseret formamid til 37 ° C. Bland 2 pi telomer PNA-probe med 7 ul deioniseret foropvarmede formamid og inkuberes ved 37 ° C med omrystning i 1 time.
- Pre-varme FISK masterblanding til 37 ° C. Tilføj 7 pi forvarmet FISK mastermix til blandingen fra trin 4.1.1 og inkuber ved 37 ° C i 1-3 timer.
- Denaturer sonden blanding i 8 minutter ved 80 ° C. Pre-anneale sonden i 1 time ved 37 ° C.
- Forbehandling af kromosompræparater
- Pre-varme en glasplade-farvning krukke i et vandbad indeholdende 50 ml 0,01 M HCI til 37 ° C.
- Glassene anbringes i et andet objektglas-farvning krukke indeholdende 2 x SSC i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 2 ul pepsin materiel til den forvarmet glas slide-farvning krukke og blandes ved at vende. Overfør dias til dette glas slide-farvning krukke og inkuber 90 sekunder ved 37 ° C.
- Vask objektglassene 2x i en anden glasplade-farvning krukke indeholdende 1x PBS i 5 minutter hver ved stuetemperatur, ryster. Derefter vaskes objektglassene i 5 minutter i 1x PBS / MgCl2 ved stuetemperatur, ryster.
- Overfør objektglassene til et objektglas-farvning krukke indeholdende frisk fremstillet 1% formaldehyd / 1x PBS / MgCl2 i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask præparatglassene i 5 minutter i et andet objektglas-farvning krukke indeholdende 1x PBS ved stuetemperatur, ryster.
- Forbered en ethanol dehydrering serie ved at have separat glas slide-farveskålene indeholdende 70%, 90% og 100% ethanol.
- Overfør objektglassene til hver krukke i 3 minutter, startende med 70% ethanol, derefter 90% ethanol og derefter 100% ethanol. Placer ethanol krukker ved -20 ° C, når du er færdig.
- Lad objektglassene lufttørre ved at trykke overskydende ethanol på et stykke køkkenrulle og magten dias ved en 35 ° vinkel. Når det er tørt, maRK en 18 x 18 mm område for hybridisering på bagsiden af objektglas med en diamant pen.
- Denaturering af Slides for fisk
- Påfør 120 ul 70% deioniseret formamid / 2X SSC til en 24 x 60 mm dækglas. Tryk på dias til dækglasset. Denaturere objektglas ved 80 ° C på en varmeplade i 90 sek.
- Hurtigt og forsigtigt glider dækglasset og placere dias i iskold 70% ethanol i 3 minutter, efterfulgt af 90% ethanol og 100% ethanol hver i 3 min. Lad dias lufttørre.
- Forbered et fugtigt kammer ved foring en plastboks med et stramt låg og vådt silkepapir. Papiret skal være fugtig, men ikke mættet med vand.
- I et fugtigt kammer, anvende pre-udglødet probe mix fra trin 4.1.3 til det markerede område på objektglasset, dække med en 18 x 18 mm dækglas og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Post-inkuberingstider Vasker
- Pre varm 50% formamid / 2 x SSC, 1 x SSC, og 4x SSC / 0,1% Tween-20 i en 45 °; C vandbad.
- Fjern forsigtigt dækglas og vaske dias i forvarmet 50% formamid / 2x SSC 3xfor 5 min hver i mørke og ryste. Vask dias i forvarmet 1x SSC 3xfor 5 minutter hver, ryster. Endelig vaskes objektglassene i forvarmet 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 minutter hver.
- Farv dias i 3 minutter i DAPI i en lys beskyttet glas slide-farvning krukke.
- Vask dias i 5 min i 2 x SSC, ryster. Påfør 35 pi Mowiol montering medium, dække med 24 x 60 mm dækglas og gemme dias ved 4 ° C.
5. Mikroskopisk Analyse af kromosomer
- Analyser metafase objektglas med en standard epi-fluorescensmikroskop. Brug en billeddannelse platform med en automatiseret scene som MetaSystems Metafer platform til at opnå de bedste resultater. For hver metafasespredning, indsamle et billede for DAPI fluorescens at visualisere kromosomer, og et billede for det fluorescerende signal fra telomer skåbe. (Fx er Cy3- andre fluoratorer tilgængelige og virker lige godt.)
- Overlay billeder med et billede analyseprogram og analysere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metafasekromosomer afledt fra en celle skal danne en diskret klynge indeholder 40 kromosomer (hvis der anvendes museceller) (figur 1A). Hvert kromosom har en centromer i den ene ende, som ses som en lys blå kugle. I normale kromosomer er to telomere signaler ses i slutningen af kromatider og to signaler ved hver centromer. Interfasen kerner vil være til stede på diaset så godt. Disse vil være synlig som blå kugler, med røde telomer signaler, men ingen kondenserede kromosomer (se for eksempel figur 1B). Interfasen kerner kan ignoreres med henblik på at kvantificere genomisk ustabilitet.
Der kan konstateres en række forskellige typer af kromosomafvigelser. Chromatid pauser er pauser i en af de to søsterkromatider der udgør hver metafase kromosom. De kan scores hvis investigator ser en diskontinuitet i ét kromatid eller tab af et enkelt telomer-signal fra den ene ende ofa kromosomet (se eksempler i figur 1B). Kromosombrug identificeres ved at lede efter tab af telomer signaler fra den ene ende af et kromosom (eksempel i figur 1C). I nogle tilfælde kan den brudte ende af kromosom iagttages som et fragment med telomer signaler i samme metafasespredning (som det er tilfældet i figur 1C). I andre tilfælde kan kromosom ende ikke være til stede.
Flere typer kromosomomlejringer kan observeres. Radiale kromosomer tage en række former, karakteriseret ved komplekse omlejringer involverer to kromosomer (tre eksempler er vist med røde pile i figur 1D). Radiale kromosomer også mere komplekse omrokeringer, der involverer tre eller flere kromosomer. Kromosomer kan også blive forenet til at danne dicentric kromosomer, der vises som en ende-til-ende fusion af kromosomer med centromerer i begge ender (vist med en hvid pil i figur 1D </ Strong>). Robertsonian translokationer er en type af translokation mellem centromerer to kromosomer, der vises som fire søsterkromatid arme knyttet til et enkelt centromer (ses i figur 1E).
Figur 1F viser en metafase, der ikke har telomer signaler til stede. Fravær af telomer signaler kan opstå af fejl i forbindelse med udarbejdelsen probe eller luftbobler i dækglasset under hybridisering.
Figur 1. Kromosomfejl hos mus B-celler, som visualiseret ved PNA telomer fisk. A) kromosom struktur af en normal mus B-celle ved metafase. 40 kromosomer er synlige, med to telomer signaler i hver ende. B) En celle, der viser to kromatid pauser (grønne pile). C) D) En celle viser 3 radiale kromosomer (røde pile) og en dicentric kromosom (hvid pil). E) en metafasespredning med et kromosom med en Robertsonian translokation (gul pil ). F) Et eksempel på en mislykket hybridisering viser kromosomer uden telomer signaler. Skalaen søjle repræsenterer 10 um i hvert billede. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betragtninger aktiverede B-lymfocytter er særligt velegnede til fremstilling af mitotiske kromosom opslag, kan andre celletyper også anvendes. T-lymfocytter deler mange af fordelene ved B-celler, som de kan oprenses fra milt eller lymfeknuder, og har et højt mitotisk indeks, når de stimuleres ved vækst i medium indeholdende passende mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også velegnet til metafase kromosomanalyse 9. Hvis disse ikke er tilgængelige, kan fibroblastceller anvendes, selv om en længere behandling med colcemid (fx 16 timer med colcemid i en endelig koncentration på 10 ng / ml) anbefales at fælde flere celler i metafase før fiksering.
Vi finder, at sammenhængen i udarbejdelsen af metafasespredninger lettes meget ved at droppe de faste kromosomer i et kontrolleret fugtighed kammer såsom Thermotron CDS-5 Cytogenetic tørrekammerets, men det er muligt at opnå gode resultater while arbejder på en bænk afhængigt af fugtigheden og temperaturen i laboratoriet miljøet. For at opnå pålidelige resultater, er det tilrådeligt at score kromosomafvigelser fra mindst 100 metafaseceller pr prøve. Da processen manuelt afbilde hver metafase i hver kanal kan være besværlig, vi opnår metafaser bruger Metasystems Metafer4 automatiseret mikroskopi-system, der hurtigt kan finde og præcist at scanne et stort antal metafasekromosomer.
Analyse af metafasekromosomer mærket med telomer sonder er ideel til måling af kromosom og kromatidtypen pauser, og telomeren signalerne også støtte identifikationen af komplekse kromosomomlejringer såsom fusioner og radiale strukturer. Farvning af faste metafasekromosomer med Giemsa-opløsning er også egnet til kvantificering af kromosomafvigelser, og har den fordel, at den ikke kræver fluorescensmikroskopi 10. Mærkning telomerer med en pantelomeric PNA-probe udvider ringedee af kromosomafvigelser, som kan kvantificeres, ved at tillade identifikation af telomer fusioner, der opstår, for eksempel i celler fra DNAPKcs-knockout-mus 11. PNA-FISH kan også anvendes til at måle frekvensen af telomer abnormiteter, herunder kromosom telomer gentagelser og kromatid telomer tab 12,13. Tab af en telomer signal kan være forårsaget af telomer afkortning samt ved kromosombrud. PNA-FISH kan bruges til følsomt måle telomer længde ved hjælp af Q-fisk (kvantitativ FISK) 14.
Celler, der mangler de forskellige DNA-reparation aktiviteter tendens til at akkumulere forskellige typer af kromosomafvigelser. For eksempel mangel på DNA beskadigelse respons faktor 53BP1, fører til ophobning af kromosom bryder 15. Derimod er en høj andel af komplekse radial kromosom strukturer observeret i celler, der mangler BRCA1 4. Disse kromosomomlejringer er varierede i deres rigtige struktur,men altid involverer fusion af materiale fra to eller flere kromosomer. Når celler har meget høje niveauer af genomisk ustabilitet, som for eksempel ses efter behandling med høje doser af stoffer, der forårsager DNA-brud, bliver det stadig vanskeligere at score individuelle kromosomafvigelser, hvilket lægger en grænse for det dynamiske område af forsøget.
Kvantificering af kromosombrug omlejringer i metafasespredninger er nyttig til at teste, om specifikke gener spiller en rolle i DNA-reparation. Et potentielt problem ved anvendelse metafase kromosomanalyse til dette formål er, at celler, som mangler DNA-reparation aktiviteter, der ikke kan vokse normalt. Hvis reparation-manglende celler ikke nå metafase, kan betydningen af et gen for mediering af DNA-reparation undervurderes. For eksempel RNF8 - / - celler, som er genstand for p53-afhængige aldring, viser et beskedent niveau af kromosom ustabilitet, hvorimod RNF8 - / - p53 - / - dobbelt-knockout celler viser maNY mere kromosomafvigelser, fordi sletning af p53 tillader bedre cellevækst 16. Det er derfor vigtigt at parre målinger af kromosom ustabilitet med et cellecyklus assay at vise, at knockout cellepopulationer kan vokse normalt og indeholder en meningsfuld del af mitotiske celler.
Observationen af genomisk instabilitet ikke i sig selv give et indblik i den præcise funktion af en reparation aktivitet fra et specifikt gen, men blot fungerer som udgangspunkt for mere mekanistiske undersøgelser. Endelig, selv om denne fremgangsmåde er nyttig til måling af kromosombrug og komplekse omarrangeringer, anbefales brug af mFISH eller SKY til kvantificering kromosom translokationer. Disse teknikker også begynde med metafase kromosom opslag, men bruger en cocktail af sonder, at "male" hvert kromosom med en bestemt kombination af fluoroforer. Hver af disse teknikker er anbefalet til at måle det fulde spektrum af kromosom instability i reparation-manglende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud R00 CA160574 (SFB) og ved et fællesskab af Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
