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Immunology and Infection

PNA मछली द्वारा माउस बी लिम्फोसाइटों में क्रोमोजोम aberrations के तेजी से विश्लेषण

Published: August 19, 2014 doi: 10.3791/51806
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers, the State University of New Jersey

Summary

डीएनए की मरम्मत रास्ते जीनोमिक अखंडता के रखरखाव और रोकने उत्परिवर्तन और कैंसर के लिए आवश्यक हैं. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मेटाफ़ेज़ telomeric डीएनए दोहराता के लिए स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट का उपयोग माउस बी कोशिकाओं से फैलता में गुणसूत्र aberrations का प्रत्यक्ष अवलोकन से जीनोमिक अस्थिरता यों है.

Abstract

दोषपूर्ण डीएनए की मरम्मत tumorigenesis है कि नेतृत्व परिवर्तन के मूल कारण है जो जीनोमिक अस्थिरता, वृद्धि की ओर जाता है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में आवृत्ति और गुणसूत्र aberrations के प्रकार के विश्लेषण से डीएनए की मरम्मत रास्ते में दोष स्पष्ट किए जाने की अनुमति देता है. समझौता स्तनधारी डीएनए की मरम्मत जीव विज्ञान बहुत विशिष्ट जीन में knockouts के साथ चूहों के उत्पादन से मदद की गई है. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य माउस बी लिम्फोसाइटों में जीनोमिक अस्थिरता यों है. PNA मछली जांच (पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड - स्वस्थानी संकरण में फ्लोरोसेंट) का उपयोग telomeres की लेबलिंग मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र फैलता में जीनोमिक अस्थिरता के तेजी से विश्लेषण की सुविधा. वे सामान्य ploidy और एक उच्च mitotic सूचकांक है क्योंकि बी कोशिकाओं, fibroblasts के सापेक्ष विशिष्ट लाभ है. बी कोशिकाओं की अल्पकालिक संस्कृति इसलिए कम माध्यमिक आनुवंशिक उत्परिवर्तन होने की संभावना है जो एक प्राथमिक सेल की आबादी में जीनोमिक अस्थिरता की सटीक माप सक्षम बनाता हैआम तौर पर तब्दील fibroblasts या रोगी सेल लाइनों में पाया जाता है की तुलना में क्या है.

Introduction

कैंसर सामान्य कोशिकाओं की वृद्धि को नियंत्रित करने वाले जीन को प्रभावित उत्परिवर्तन के संचय के कारण होता है. उत्परिवर्तन डीएनए को नुकसान के कारण जीनोम की संरचना और अनुक्रम में परिवर्तन का परिणाम है. डीएनए की क्षति ऐसे विकिरण के रूप में exogenous एजेंट सहित प्रक्रिया की एक किस्म के माध्यम से हो सकते हैं, और इस तरह के प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 1 के साथ संपर्क से होने वाली न्यूक्लियोटाइड अड्डों या नुकसान का सहज deamination के रूप में सामान्य सेलुलर चयापचय, के द्वारा एक उत्पाद के रूप में.

स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए की क्षति रिवर्स या तोड़ स्थलों पर अनुक्रम बहाल कर सकते हैं जो मरम्मत गतिविधियों की एक श्रृंखला के अधिकारी हालांकि, म्यूटेशन फिर भी एक सेल का जीवन भर संचित. डीएनए की क्षति इसके अलावा, उम्र बढ़ने जुड़े रोग 2 के साथ जुड़े रहे हैं जो दो प्रक्रियाओं बुढ़ापा और स्टेम कोशिकाओं की शक्ति के नुकसान के लिए योगदान कर सकते हैं. दो हस्ताक्षर के समाधान में इसलिए केंद्रीय महत्व का डीएनए क्षति की मरम्मत को समझनासार्वजनिक स्वास्थ्य में ificant मुद्दों. बढ़ती सबूत स्तनधारी डीएनए की मरम्मत रास्ते यह और भी जरूरी आणविक स्तर पर उत्परिवर्तन दबाने में शामिल प्रक्रियाओं को समझने के लिए कर रही है, कैंसर सेल जीनोम 3,4 के विकास में योगदान कर सकते हैं कि पता चलता है.

गुणसूत्र aberrations के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए एक विशेष सेल प्रकार में जीनोमिक अस्थिरता की सीमा निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली और मात्रात्मक साधन है. मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं से संघनित गुणसूत्रों पृथक और प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग का निरीक्षण किया जा सकता है. इस तरह सितोगेनिक क दृष्टिकोण कई दशकों के लिए अभ्यास में किया गया है और अनुवादन या डीएनए की मरम्मत की गतिविधियों के नुकसान के साथ जुड़े गुणसूत्र aberrations के विशिष्ट प्रकार की उपस्थिति का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल कई संभावित एक्सटेंशन को उधार देता है: गुणसूत्रों स्वस्थानी संकरण में वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) या बहुरंगा फ्लोरोसेंट के लिए जांच के साथ लेबल किया जा सकता(MFISH) अनुवादन 5,6 की पहचान करने के लिए. इन तकनीकों में भी इस प्रोटोकॉल के साथ क्या हो सकता है परे अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है जो गुणसूत्र अनुवादन की आवृत्ति और निर्धारित किया है जटिल गुणसूत्र अनुवादन की संरचना, सक्षम. वैकल्पिक रूप से, अनुक्रम विशेष जांच उत्पन्न और चयनित जीनोमिक साइटों 7 में डीएनए टूटना की आवृत्ति परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र की तैयारी बी लिम्फोसाइट से फैलता वर्णन. Telomeric दोहराता के लिए एक fluorescently लेबल पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (PNA) जांच कुशलता मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र में telomeres के निशान है, जो प्रयोग किया जाता है इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं फैलाता है. बी कोशिकाओं उच्च गुणवत्ता फैलता लगातार उत्पादन किया जा सकता है, ताकि उच्च mitotic सूचकांक में विकसित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से बी कोशिकाओं को भी बहुत कम योगदान का विश्लेषण उलझाना सकता है कि माध्यमिक आनुवंशिक परिवर्तन शामिल होने की संभावना हैंजीनोमिक अखंडता के विशिष्ट जीन. PNA मछली दृष्टिकोण एक दिन में पूरा कर लिया है, और गुणसूत्र टूट की अधिक सटीक स्कोरिंग की अनुमति देता जा सकता है. विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल में वर्णित विशिष्ट उपकरणों के साथ संयोजन में, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह बहुत संगत, उच्च गुणवत्ता वाले फैलता उत्पादन और तेजी से दर और जीनोमिक अस्थिरता के प्रकार का विश्लेषण करने के लिए संभव है.

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Protocol

यह प्रक्रिया रटगर्स में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, न्यू जर्सी के राज्य विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था. चूहे प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए एनआईएच गाइड के अनुसार इलाज किया गया. वैज्ञानिकों की स्थापना की और अनुमोदित दिशा निर्देशों के लिए अपने राष्ट्रीय और संस्थागत पशु संगठनों से परामर्श करना चाहिए.

शुरुआत से पहले, 1 टेबल में सूचीबद्ध समाधान तैयार करते हैं.

1 बी सेल अलगाव और एक्टिवेशन

ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 का उपयोग कर एक माउस euthanize. शरीर के बाईं ओर ऊपर है तो माउस की स्थिति और फर नम है जब तक 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे. 2 मिलीलीटर धो बफर के साथ एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान में तिल्ली और जगह काटना. एक लामिना का प्रवाह हुड में, धीरे से एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का फ्लैट अंत का उपयोग टिशू कल्चर पकवान में तिल्ली टूट गया.

  1. एक 50 में एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल डालेंमिलीलीटर ट्यूब और नायलॉन जाल में 2 मिलीलीटर धो बफर में तिल्ली नमूना हस्तांतरण. धीरे सिरिंज का फ्लैट अंत का उपयोग कर के जाल में तिल्ली बाधित.
  2. धोने बफर के 8 मिलीलीटर के साथ सिरिंज के पीछे और 35 मिमी प्लेट कुल्ला और 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से फिल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र.
  3. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला त्यागने और एसीके lysis बफर के 3 मिलीलीटर में गोली resuspend और. गुच्छों को बाधित और 5 मिनट के लिए सेते करने के लिए नीचे संक्षेप में ऊपर पिपेट और. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर धो बफर और अपकेंद्रित्र के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धोने बफर के 1 मिलीग्राम में pipetting द्वारा फिर ट्यूब के नीचे दोहन द्वारा गोली resuspend और. विरोधी CD43 एमएसीएस सूक्ष्म मोती के 50 μl जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर, धोने बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें धीरे मिश्रण, और अपकेंद्रित्र. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर, धोने बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें धीरे मिश्रण, और अपकेंद्रित्र.
  5. स्थापितएमएसीएस चुंबक पर एक स्तंभ रखकर मिनी एमएसीएस स्तंभ. स्तंभ के नीचे एक लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्थिति. कॉलम को धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिलीलीटर ट्यूब के माध्यम से चलाने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. धोने बफर के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend aspirate. धोने बफर के माध्यम से चलने के बाद स्तंभ में नमूना लोड.
  7. नमूना स्तंभ के माध्यम से चलने के बाद, स्तंभ धोने के लिए 1 मिलीलीटर धो बफर जोड़ें. सीधे 15 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र नमूने को धोने बफर के 7 मिलीलीटर जोड़ें.
  8. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह / 5000000 कोशिकाओं के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र. LPS 1 के साथ पूरक बी सेल मध्यम: 500 और 1 IL4: 1,000.
  9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1,000,000 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए आवश्यक पूरक बी सेल के माध्यम से उचित मात्रा में जोड़ें.
  10. एक humidifi में 10,00,000 सेल / एमएल और स्थान पर कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों में प्लेट कोशिकाओं37 डिग्री सेल्सियस पर एड सेल कल्चर इनक्यूबेटर, 5% सीओ 2.

2 बी सेल फिक्सेशन

  1. अच्छी तरह से (100 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए) बी कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर युक्त और 37 डिग्री पर 1 घंटे सेते सेल्सियस तक colcemid के 50 μl जोड़ें. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में Prewarm 75 मिमी KCl समाधान. एक लेबल 15 मिलीलीटर ट्यूब बी कोशिकाओं स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर टेप और अपकेंद्रित्र के साथ लेबल कवर.
  2. ट्यूब में 1 मिलीलीटर छोड़ने पर तैरनेवाला Aspirate और pipetting द्वारा गोली resuspend. दोहन ​​या एक भंवर पर स्पंदन जबकि ड्रॉप द्वारा prewarmed KCl बूंद के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. KCl के 10 एमएल जोड़ें और inverting द्वारा मिश्रण. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं. Inverting द्वारा ताजा लगानेवाला और मिश्रण के 5 बूँदें जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ट्यूब और resuspend गोली में 1 मिलीलीटर छोड़ने पर तैरनेवाला aspirate.
  4. दोहन ​​या एक VOR पर स्पंदन जबकि ड्रॉप द्वारा ताजा लगानेवाला बूंद के 5 मिलीलीटर जोड़ेंटेक्स. लगानेवाला की एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र. Pipetting द्वारा ट्यूब और resuspend में 1 मिलीलीटर छोड़ने पर तैरनेवाला aspirate. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर ताजा लगानेवाला और अपकेंद्रित्र के 14 मिलीलीटर जोड़ें.
  6. दोहराएँ कदम 2.7 दो बार अधिक.
  7. ताजा लगानेवाला के 14 मिलीलीटर जोड़ें. Parafilm के साथ टोपी सील और -20 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दुकान.

मेटाफ़ेज़ क्रोमोजोम फैलता के 3 तैयारी

  1. 22.9 डिग्री सेल्सियस और 52% आर्द्रता के लिए एक विनियमित पर्यावरण कक्ष सेट करें.
  2. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर बी कोशिकाओं तय की. महाप्राण pipetting द्वारा ट्यूब और resuspend में 70 μl छोड़ने लगानेवाला.
  3. एक 35 डिग्री के कोण पर नमी कक्ष में लेबल स्लाइड रखें. एक स्लाइड पर resuspended बी कोशिकाओं के 35 μl ड्रॉप और नमूना प्रति दो स्लाइड ड्रॉप. 30 मिनट तो स्लाइड्स की दुकान के लिए स्लाइड आर्द्रता चैम्बर में सूखे की अनुमति दें37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में.

4 telomere PNA मछली

  1. जांच की तैयारी
    1. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म विआयनीकृत formamide. 7 μl विआयनीकृत पूर्व गर्म formamide साथ telomere PNA जांच के 2 μl मिक्स और 1 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म मछली मास्टर मिश्रण. कदम 4.1.1 से मिश्रण करने के लिए 7 μl पूर्व गरम मछली मास्टर मिश्रण जोड़ें और 1-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    3. 80 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए जांच मिश्रण denature. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जांच पूर्व पानी रखना.
  2. क्रोमोजोम स्लाइड्स के Pretreatment
    1. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस को 0.01 एम एचसीएल की 50 मिलीलीटर युक्त एक गिलास स्लाइड धुंधला जार पूर्व गर्म.
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2x एसएससी युक्त एक अलग गिलास स्लाइड धुंधला जार में रखें स्लाइड.
    3. पूर्व गर्म कांच स्लाइड धुंधला जार को पेप्सिन स्टॉक के 2 μl जोड़ें और inverting द्वारा मिश्रण. इस गिलास SL के लिए स्लाइड स्थानांतरणआईडीई धुंधला जार और 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 सेकंड सेते हैं.
    4. स्लाइड मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस युक्त एक अलग गिलास स्लाइड धुंधला जार में 2x धो लें. फिर मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस / 2 MgCl में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लो.
    5. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हौसले से तैयार 1% formaldehyde / 1x पीबीएस / 2 MgCl युक्त एक गिलास स्लाइड धुंधला जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण.
    6. मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस युक्त एक अलग गिलास स्लाइड धुंधला जार में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
    7. 70%, 90%, और 100% इथेनॉल युक्त अलग गिलास स्लाइड धुंधला जार होने से एक इथेनॉल निर्जलीकरण श्रृंखला तैयार करें.
    8. फिर 70% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, और फिर 100% इथेनॉल के साथ शुरू, 3 मिनट के लिए प्रत्येक जार करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण. जब समाप्त -20 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल जार रखें.
    9. एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त इथेनॉल दोहन और एक 35 डिग्री के कोण पर स्लाइड propping से शुष्क हवा के लिए स्लाइड की अनुमति दें. एक बार सूखा, माएक हीरे की कलम का उपयोग कर स्लाइड्स की पीठ पर संकरण के लिए एक 18 x 18 मिमी क्षेत्र आर.
  3. मछली के लिए स्लाइड का विकृतीकरण
    1. 24 x 60 मिमी coverslip के लिए 120 μl 70% विआयनीकृत formamide / 2X एसएससी लागू करें. Coverslip करने के लिए स्लाइड स्पर्श करें. 90 सेकंड के लिए एक हॉट प्लेट पर 80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड denature.
    2. जल्दी और ध्यान coverslip बंद स्लाइड और 3 मिनट के लिए 90% इथेनॉल द्वारा पीछा 3 मिनट, और 100% इथेनॉल प्रत्येक के लिए बर्फ ठंड 70% इथेनॉल में स्लाइड जगह. शुष्क हवा के लिए स्लाइड की अनुमति दें.
    3. एक तंग ढक्कन और गीले टिश्यू पेपर के साथ एक प्लास्टिक का डिब्बा अस्तर द्वारा एक नम कक्ष तैयार करें. कागज नम हो, लेकिन पानी से संतृप्त नहीं किया जाना चाहिए.
    4. एक उमस भरे कक्ष में, स्लाइड पर चिह्नित क्षेत्र के लिए कदम 4.1.3 से पूर्व annealed जांच मिश्रण लागू एक 18 x 18 मिमी कवर पर्ची के साथ कवर और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. बाद के ऊष्मायन Washes
    1. पूर्व गर्म 50% formamide / 2x एसएससी, 1x एसएससी, और 4x एसएससी / 0.1% बीच 20 एक 45 डिग्री में; सेल्सियस पानी के स्नान.
    2. ध्यान से coverslips निकालें और अंधेरे और झटकों में पूर्व गर्म 50% formamide / 2x एसएससी 3xfor 5 मिनट में प्रत्येक स्लाइड धो लो. मिलाते हुए, 3xfor 5 मिनट पूर्व गर्म 1x एसएससी में प्रत्येक स्लाइड धो लें. अंत में, पूर्व गर्म 4x एसएससी में स्लाइड धो / 0.1% बीच 20 3xfor 5 मिनट प्रत्येक.
    3. एक प्रकाश संरक्षित कांच स्लाइड धुंधला जार में DAPI में 3 मिनट के लिए स्लाइड दाग.
    4. मिलाते हुए, 2x एसएससी में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें. 24 X 60 मिमी coverslips के साथ कवर, Mowiol बढ़ते मध्यम के 35 μl लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान.

गुणसूत्रों की 5 सूक्ष्म विश्लेषण

  1. एक मानक महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग मेटाफ़ेज़ स्लाइड का विश्लेषण करें. सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए इस तरह के MetaSystems Metafer मंच के रूप में एक स्वचालित मंच के साथ एक इमेजिंग मंच का उपयोग करें. DAPI प्रतिदीप्ति गुणसूत्रों कल्पना करने के लिए प्रत्येक मेटाफ़ेज़ प्रसार के लिए, एक छवि जमा है, और telomere पी से फ्लोरोसेंट संकेत के लिए एक छविबागे. (जैसे, Cy3- अन्य fluors उपलब्ध हैं और अच्छी तरह से समान रूप से काम करते हैं.)
  2. एक छवि विश्लेषण कार्यक्रम के साथ ओवरले छवियों और विश्लेषण.

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Representative Results

एक सेल से ली गई मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों (चित्रा 1 ए) (माउस कोशिकाओं का उपयोग अगर) 40 गुणसूत्रों युक्त एक असतत क्लस्टर फार्म चाहिए. प्रत्येक गुणसूत्र एक हल्के नीले क्षेत्र के रूप में दिख रहा है जो एक छोर पर एक गुणसूत्रबिंदु है. सामान्य गुणसूत्रों में, दो telomere संकेतों प्रत्येक गुणसूत्रबिंदु द्वारा क्रोमेटिडों और दो संकेतों के अंत में देखा जाता है. Interphase नाभिक के रूप में अच्छी तरह से स्लाइड पर उपस्थित रहेंगे. ये लाल telomere संकेतों के साथ नीले क्षेत्रों, लेकिन कोई गाढ़ा गुणसूत्रों (उदाहरण चित्रा 1 बी के लिए देखें) के रूप में दिखाई देगा. interphase नाभिक जीनोमिक अस्थिरता बढ़ाता के प्रयोजनों के लिए नजरअंदाज नहीं किया जा सकता है.

गुणसूत्र aberrations के विभिन्न प्रकार के एक नंबर देखा जा सकता है. Chromatid टूटता प्रत्येक मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र बनाने वाले दो बहन क्रोमेटिडों में से एक में टूट रहे हैं. अन्वेषक एक छोर ओ से एक भी telomere संकेत के एक chromatid में दरार, या नुकसान देख लिया तो वे रन बनाए जा सकते हैंपिता गुणसूत्र (चित्रा 1 बी में उदाहरण देखें). क्रोमोजोम टूटता एक गुणसूत्र (चित्रा 1C में उदाहरण) के एक छोर से telomere संकेतों के नुकसान के लिए देख द्वारा पहचाने जाते हैं. कुछ मामलों में, गुणसूत्र की टूटी अंत (चित्रा 1C में मामला है) एक ही मेटाफ़ेज़ प्रसार में telomere संकेतों के साथ एक टुकड़ा के रूप में देखा जा सकता है. अन्य मामलों में, गुणसूत्र के अंत में उपस्थित नहीं हो सकता है.

गुणसूत्र rearrangements के कई प्रकार देखा जा सकता है. रेडियल गुणसूत्रों दो गुणसूत्रों से जुड़े जटिल rearrangements द्वारा विशेषता रूपों में से एक नंबर, ले (तीन उदाहरण चित्रा -1 में लाल तीर के साथ दिखाया जाता है). रेडियल क्रोमोसोम भी तीन या अधिक गुणसूत्रों को शामिल अधिक जटिल rearrangements, शामिल हैं. गुणसूत्रों भी बन सकते चित्रा -1 <में एक सफेद तीर के साथ दिखाया गया है दोनों सिरों पर centromeres साथ गुणसूत्रों की एक अंत करने के लिए अंत संलयन (के रूप में दिखाई देते हैं जो dicentric गुणसूत्रों, रूप में शामिल हुए/ Strong>). Robertsonian अनुवादन (चित्रा 1E में देखा है) एक एकल गुणसूत्रबिंदु से जुड़ी चार बहन chromatid हथियार के रूप में दिखाई देते हैं, जो दो गुणसूत्रों की centromeres के बीच स्थानान्तरण का एक प्रकार है.

चित्रा 1F telomere संकेतों मौजूद नहीं है कि एक मेटाफ़ेज़ से पता चलता है. Telomere संकेतों के अभाव संकरण के दौरान coverslip में जांच की तैयारी या हवा के बुलबुले में त्रुटियों से हो सकता है.

चित्रा 1
माउस बी कोशिकाओं में चित्रा 1 क्रोमोजोम aberrations PNA telomere मछली द्वारा कल्पना के रूप में. ए) मेटाफ़ेज़ में एक सामान्य माउस बी सेल के गुणसूत्र संरचना. 40 गुणसूत्रों एक सेल दो chromatid टूटता (हरी तीर). सी) प्रदर्शित करने के लिए या तो अंत. बी) में दो telomere संकेतों के साथ दिखाई दे रहे हैं डी) 3 रेडियल गुणसूत्रों (लाल तीर) और एक dicentric गुणसूत्र (सफेद तीर) एक Robertsonian स्थानान्तरण के साथ एक गुणसूत्र के साथ. ई) एक मेटाफ़ेज़ प्रसार प्रदर्शित सेल (पीले तीर के साथ एक मेटाफ़ेज़ प्रसार ). एफ) telomere संकेतों के बिना गुणसूत्रों दिखा एक असफल संकरण का एक उदाहरण. पैमाने बार प्रत्येक छवि में 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सक्रिय बी लिम्फोसाइटों विशेष रूप से mitotic गुणसूत्र फैलता की तैयारी के लिए अनुकूल हैं, जबकि अन्य प्रकार की कोशिकाओं का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. टी लिम्फोसाइट वे तिल्ली या लिम्फ नोड्स से शुद्ध किया जा सकता है, के रूप में बी कोशिकाओं के लाभ के कई साझा करें और उपयुक्त mitogens 8 युक्त मध्यम में वृद्धि से प्रेरित है जब एक उच्च mitotic सूचकांक है. भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते कोशिकाओं) भी मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र विश्लेषण 9 के लिए अनुकूल हैं. इन उपलब्ध नहीं हैं colcemid के साथ एक लंबे समय तक उपचार (जैसे, 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में colcemid साथ 16 घंटे) निर्धारण से पहले मेटाफ़ेज़ में फंसाने के लिए अधिक कोशिकाओं की सिफारिश की है, हालांकि fibroblast कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है.

हम मेटाफ़ेज़ की तैयारी की स्थिरता बहुत ऐसी Thermotron सीडीएस-5 के रूप में एक नियंत्रित आर्द्रता चैम्बर में सितोगेनिक क सुखाने चैंबर तय गुणसूत्रों छोड़ने से मदद की है फैलता है लगता है, लेकिन यह क अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव हैप्रयोगशाला वातावरण की नमी और तापमान के आधार पर एक बेंच पर काम कर इले. विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह नमूना प्रति कम से कम 100 metaphases से गुणसूत्र aberrations स्कोर करने की सलाह दी जाती है. स्वयं प्रत्येक चैनल में प्रत्येक मेटाफ़ेज़ श्रमसाध्य हो सकता इमेजिंग की प्रक्रिया के रूप में, हम जल्दी से लगता है और इसे सही मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों की एक बड़ी संख्या को स्कैन कर सकते हैं जो एक Metasystems Metafer4 स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करते हुए metaphases अधिग्रहण.

Telomere जांच के साथ लेबल मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों का विश्लेषण गुणसूत्र और chromatid टूटता मापने के लिए आदर्श है, और telomere संकेतों भी ऐसे fusions और रेडियल संरचनाओं के रूप में जटिल गुणसूत्र rearrangements की पहचान सहायता. Giemsa के समाधान के साथ तय मेटाफ़ेज़ गुणसूत्रों के धुंधला भी गुणसूत्र aberrations बढ़ाता के लिए उपयुक्त है, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 10 की जरूरत नहीं है का लाभ प्रदान करता है. एक pantelomeric PNA जांच के साथ telomeres लेबल बजाई फैलीDNAPKcs-पीटा चूहों 11 से कोशिकाओं में, उदाहरण के लिए, जो उठता telomere fusions, की पहचान की अनुमति देकर, मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि गुणसूत्र aberrations के ए. PNA मछली भी गुणसूत्र telomere दोहराव और chromatid telomere नुकसान 12,13 सहित telomere असामान्यताओं की आवृत्तियों, मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक telomere संकेत हानि telomere छोटा करने से और साथ ही गुणसूत्र टूटना के कारण हो सकता है. PNA मछली संवेदनशीलता क्यू मछली (मात्रात्मक मछली) 14 का उपयोग टेलोमेर की लंबाई मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अलग डीएनए की मरम्मत की गतिविधियों की कमी कोशिकाओं गुणसूत्र aberrations के विभिन्न प्रकार के जमा करते हैं. उदाहरण के लिए, डीएनए की क्षति प्रतिक्रिया कारक 53BP1 में कमी, गुणसूत्र का संचय 15 टूटता की ओर जाता है. इसके विपरीत, जटिल रेडियल गुणसूत्र संरचनाओं की एक उच्च अनुपात बीआरसीए 1 4 कमी कोशिकाओं में मनाया जाता है. ये गुणसूत्र rearrangements, उनके सटीक संरचना में विविध रहे हैंलेकिन हमेशा दो या अधिक गुणसूत्रों से सामग्री का फ्यूजन शामिल है. उदाहरण के डीएनए टूट का कारण है कि एजेंटों की उच्च खुराक के साथ इलाज के बाद होता है के लिए के रूप में कोशिकाओं, जीनोमिक अस्थिरता के बहुत उच्च स्तर है, यह प्रयोग के गतिशील रेंज पर एक सीमा डालता है जो व्यक्ति के गुणसूत्र aberrations, स्कोर करने के लिए तेजी से मुश्किल हो जाता है.

मेटाफ़ेज़ फैलता में गुणसूत्र टूटता है और rearrangements की मात्रा विशिष्ट जीन डीएनए की मरम्मत में एक भूमिका है कि क्या परीक्षण के लिए उपयोगी है. इस उद्देश्य के लिए मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र विश्लेषण का उपयोग करने में एक संभावित मुद्दा डीएनए की मरम्मत की गतिविधियों की कमी है जो कोशिकाओं को सामान्य रूप से विकसित नहीं हो सकता है. मरम्मत की कमी कोशिकाओं मेटाफ़ेज़ तक पहुँच नहीं है, डीएनए की मरम्मत मध्यस्थता के लिए एक जीन के महत्व को कम करके आंका जा सकता है. - / - P53 - / - डबल पीटकर कोशिकाओं मा दिखाने उदाहरण के लिए, RNF8 - / - RNF8 जबकि P53 निर्भर वार्धक्य के अधीन हैं जो कोशिकाओं,,, गुणसूत्र अस्थिरता का एक मामूली स्तर दिखानेNY अधिक गुणसूत्र aberrations, P53 का विलोपन बेहतर सेल के विकास 16 की अनुमति देता है. यह एक कोशिका चक्र परख साथ गुणसूत्र अस्थिरता की माप जोड़ी के लिए कि पीटकर सेल आबादी सामान्य रूप से बढ़ने और mitotic कोशिकाओं की एक सार्थक अनुपात में हो सकते हैं दिखाने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है.

जीनोमिक अस्थिरता का अवलोकन एक विशिष्ट जीन द्वारा प्रदान की मरम्मत गतिविधि के सटीक समारोह में अंतर्दृष्टि दे से ही नहीं करता है, लेकिन केवल अधिक यंत्रवत अध्ययनों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में कार्य करता है. इस दृष्टिकोण गुणसूत्र टूट जाता है और जटिल rearrangements को मापने के लिए उपयोगी है, हालांकि अंत में, mFISH या आकाश का उपयोग गुणसूत्र अनुवादन बढ़ाता के लिए सिफारिश की है. इन तकनीकों में भी मेटाफ़ेज़ गुणसूत्र फैलता के साथ शुरू हो, लेकिन जांच की एक कॉकटेल है कि 'रंग' fluorophores की एक विशिष्ट संयोजन के साथ प्रत्येक गुणसूत्र का उपयोग करें. इन तकनीकों के दोनों गुणसूत्र instab के पूरे स्पेक्ट्रम को मापने के लिए सिफारिश की हैमरम्मत की कमी कोशिकाओं में ility.

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Disclosures

लेखकों कोई परस्पर विरोधी हितों की है.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान R00 CA160574 (SFB) द्वारा और (SMM के लिए) रटगर्स जैव प्रौद्योगिकी प्रशिक्षण कार्यक्रम का एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Dextran sulfate Intergen S4030
Deionized formamide Ambion 9342
Pepsin (5 g) Sigma P 6887 
FCS Gemini 100-106
LPS (100 mg) Sigma L2630
IL-4 (5 μg) Sigma I1020
PNA Telomere Probe PNA Bio Inc F1002 (CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid Roche 295892
Mowiol 4-88 Sigma 81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads Miltenyl Biotec. 130-049-801
DAPI Sigma 32670-5MG
Eclipse E800 Nikon
AxioImager.Z2 Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber Thermotron

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 90 जीनोमिक अस्थिरता डीएनए की मरम्मत माउस मेटाफ़ेज़ प्रसार मछली प्राथमिक संस्कृति
PNA मछली द्वारा माउस बी लिम्फोसाइटों में क्रोमोजोम aberrations के तेजी से विश्लेषण
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Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid … More

Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. J. Vis. Exp. (90), e51806, doi:10.3791/51806 (2014).

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