Summary
מסלולי תיקון DNA חיוניים לתחזוקה של שלמות הגנום ומוטצית מניעה וסרטן. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית על ידי תצפית ישירה של סטיות כרומוזום בmetaphase מתפשט מתאי B עכבר באמצעות ניאון הכלאה באתר (FISH) לחזרות דנ"א telomeric.
Abstract
תיקון DNA פגום מוביל לחוסר יציבות גנומית מוגבר, המהווה את סיבת השורש של מוטציות המובילות ליצירת גידולים. ניתוח של התדירות והסוג של סטיות כרומוזום בתאים מסוגים שונים מאפשר פגמים במסלולי תיקון DNA לא הובהרו. ביולוגיה תיקון דנ"א של יונקים הבנה כבר סייעה רב בייצור של עכברים עם knockouts בגנים מסוימים. המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת חוסר יציבות גנומית בB עכבר לימפוציטים. תיוג של הטלומרים באמצעות בדיקות PNA-FISH (חומצות גרעין פפטיד - ניאון הכלאה באתר) מאפשר ניתוח המהיר של חוסר יציבות גנומית במרווחי כרומוזום metaphase. יש לי תאי B יתרונות ספציפיים ביחס לפיברובלסטים, כי יש להם ploidy נורמלי ומדד המיטוטי גבוה יותר. תרבות לזמן הקצר של תאי B ולכן מאפשרת מדידה מדויקת של חוסר יציבות גנומית באוכלוסיית תא ראשונית שעשויה להיות מוטציה גנטית משנית פחותים יותר ממה שהוא נמצא בדרך כלל בfibroblasts הפך או שורות תאי חולה.
Introduction
הסרטן נגרמים על ידי ההצטברות של מוטציות המשפיעות על גנים המווסתים את גדילת תאים נורמלית. מוטציה היא תוצאה של שינויים במבנה וברצף של הגנום שנגרם נזק לדנ"א. נזק לדנ"א יכול להתרחש באמצעות מגוון רחב של תהליך, כולל סוכנים אקסוגניים כגון קרינה מייננת, וכתוצר לוואי של חילוף חומרים בתאים נורמלים, כגון deamination הספונטני של בסיסי נוקלאוטיד או נזק המתרחשים על ידי מגע עם מיני חמצן תגובתי 1.
למרות שתאי יונקים יש מגוון של פעילויות תיקון שיכול להפוך נזק לדנ"א או לשחזר את הרצף באתרי הפסקה, מוטציות בכל זאת לצבור לכל אורך חייו של תא. נזק לדנ"א יכול יתר על כן תורם להזדקנות ואובדן העוצמה של תאי גזע, שני תהליכים הקשורים למחלות הקשורות להזדקנות 2. הבנת התיקון של נזק לדנ"א לכן חשיבות מרכזית בהתמודדות שני סימןנושאי ificant בבריאות הציבור. ראיות מצביעות על כך שהגדלת מסלולי תיקון דנ"א של יונקים יכולים לתרום להתפתחות של הגנום של התאים הסרטניים 3,4, מה שהופך את זה אפילו יותר הכרחי כדי להבין את התהליכים מעורבים בדיכוי מוטציה ברמה המולקולרית.
להדמיה ישירה של סטיות כרומוזום היא אמצעי רב עוצמה וכמותי של קביעת ההיקף של חוסר יציבות גנומית בסוג תא מסוים. כרומוזומים תמצית מהתאים בmetaphase יכולים להיות מבודדים ובדקו באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישות ציטוגנטית כאלה כבר בפועל במשך כמה עשורים וניתן להשתמש בו כדי להדגים את המראה של טרנסלוקציות או סוגים מסוימים של סטיות כרומוזום קשורות לאובדן של פעילות תיקון DNA. הפרוטוקול משאיל את עצמו לכמה סיומות אפשריות: יכולים להיות מתויג כרומוזומים עם בדיקות לkaryotyping רפאים (SKY) או ניאון ססגוניות הכלאה באתר(MFISH) לזהות טרנסלוקציות 5,6. טכניקות אלו מאפשרות גם את התדירות של טרנסלוקציות כרומוזום והמבנה של טרנסלוקציות כרומוזום המורכבת שייקבע, אשר מספק מידע נוסף מעבר למה שאפשרי עם פרוטוקול זה. לחלופין, יכולות להיות שנוצרו בדיקות רצף ספציפי ומשמשות לבדיקת התדירות של שבירת הדנ"א באתרים הגנומי נבחרו 7.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הכנה של כרומוזום metaphase מתפשטת מלימפוציטים מסוג B. בדיקה פפטיד fluorescently שכותרתו חומצות גרעין (PNA) לחזרות telomeric משמשת, אשר יעילות מסמנת הטלומרים בכרומוזום metaphase מתפשט פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. יכולים להיגרם תאי B לצמוח במדד המיטוטי גבוה, כך שאופן עקבי ניתן להפיק מרווחים גבוהה באיכות. תאי B מעכברים גנטי שונה הם הרבה פחות סביר שיכילו מוטציות גנטיות משניים שיכול לבלבל את הניתוח של התרומה גםשל גנים ספציפיים לשלמות הגנום. גישת PNA-FISH ניתן להשלים ביום אחד, ומאפשרת ניקוד מדויק יותר של הפסקות כרומוזום. על ידי שימוש בגישה זו, במיוחד בשילוב עם ציוד ספציפי שתואר בפרוטוקול זה, ניתן לייצר מרווחים מאוד עקביים, באיכות גבוהה ובמהירות לנתח את השיעור והסוג של חוסר יציבות גנומית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נוהל זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת רטגרס, אוניברסיטת ניו ג'רזי המדינה. טופלו עכברים בהתאם למדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה. מדענים צריכים להתייעץ ארגוני בעלי החיים הלאומיים ומוסדיים שלהם להנחיות שנקבעו ואושרו.
לפני תחילת, להכין את הפתרונות מפורטים בטבלה 1.
בידוד תא 1 B והפעלה
להרדים עכבר באמצעות CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. מקם את העכבר כל כך בצד השמאל של הגוף הוא למעלה ולרסס את העכבר עם אתנול 70% עד הפרווה לחה. לנתח את הטחול ומניחים בצלחת תרבית רקמת 35 מ"מ עם חיץ לשטוף 2 מ"ל. בזרימה למינרית, בעדינות לשבור את הטחול בצלחת תרבית רקמה באמצעות הקצה השטוח של מזרק 5 מ"ל.
- הכנס רשת ניילון 70 מיקרומטר ל50צינור מ"ל ולהעביר את דגימת הטחול ב2 מ"ל חיץ לשטוף לרשת הניילון. בעדינות לשבש את הטחול ברשת באמצעות הקצה השטוח של המזרק.
- יש לשטוף את הגב של המזרק וצלחת 35 מ"מ עם 8 מ"ל של חיץ לשטוף ולסנן דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
- לשאוב ולזרוק supernatant וresuspend גלולה ב 3 מ"ל של חיץ תמוגה ACK. פיפטה למעלה ולמטה לזמן קצר לשבש גושים ודגירה של 5 דקות. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
- לשאוב ולזרוק supernatant ו resuspend את הכדור על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור ולאחר מכן על ידי pipetting ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף. הוסף 50 μl של מיקרו חרוזים אנטי CD43 MACS ולדגור על קרח למשך 30 דקות. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. הוסף 10 מ"ל של חיץ לשטוף, מערבב בעדינות, וצנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
- הגדר אתMini-MACS טור על ידי הצבת עמודה על מגנט MACS. מקם צינור חרוטי 15 מ"ל שכותרת מתחת לעמודה. הוסף 1 מ"ל של חיץ לשטוף לעמודה ולאפשר לרוץ דרך צינור 15 מ"ל.
- לשאוב supernatant וגלול ב 1 מ"ל של חיץ לשטוף. טען את המדגם בעמודה לאחר לשטוף החיץ יש להפעיל דרך.
- אחרי המדגם לרוץ דרך העמודה, להוסיף למאגר לשטוף 1 מ"ל לשטוף את העמודה. הוסף 7 מ"ל של חיץ לשטוף ישירות למדגם שנאסף בצינור 15 מ"ל.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר את הנפח הנדרש של תאים דרושים ל5,000,000 תאים / היטב לתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. בינוני תא B מוסף עם 1 LPS: 500 וIL4 1: 1,000.
- לשאוב supernatant ולהוסיף הנפח המתאים של מדיום תא B בתוספת הדרושה לריכוז סופי של 1,000,000 תאים / מ"ל.
- פלייט תאים ב6 צלחות גם עם 5 מ"ל של תאים ב1,000,000 תא / מ"ל והמקום בhumidifiתרבית תאי חממת ed על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
קיבוע תא .2 B
- הוסף 50 μl של colcemid לC גם מכיל 5 מ"ל של תאי B (לריכוז סופי של 100 ng / ml) ו דגירה שעה 1 ב37 מעלות. 75 פתרון מ"מ KCl Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את תאי B לצינור 15 מ"ל שכותרת. כסה את התווית עם קלטת ו צנטריפוגות ב XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
- לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting. הוסף 5 מ"ל של ירידת KCl prewarmed על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם במערבולת.
- הוסף 10 מ"ל של KCl ומערבבים על ידי היפוך. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הוסף 5 טיפות של מקבע ותערובת טריות על ידי היפוך. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וresuspend גלולה ידי pipetting למעלה ולמטה.
- הוסף 5 מ"ל של טיפה מקבע טרי על ידי ירידה בזמן הקשה או פועם בvorטקס. הוספה נוסף 10 מ"ל של מקבע ודגירת 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב supernatant עוזב 1 מ"ל בצינור וגלול על ידי pipetting. הוספת 14 מ"ל של מקבע ו צנטריפוגות הטריים XG 300 10 דקות ב 4 ° C..
- חזור על שלב 2.7 עוד פעמיים.
- הוספת 14 מ"ל של מקבע טרי. חותם את הכובעים עם Parafilm ולאחסן לילה בשעה -20 מעלות צלזיוס.
.3 הכנת ממרחי כרומוזום Metaphase
- להגדיר תא סביבתי מוסדר ל22.9 ° C ו52% לחות.
- צנטריפוגה קבועה תאי B XG 300 10 דקות ב 4 ° C.. לשאוב מקבע עוזב 70 μl בצינור והגלול על ידי pipetting.
- הנח שקופיות שכותרתו בתא לחות בזווית 35 °. זרוק 35 μl של תאי B resuspended לשקופית ושחרר שתי שקופיות לדגימה. אפשר השקופיות לייבוש בתא לחות למשך 30 דקות לאחר מכן לאחסן את השקופיותבתיבת שקופיות על 37 C °.
FISH .4 הטלומרים הרשות הפלסטינית
- הכנת Probe
- פוראמיד deionized טרום חם ל37 מעלות צלזיוס. לערבב 2 μl של בדיקה הרשות הפלסטינית הטלומרים עם פוראמיד מראש חימם 7 μl deionized ולדגור על 37 ° C עם רעד במשך שעה 1.
- תערובת אב FISH טרום חמה ל37 מעלות צלזיוס. להוסיף 7 μl תערובת אב FISH מראש חיממה לתערובת משלב 4.1.1 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות.
- לפגל תערובת הבדיקה במשך 8 דקות על 80 מעלות צלזיוס. טרום לחשל את החללית לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס.
- טיפול מקדים של שקופיות כרומוזום
- טרום חם צנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה 50 מ"ל של 0.01 M HCl ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- מגלשות מקום בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 2x SSC למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- הוסף 2 μl של מניית פפסין לצנצנת שקופית המכתימה הזכוכית מחוממת מראש ומערבבים על ידי היפוך. העברת שקופיות sl זכוכית זהצנצנת ide-מכתים ודגירה 90 שניות על 37 מעלות צלזיוס.
- שטוף את השקופיות 2x בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר, רועדת. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב1x PBS / MgCl 2 בטמפרטורת חדר, רועד.
- העברת השקופיות לצנצנת שקופית מכתימה זכוכית המכילה פורמלדהיד 1% המוכנים טרי / 1x PBS / MgCl 2 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
- שטוף את השקופיות עבור 5 דקות בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית שונה המכילה 1x PBS בטמפרטורת חדר, רועד.
- הכן סדרת התייבשות אתנול על ידי בעל צנצנות שקופית מכתימה זכוכית נפרדת המכילות 70%, 90%, ו100% אתנול.
- העברת השקופיות לכל צנצנת במשך 3 דקות, מתחילה עם 70% אתנול, ולאחר מכן 90% אתנול, ולאחר מכן 100% אתנול. מניחים צנצנות אתנול ב -20 מעלות צלזיוס, כאשר סיימו.
- אפשר שקופיות לייבוש באוויר על ידי הקשה אתנול עודף על מגבת נייר והשעין שקופיות בזווית 35 °. ברגע שיבש, maRK אזור 18 x 18 מ"מ להכלאה על הגב של השקופיות באמצעות עט יהלומים.
- Denaturation של שקופיות לדגים
- החל פוראמיד 120 μl 70% deionized / 2X SSC לcoverslip 24 x 60 מ"מ. לגעת בשקופיות לcoverslip. לפגל שקופיות על 80 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית ל90 שניות.
- במהירות ובזהירות להחליק את coverslip ולמקם את השקופית באתנול 70% קרים כקרח במשך 3 דקות, ואחריו 90% אתנול, ו100 אתנול% כל אחד במשך 3 דקות. אפשר שקופיות לייבוש באוויר.
- הכן תא לח על ידי המצפה קופסא פלסטיק עם מכסה הדוק ונייר טישו רטוב. הנייר צריך להיות לח, אבל לא רווי במים.
- בתא לח, להחיל את תערובת בדיקה-מרותק מראש מצעד 4.1.3 לאזור המסומן בשקופית, מכסה בכיסוי מ"מ תלוש 18 x 18 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- רוחצת הודעה דגירה
- פוראמיד 50% טרום חם / 2x SSC, 1x SSC, ו4x SSC / 0.1% Tween-20 ב45 °; C אמבט מים.
- מוציא בזהירות את coverslips ולשטוף את השקופיות ב50% פוראמיד דקות 3xfor 5 / 2x SSC מראש חימם כל אחד בחושך ורועד. שטוף את השקופיות בSSC 1x מראש חימם 3xfor 5 דקות כל אחד, רועדים. לבסוף, לשטוף את השקופיות במחוממים מראש 4x SSC / 0.1% דקות Tween-20 3xfor 5 כל אחד.
- כתם השקופיות עבור 3 דקות בDAPI בצנצנת שקופית מכתימה זכוכית אור מוגנת.
- שטוף את השקופיות עבור 5 דקות ב2x SSC, רועדים. החל 35 μl של הרכבה בינונית Mowiol, מכסה ב24 x 60 coverslips מ"מ ולאחסן את השקופיות ב 4 ° C..
.5 ניתוח מיקרוסקופי של כרומוזומים
- לנתח את שקופיות metaphase באמצעות מיקרוסקופ עלית הקרינה סטנדרטי. השתמש בפלטפורמת הדמיה עם שלב אוטומטי כגון פלטפורמת MetaSystems Metafer כדי להשיג תוצאות הטובות ביותר. לכל התפשטות metaphase, לאסוף תמונה אחת לקרינת DAPI לדמיין כרומוזומים, ותמונה אחת לאות הניאון מp הטלומריםגלימה. (לדוגמא, fluors האחר Cy3- זמין ולעבוד באותה מידה גם.)
- כיסוי התמונות עם תכנית ניתוח תמונה ולנתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כרומוזומים Metaphase נגזרים מתא אחד צריכים ליצור אשכול דיסקרטי המכיל 40 הכרומוזומים (אם שימוש בתאי עכבר) (איור 1 א). לכל כרומוזום centromere בקצה אחד, שהוא נראה כמו כדור אור כחול. בכרומוזומים רגילים, שני אותות הטלומרים נראים בסוף chromatids ושני אותות על ידי כל אחד centromere. גרעיני שלבי ביניים יהיו נוכחים בשקופית גם כן. אלה יופיעו כתחומים כחולים, עם אותות הטלומרים אדומים, אבל אין כרומוזומים תמצית (ראה למשל איור 1). גרעיני הביניים ניתן להתעלם ממנו למטרות כימות חוסר יציבות גנומית.
מספר סוגים שונים של סטיות כרומוזום של יכול להיות שנצפו. הפסקות Chromatid הפסקות באחת משתי chromatids האחות שמרכיבים את כל כרומוזום metaphase. הם יכולים להיות הבקיע אם החוקר רואה המשכיות בchromatid אחד, או הפסד של אות הטלומרים אחת מo קצה אחדכרומוזום fa (ראה דוגמאות באיור 1 ב). הפסקות כרומוזום מזוהות על ידי מחפש הפסד של אותות הטלומרים מקצה אחד של כרומוזום (דוגמא באיור 1 ג). בחלק מהמקרים, הקצה השבור של כרומוזום ניתן להבחין שבר עם אותות הטלומרים באותה התפשטות metaphase (כמו במקרה באיור 1 ג). במקרים אחרים, סופו של דבר כרומוזום עשוי שלא להיות נוכח.
מספר סוגים של שחלופי כרומוזום אפשר לראות. כרומוזומים רדיאלי לקחת מספר הצורות, המתאפיין בשחלופים מורכבים של שני כרומוזומים (שלוש דוגמאות מוצגות עם חצים אדומים באיור 1D). כרומוזומים רדיאלי כוללים גם ארגון מחדש מורכב יותר, הכולל שלושה או יותר כרומוזומים. כרומוזומים עלולים גם להיות הצטרף כדי ליצור כרומוזומים dicentric, המופיעים כהיתוך מקצה לקצה של הכרומוזומים עם centromeres בשני קצותיו (מוצג עם חץ לבן באיור 1D </ Strong>). טרנסלוקציות Robertsonian היא סוג של טרנסלוקציה בין centromeres של שני כרומוזומים, המופיעים כארבע זרועות chromatid האחות המצורפות לcentromere יחיד (ניתן לראות באיור 1E).
איור 1F מראה metaphase שאין אותות הטלומרים הנוכחיים. היעדר אותות הטלומרים יכול להתרחש מטעויות בהכנת הבדיקה או בועות אוויר בcoverslip במהלך הכלאה.
סטיות כרומוזום איור 1 בתאי B עכבר כמו דמיינו ידי דגי הטלומרים הרשות הפלסטינית. ) מבנה כרומוזום של B עכבר תא נורמלי בmetaphase. 40 כרומוזומים גלויים, עם שני אותות הטלומרים בשני קצותיו. B) תא בו מוצגות שתי הפסקות chromatid (חיצים ירוקים). C) ד) (חץ צהוב תא בו מוצגות 3 כרומוזומים רדיאלי (חצים אדומים) וכרומוזום dicentric אחד (חץ לבן). E) התפשטות metaphase עם כרומוזום אחד עם טרנסלוקציה Robertsonian ). F) דוגמא של הכלאה נכשלה, מראה כרומוזומים ללא אותות הטלומרים. סרגל קנה המידה מייצג 10 מיקרומטר בכל תמונה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ואילו לימפוציטים מסוג B מופעלים מתאימים במיוחד להכנת ממרחי כרומוזום mitotic, יכולים לשמש גם סוגי תאים אחרים. לימפוציטים מסוג T חולקים הרבה מהיתרונות של תאי B, כפי שהם יכולים להיות מטוהרים מבלוטות הטחול או לימפה, ויש לי מדד גבוה המיטוטי כאשר מגורה על ידי צמיחה במדיום המכיל mitogens המתאימה 8. תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) מתאימים גם לכרומוזום metaphase ניתוח 9. אם אלה אינם זמינים, ניתן להשתמש בתאים פיברובלסטים, למרות שטיפול ארוך יותר עם colcemid (למשל, hr 16 עם colcemid בריכוז סופי של מ"ל / 10 ng) מומלץ למלכודת יותר תאים בmetaphase לפני הקיבוע.
אנו מוצאים כי העקביות של הכנת metaphase פערים היא הקל מאוד על ידי הטלת כרומוזומים הקבועים בתא לחות מבוקרת כגון CDS-5 Thermotron ציטוגנטית ייבוש קאמרי, אבל זה אפשרי להשיג תוצאות טובות ש"שאיל עבד בספסל בהתאם ללחות והטמפרטורה של סביבת המעבדה. כדי לקבל תוצאות אמינות, רצוי להבקיע סטיות כרומוזום לדגימה לפחות 100 metaphases. כתהליך של הדמיה באופן ידני כל metaphase בכל ערוץ יכול להיות מייגע, אנו רוכשים metaphases באמצעות מערכת מיקרוסקופיה אוטומטית Metasystems Metafer4, אשר יכולה למצוא במהירות ובאופן מדויק לסרוק מספר רב של כרומוזומים metaphase.
ניתוח של כרומוזומים metaphase שכותרתו עם בדיקות הטלומרים הוא אידיאלי למדידת הפסקות כרומוזום וchromatid, ואותות הטלומרים גם לסייע לזיהוי של שחלופי כרומוזום מורכבים כגון שילובים ומבנים רדיאליים. צביעה של כרומוזומים metaphase קבועים עם הפתרון של Giemsa מתאים גם לכימות סטיות כרומוזום, ומציעה את היתרון של לא דורש ניאון מיקרוסקופיה 10. תיוג הטלומרים עם בדיקה הרשות הפלסטינית pantelomeric מרחיב את צלצלדואר של סטיות כרומוזום שניתן לכמת, כך שהוא מאפשר זיהוי של שילובי הטלומרים, המתעוררים, למשל, בתאים מעכברי DNAPKcs-נוקאאוט 11. גם הרשות הפלסטינית-FISH ניתן להשתמש כדי למדוד את התדרים של מומי הטלומרים, כולל כפילויות הטלומרים כרומוזום ו12,13 הפסד הטלומרים chromatid. אובדן אות הטלומרים יכול להיגרם על ידי התקצרות הטלומרים, כמו גם על ידי שבירת כרומוזום. PNA-FISH ניתן להשתמש כדי למדוד את רגישות אורך הטלומרים באמצעות Q-FISH (דגים כמותי) 14.
תאים חסרי פעילות תיקון DNA שונה נוטים לצבור סוגים שונים של סטיות כרומוזום. לדוגמא, מחסור ב53BP1 גורם תגובת נזק לדנ"א, מוביל להצטברות של כרומוזום שוברת 15. לעומת זאת, אחוז גבוה של מבני כרומוזום רדיאלי מורכבים הם נצפו בתאים חסרי BRCA1 4. שחלופי כרומוזום אלה הם מגוונים במבנה המדויק שלהם,אבל תמיד כרוך בשילוב של חומר משניים או יותר כרומוזומים. כאשר יש לי תאים רמות גבוהות מאוד של חוסר יציבות גנומית, כמו למשל מתרחש לאחר טיפול במינונים גבוהים של סוכנים שגורמים לשברי DNA, הוא הופך להיות קשה יותר ויותר כדי לצבור סטיות כרומוזום בודדות, אשר מעמידה בטווח הדינמי של ניסוי גבול.
כימות של הפסקות כרומוזום ושחלופים במרווחי metaphase שימושית לבדיקה אם יש לי גנים ספציפיים תפקיד בתיקון DNA. בעיה פוטנציאלית אחת בבאמצעות ניתוח כרומוזום metaphase למטרה זו היא שתאים אשר חסר פעילות תיקון DNA לא יכולים לגדול באופן נורמלי. אם תאי תיקון לקוי אינו מגיעים metaphase, את חשיבותו של גן לתיווך תיקון DNA יכולה לזלזל. לדוגמא, RNF8 - / - תאים, אשר כפופים להזדקנות p53 תלוי, מראים רמה צנועה של חוסר יציבות כרומוזום, ואילו RNF8 - / - p53 - / - תאים כפול נוקאאוט להראות maסטיות ניו יורק יותר כרומוזום, כי מחיקה של p53 מאפשרת תא צמיחה טובה יותר 16. לכן חשוב ליצור התאמה בין מדידות של חוסר יציבות כרומוזום עם assay מחזור תא, כדי להראות שאוכלוסיות תאי נוקאאוט יכולות לגדול בצורה נורמלית ומכילים שיעור משמעותי של תאי mitotic.
התצפית של חוסר יציבות גנומית לא על ידי עצמו נותן תובנה הפונקציה של פעילות תיקון מסופקת על ידי גן ספציפי המדויקת, אלא רק משמשת כנקודה מוצא ליותר מחקרים מכניסטית. לבסוף, למרות שגישה זו היא יעילה למדידת הפסקות כרומוזום ושחלופים מורכבים, השימוש בmFISH או SKY מומלץ לכימות טרנסלוקציות כרומוזום. טכניקות אלה גם להתחיל עם ממרחי כרומוזום metaphase, אבל להשתמש בקוקטייל של בדיקות 'צבע' שכל כרומוזום עם שילוב ספציפי של fluorophores. אחת מהטכניקות אלה מומלצת למדידת הספקטרום המלא של instab כרומוזוםility בתאי תיקון לקוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אי לנו אינטרסים מנוגדים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק R00 CA160574 (SFB) ועל ידי מענק של תכנית רטגרס ביוטכנולוגיה ההדרכה (לSMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
