Summary
DNA-reparationsvägar är viktiga för upprätthållandet av genomisk integritet och förhindra mutation och cancer. Målet med detta protokoll är att kvantifiera genomisk instabilitet genom direkt observation av kromosomavvikelser i metafas sprids från mus B-celler med fluorescerande in situ hybridisering (FISH) för telomeric DNA upprepas.
Abstract
Defekt DNA-reparation leder till ökad genomisk instabilitet, vilket är den grundläggande orsaken till mutationer som leder till tumörbildning. Analys av frekvens och typ av kromosomavvikelser i olika celltyper gör att defekter i DNA-reparationsvägar som ska belysas. Förstå däggdjurs DNA-reparation biologi har stor hjälp av produktionen av möss med knockouts i specifika gener. Målet med detta protokoll är att kvantifiera genomisk instabilitet i mus B-lymfocyter. Märkning av telomererna använder PNA-FISH prober (peptidnukleinsyra - fluorescent in situ hybridisering) underlättar snabb analys av genomisk instabilitet i metafas kromosom uppslag. B-celler har specifika fördelar jämfört med fibroblaster, eftersom de har normal ploidi och ett högre mitotiska indexet. Korttids kultur av B-celler kan således exakt mätning av genomisk instabilitet i en primär cellpopulation som sannolikt kommer att ha färre sekundära genetisk mutations än vad som normalt återfinns i trans fibroblaster eller patient cellinjer.
Introduction
Cancer orsakas av en ansamling av mutationer som påverkar generna som reglerar normal celltillväxt. Mutation är en konsekvens av förändringar i strukturen och sekvensen av genomet orsakas av skador på DNA. DNA-skador kan uppstå genom olika processen, inklusive exogena medel såsom joniserande strålning, och som en biprodukt av normala cellulära metabolismen, såsom spontan deaminering av nukleotidbaser eller skador som inträffar genom kontakt med reaktiva syreradikaler 1.
Även däggdjursceller har en rad reparationsverksamhet som kan vända DNA-skada eller återställa sekvensen vid brytplatser, mutationer ändå ackumuleras under hela livslängden för en cell. DNA-skada kan dessutom bidra till åldrande och förlust av potens av stamceller, två processer som är förknippade med åldrandet-associerad sjukdom 2. Förstå reparation av DNA-skador är därför centralt att ta itu med två teckenificant frågor i folkhälsan. Ökande bevis antyder att däggdjurs-DNA-reparationsvägar kan bidra till utvecklingen av cancercellgenomet 3,4, vilket gör det ännu mer nödvändigt att förstå de inblandade vid undertryckande mutation vid den molekylära nivån processer.
Direkt visualisering av kromosomavvikelser är ett kraftfullt och kvantitativa medel för att fastställa omfattningen av genomisk instabilitet i en viss celltyp. Kondenserade kromosomer från celler vid metafas kan isoleras och kontrolleras med hjälp av ljus eller fluorescerande mikroskopi. Sådana cytogenetiska angreppssätt har varit i praktiken i flera decennier och kan användas för att visa förekomsten av transloka eller särskilda typer av kromosomavvikelser i samband med förlust av DNA-reparationsverksamhet. Protokollet lämpar sig till flera potentiella förlängningar: kromosomer kan märkas med prober för spektral karyotypning (SKY) eller multicolor fluorescent in situ hybridisering(MFISH) för att identifiera flyttningar 5,6. Dessa tekniker möjliggör också frekvensen av kromosomtransloka och strukturen av komplexa kromosomtransloka som skall fastställas, vilket ger ytterligare information utöver vad som är möjligt med detta protokoll. Alternativt kan alstras sekvensspecifika prober och användes för att testa frekvens av DNA sönder vid valda genomiska platser 7.
I detta protokoll, beskriver vi framställningen av metafaskromosom sprids från B-lymfocyter. Ett fluorescensmärkt peptid-nukleinsyra (PNA) sond för telomera upprepningar används, vilket effektivt markerar telomerer i metafaskromosom sprider Detta protokoll har flera fördelar. B-celler kan induceras till att växa vid högt mitotiskt index, så att högkvalitativa spread konsekvent kan produceras. B-celler från genetiskt modifierade möss är också mycket mindre att innehålla sekundära genetiska mutationer som kan förbrylla analysen av bidraget sannoliktav specifika gener till genomisk integritet. PNA-FISH tillvägagångssätt kan fyllas i på en dag, och tillåter mer exakt poängsättning av kromosombrott. Genom att använda denna metod, speciellt i kombination med särskild utrustning som beskrivs i detta protokoll, är det möjligt att producera mycket konsekventa, högkvalitativa uppslag och snabbt analysera hastighet och typ av genomisk instabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Rutgers, State University of New Jersey. Möss behandlades enligt NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Forskare bör samråda med sina nationella och institutionella djurorganisationer för etablerade och godkända riktlinjer.
Innan du börjar, förbereda de lösningar som anges i tabell 1.
1. B cellisolering och aktivering
Euthanize en mus med användning av CO 2 följt av cervikal dislokation. Placera musen så den vänstra sidan av kroppen är upp och spraya musen med 70% etanol tills pälsen är fuktig. Dissekera mjälten och lägg i en 35 mm vävnadsodlingsskål med 2 ml tvättbuffert. I en huv med laminärt flöde, försiktigt bryta upp mjälten i vävnadsodlingsskål med användning av den plana änden av en 5 ml spruta.
- Sätt i en 70 nm nylonnät i en 50ml rör och överför mjälten provet i 2 ml tvättbuffert i nylonnät. Störa försiktigt mjälten i nät med den platta änden av sprutan.
- Skölj baksidan av sprutan och 35 mm platta med 8 ml av tvättbuffert och filtrera genom ett 70 | im nylonnät. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Aspirera och kassera supernatanten och suspendera pelleten i 3 ml ACK lyseringsbuffert. Pipettera upp och ner snabbt för att störa klumpar och inkubera under 5 min. Tillsätt 10 ml tvättbuffert och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Aspirera och kasta supernatanten och återsuspendera pelleten genom att knacka på botten av röret sedan genom pipettering i 1 ml tvättbuffert. Lägg 50 pl av anti-CD43 MACS mikropärlor och inkubera på is under 30 min. Lägg 10 ml tvättbuffert, blanda försiktigt och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Lägg 10 ml tvättbuffert, blanda försiktigt och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Sätt upp enMini-MACS kolumn genom att placera en kolumn på MACS magneten. Placera en märkt 15 ml koniskt rör under kolumnen. Tillsätt 1 ml tvättbuffert till kolonnen och låt rinna igenom till 15 ml rör.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 ml tvättbuffert. Ladda provet i kolonnen efter tvättbufferten har runnit igenom.
- Efter det att provet har gått genom kolonnen, tillsätt 1 ml tvättbuffert för att tvätta kolonnen. Lägg 7 ml tvättbuffert direkt till det uppsamlade provet i 15 ml rör.
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Överföra erforderlig volym av celler som behövs för 5 miljoner celler / brunn i en 50 ml tub. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Tillägg B-cell medium med LPS 1: 500 och IL4 1: 1,000.
- Aspirera supernatanten och tillsätt lämplig volym kompletterat B cellmedium som behövs för slutlig koncentration av miljoner celler / ml.
- Plate celler i 6-brunnars plattor med 5 ml av celler vid en miljon celler / ml och placera i en humidified cellodling inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
2. B Cell Fixering
- Lägg 50 pl av kolcemid till brunnen innehållande 5 ml av B-celler (för en slutlig koncentration av 100 ng / ml) och inkubera 1 timme vid 37 ° C. Förvärm 75 mM KCl-lösning i en 37 ° C vattenbad. Överför de B-celler till en märkt 15 ml rör. Täck etiketten med tejp och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten lämnar 1 ml i rör och suspendera pelleten genom pipettering. Tillsätt 5 ml av förvärmd KCl droppe för droppe medan du knackar eller pulserande på en virvel.
- Tillsätt 10 ml KCl och blanda genom att vända. Inkubera i en 37 ° C vattenbad i 15 min. Tillsätt 5 droppar färskt fixativ och blanda genom att vända. Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten lämnar en ml i röret och återsuspendera pelleten genom att pipettera upp och ned.
- Tillsätt 5 ml färskt fixativ droppvis medan du knackar eller pulserande på en vortex. Lägg till ytterligare 10 ml fixativ och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten lämnar 1 ml i rör och återsuspendera genom pipettering. Lägg 14 ml färskt fixativ och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Upprepa steg 2,7 gånger mer.
- Lägg 14 ml färsk fixativ. Täta locken med Parafilm och förvara över natten vid -20 ° C.
3 Beredning av metafaskromosom Spreads
- Ställ en reglerad klimatkammare till 22,9 ° C och 52% luftfuktighet.
- Centrifugera det fasta B-celler vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Aspirera fixativ lämnar 70 pl i röret och resuspendera genom pipettering.
- Placera märkta bilder i fuktkammare vid en 35 ° vinkel. Drop 35 l av den suspenderade B-celler på ett objektglas och släppa två bilder per prov. Låt objektglasen torka i fuktkammare i 30 minuter lagra sedan bildernai en glidlåda vid 37 ° C.
4. Telomer PNA FISH
- Framställning av sond
- Pre-varmt avjoniserat formamid till 37 ° C. Blanda 2 pl av telomer PNA-sond med 7 ul avjoniserat förvärmda formamid och inkubera vid 37 ° C med skakning under en timme.
- Pre-varm FISH Master Mix till 37 ° C. Lägg 7 l förvärmas FISH Master Mix till blandningen från steg 4.1.1 och inkubera vid 37 ° C under 1-3 timmar.
- Denaturera sonden blandningen under 8 minuter vid 80 ° C. Pre-glödga prob för en timme vid 37 ° C.
- Förbehandling av Kromosom Slides
- Pre-värma en glasskiva-färgning burk innehållande 50 ml 0,01 M HCl till 37 ° C i ett vattenbad.
- Placera objektglasen i en annan glasskiva-färgning burk innehållande 2x SSC under 5 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 l av pepsin lager till den förvärmda glasskiva-färgning burk och blanda genom att vända. Överför bilderna till denna glas slide-färgning burk och inkubera 90 sekunder vid 37 ° C.
- Tvätta bilderna 2x i en annan glasskiva-färgning burk innehållande 1x PBS under 5 min vardera vid rumstemperatur, under skakning. Tvätta sedan glasen i 5 minuter i 1x PBS / MgCl2 i rumstemperatur och skaka.
- Överför bilderna till en glasskiva-färgning burk innehållande nyberedda 1% formaldehyd / 1x PBS / MgCl2 under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna i 5 minuter i en annan glasskiva-färgning burk innehåller 1x PBS vid rumstemperatur, skakning.
- Förbered en etanol uttorkning serie genom att ha separata glas slide-färgningskärl innehållande 70%, 90% och 100% etanol.
- Överför objektglasen till varje burk i 3 min, med början med 70% etanol, därefter 90% etanol och sedan 100% etanol. Placera etanol burkar vid -20 ° C när den är klar.
- Låt bilderna lufttorka genom att knacka överskott av etanol på en pappershandduk och propping glider vid en 35 ° vinkel. När torr, mark ett 18 x 18 mm-området för hybridisering på baksidan av objektglasen med användning av en diamantpenna.
- Denaturering av Slides för FISH
- Applicera 120 l 70% avjoniserat formamid / 2X SSC till en 24 x 60 mm täckglas. Tryck på fingret till täckglas. Denaturera sliden vid 80 ° C på en varm platta till 90 sek.
- Snabbt och noggrant glida av täckglas och placera objektglaset i iskall 70% etanol under 3 min, följt av 90% etanol och 100% etanol vardera för 3 min. Låt bilderna lufttorka.
- Bered en fuktig kammare genom beklädnad av en plastlåda med ett tätt lock och våt tissuepapper. Pappret ska vara fuktigt, men inte mättad med vatten.
- I en fuktig kammare, tillämpa pre-glödgade sondblandningen från steg 4.1.3 till det markerade området på bilden, täck med en 18 x 18 mm täckglas och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Post-inkubationstider Tvättar
- Pre-varm 50% formamid / 2 x SSC, 1 x SSC och 4x SSC / 0,1% Tween-20 i en 45 °; C vattenbad.
- Ta försiktigt bort täckglasen och tvätta glasen i förvärmda 50% formamid / 2x SSC 3xfor 5 min vardera i mörkret och skaka. Tvätta bilderna i förvärmda 1x SSC 3xfor 5 minuter vardera, skakning. Slutligen, tvätta glasen i förvärmda 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 min vardera.
- Färga glasen i 3 min i DAPI i en ljus skyddad glasskiva-färgning burk.
- Tvätta bilderna i 5 min i 2x SSC, skakar. Applicera 35 ìl av Mowiol monteringsmedium, täck med 24 x 60 mm täckglas och lagra bilderna vid 4 ° C.
5. mikroskopisk analys av kromosomer
- Analysera metafas diabilder med en vanlig epi-fluorescensmikroskop. Använd en avbildning plattform med en automatiserad stadium såsom MetaSystems Metafer plattform för att uppnå bästa resultat. För varje metafas spridning, samla en bild för DAPI fluorescens att visualisera kromosomer, och en bild för den fluorescerande signalen från telomeren pmantel. (T.ex. Cy3- andra fluorer finns tillgängliga och fungerar lika bra.)
- Överlägg bilderna med ett bildanalysprogram och analysera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metafaskromosomer härledda från en cell bör bilda ett diskret klustret innehållande 40 kromosomer (om att använda musceller) (figur 1A). Varje kromosom har en centromer i ena änden, vilket syns som en ljusblå sfär. I normala kromosomer är två telomeren signaler ses i slutet av kromatiderna och två signaler från varje centromer. Interfaskärnor kommer att vara närvarande på objektglaset samt. Dessa kommer att vara synlig som blå sfärer, med röda telomeren signaler, men inga kondense kromosomer (se till exempel Figur 1B). Interfaskärnorna kan ignoreras i syfte att kvantifiera genomisk instabilitet.
Kan observeras Ett antal olika typer av kromosomavvikelser. Kromatidbrott är avbrott i en av de två systerkromatider som utgör varje metafas kromosom. De kan görs om utredaren ser en diskontinuitet i en kromatid, eller förlust av en enda telomer signal från ena änden ofa kromosom (se exempel i Figur 1B). Kromosombrott identifieras genom att söka efter förlust av telomeren signaler från en ände av en kromosom (t ex i figur 1C). I vissa fall kan observeras den brutna änden av kromosom som ett fragment med telomeren signaler i samma metafas spridning (såsom är fallet i figur 1C). I andra fall kan kromosomänden inte vara närvarande.
Flera typer av kromosom omdisponeringar kan observeras. Radial kromosomer ta ett antal former, som kännetecknas av komplicerade omflyttningar som involverar två kromosomer (tre exempel visas med röda pilar i figur 1D). Radial kromosomer inkluderar även mer komplexa omdisponeringar, som omfattar tre eller flera kromosomer. Kromosomer kan också bli ihop till dicentric kromosomer, som visas som en end-to-end-fusion av kromosomer med centromer i båda ändar (visas med en vit pil i figur 1D </ Strong>). Robertsonian sloka är en typ av transloka mellan centromer av två kromosomer, som visas som fyra systerkromatidutbyten armar kopplade till en enda centromer (visas i figur 1E).
Figur 1F visar en metafas som inte har telomeren signaler närvarande. Frånvaro av telomeren signaler kan förekomma från fel i sonden beredning eller luftbubblor i täckglas under hybridisering.
Figur 1 kromosomavvikelser hos mus B-celler som visualiseras genom PNA telomer FISH. A) Kromosom strukturen för en vanlig mus B cell i metafas. 40 kromosomer är synliga, med två telomeren signaler vid vardera änden. B) En cell visar två kromatidbrott (gröna pilar). C) D) En cell som visar tre radiella kromosomer (röda pilar) och en dicentric kromosom (vit pil). E) En metafas sprids med en kromosom med en Robertsonian sloka (gul pil ). F) Ett exempel på en misslyckad hybridisering, visar kromosomer utan telomeren signaler. Skalan stapel representerar 10 mikrometer i varje bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skäl aktiverade B-lymfocyter är särskilt lämpade för framställning av mitotiska kromosom uppslag, kan andra celltyper även användas. T-lymfocyter delar många av fördelarna med B-celler, eftersom de kan renas från mjälte eller lymfkörtlar, och har ett högt mitotiskt index när de stimuleras genom odling i medium innehållande lämpliga mitogener 8. Embryonala stamceller (ES-celler) lämpar sig även för metafas kromosomanalys 9. Om dessa inte är tillgängliga, kan fibroblastceller användas, även om en längre behandling med kolcemid (t ex 16 h med kolcemid vid en slutlig koncentration på 10 ng / ml) rekommenderas att fånga fler celler i metafas före fixering.
Vi finner att konsekvensen i utarbetandet av metafas sprider underlättas i hög grad genom att släppa de fasta kromosomerna i en kontrollerad fuktkammare såsom Thermotron CDS-5 Cytogenetic Drying avdelningen, men det är möjligt att få bra resultat while arbeta på en bänk beroende på luftfuktighet och temperatur i labbmiljö. För att få tillförlitliga resultat, är det lämpligt att göra mål kromosomavvikelser från minst 100 metafaser per prov. Eftersom processen att manuellt avbildning varje metafas i varje kanal kan vara mödosamt, vi förvärvar metafaser med en Metasystems Metafer4 automatiserad mikroskopering system, som snabbt kan hitta och noggrant skanna ett stort antal metafaskromosomer.
Analys av metafaskromosomer märkta med telomeren prober är idealisk för mätning av kromosom och kromatidbrott och telomeren signaler stöd även identifiering av komplexa kromosomomarrangemang, såsom fusioner och radialstrukturer. Färgning av fasta metafaskromosomer med Giemsa lösning är även lämplig för kvantifiering av kromosomavvikelser, och erbjuder fördelen av att inte kräva fluorescensmikroskopi 10. Märkning telomerer med en pantelomeric PNA prob förlänger ringdee av kromosomavvikelser som kan kvantifieras, genom att tillåta identifiering av telomeren fusioner, som uppstår, till exempel, i celler från DNAPKcs-knockoutmöss 11. PNA-FISH kan också användas för att mäta frekvensen av telomeren abnormaliteter, inklusive kromosom telomeren fördubblingar och kromatid telomer förlust 12,13. Förlust av en telomer signal kan orsakas av telomerförkortning liksom genom kromosombrott. PNA-FISH kan användas för att varsamt mäta telomerlängd använder Q-FISH (kvantitativ FISH) 14.
Celler som saknar olika DNA-reparationsverksamhet brukar samlas olika typer av kromosomavvikelser. Till exempel brister i DNA-skada svarsfaktor 53BP1, leder till ansamling av kromosombrott 15. Däremot är en hög andel av komplexa radiella kromosomstrukturer observerades i celler som saknar BRCA1 4. Dessa kromosom omorganiseringar är varierade i deras exakta struktur,men alltid involverar fusion av material från två eller flera kromosomer. När cellerna har mycket höga halter av genomisk instabilitet, som till exempel uppstår efter behandling med höga doser av ämnen som orsakar DNA-brott, blir det allt svårare att göra mål enskilda kromosomavvikelser, som sätter en gräns för det dynamiska omfånget av experimentet.
Kvantifiering av kromosombrott och omorganiseringar i metafas uppslag är användbar för att testa om specifika gener har en roll i DNA-reparation. Ett potentiellt problem i att använda metafas kromosomanalys för detta ändamål är att celler som saknar DNA-reparationsverksamhet inte kan växa normalt. Om reparation fattiga celler inte når metafas, kan vikten av en gen för att förmedla DNA-reparation underskattas. Exempelvis RNF8 - / - celler, som är föremål för p53-beroende åldrande, visar en blygsam nivå av kromosom instabilitet, medan RNF8 - / - p53 - / - Dubbel knockout celler visar maNY mer kromosomavvikelser, eftersom deletion av p53 ger bättre celltillväxt 16. Därför är det viktigt att koppla ihop mätningar av kromosom instabilitet med en cellcykelanalys, för att visa att knockout cellpopulationer kan växa normalt och innehåller en meningsfull andel mitotiska celler.
Observationen av genomisk instabilitet inte i sig ger insikt i den exakta funktionen av en reparationsaktivitet tillhandahålls av en specifik gen, utan endast fungerar som en utgångspunkt för ytterligare mekanistiska studier. Slutligen, även om denna metod är användbar för mätning av kromosombrott och komplexa omlagringar, är användningen av mFISH eller SKY rekommenderas för kvantifiering kromosomtranslokationer. Dessa tekniker börjar också med metafas kromosom uppslag, men använder en cocktail av sonder att "måla" varje kromosom med en specifik kombination av fluoroforer. Endera av dessa metoder rekommenderas för att mäta det fulla spektrat av kromosom instabbilitet i reparationsfattiga celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH bidrag R00 CA160574 (SFB) och av en gemenskap av Rutgers Biotechnology Training Program (till SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
