Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH

Published: August 19, 2014 doi: 10.3791/51806
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers, the State University of New Jersey

Summary

مسارات إصلاح الحمض النووي ضرورية لصيانة سلامة الجينوم ومنع الطفرات والسرطان. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني عن طريق الملاحظة المباشرة للانحرافات في الكروموسومات الطورية ينتشر من خلايا B الماوس باستخدام الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) ليكرر DNA الكروموسومات في.

Abstract

إصلاح خلل الحمض النووي يؤدي إلى زيادة عدم الاستقرار الجيني، والذي هو السبب الجذري للطفرات التي تؤدي إلى تكون الأورام. تحليل وتيرة ونوع من الانحرافات الصبغية في أنواع مختلفة من الخلايا يسمح عيوب في مسارات إصلاح الحمض النووي ليتم توضيح. وقد ساعد فهم الثدييات إصلاح الحمض النووي البيولوجيا كثيرا من إنتاج فئران مصابة بالضربة القاضية في جينات معينة. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني في الخلايا الليمفاوية B الماوس. وضع العلامات على التيلوميرات باستخدام تحقيقات PNA-FISH (ببتيد الحمض النووي - فلوري في الموقع التهجين) يسهل تحليل سريع من عدم الاستقرار الجيني في كروموزوم ينتشر الطورية. خلايا B لديها مزايا نسبية محددة على الخلايا الليفية، لأن لديهم الصيغة الصبغية الطبيعي ومؤشر الإنقسامية العالي. وبالتالي الثقافة على المدى القصير من خلايا B يمكن قياس دقيق من عدم الاستقرار الجيني في السكان الخلية الأساسي الذي من المرجح أن يكون أقل طفرة جينية الثانويةق مما هو عادة موجودة في الخلايا الليفية تتحول أو خطوط الخلايا المرضى.

Introduction

ويتسبب السرطان عن طريق تراكم الطفرات التي تؤثر على الجينات التي تنظم نمو الخلايا العادية. الطفرة هي نتيجة للتغيرات في هيكل وتسلسل الجينوم الناجمة عن الأضرار التي لحقت الحمض النووي. يمكن أن يحدث التلف في الحمض النووي من خلال مجموعة متنوعة من العملية، بما في ذلك العوامل خارجية مثل الإشعاع المؤين، وكناتج نتاج الأيض الخلوي العادي، مثل نزع الأمين التلقائي للقواعد النوكليوتيدات أو ضرر يحدث عن طريق الاتصال مع أنواع الاكسجين التفاعلية 1.

على الرغم من أن خلايا الثدييات تمتلك مجموعة من الأنشطة التي يمكن أن إصلاح الحمض النووي من التلف أو عكس استعادة تسلسل في مواقع انقطاع، مع ذلك الطفرات تتراكم طوال فترة حياة الخلية. التلف في الحمض النووي يمكن أن تساهم علاوة على الشيخوخة وفقدان فاعلية الخلايا الجذعية، وهما العمليات التي ترتبط مع المرض الناجمة عن الشيخوخة 2. فهم إصلاح الحمض النووي من التلف لذلك من أهمية مركزية في معالجة اثنين علامةقضايا ificant في الصحة العامة. تشير أدلة متزايدة على أن الثدييات مسارات إصلاح الحمض النووي يمكن أن تسهم في تطور جينوم الخلايا السرطانية 3،4، مما يزيد من ضرورة لفهم العمليات التي تدخل في قمع طفرة على المستوى الجزيئي.

التصور المباشر من الانحرافات الكروموسومات هي وسيلة قوية وكمية من تحديد مدى عدم الاستقرار الجيني في نوع من الخلايا معين. الكروموسومات المختصرة من الخلايا في الطورية يمكن عزل وتفتيشها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت. لقد حققت هذه المناهج الوراثية الخلوية في الممارسة العملية لعدة عقود، ويمكن استخدامها للتدليل على ظهور translocations أو أنواع معينة من الانحرافات الصبغية المرتبطة بفقدان أنشطة إصلاح الحمض النووي. بروتوكول يفسح المجال لعدة ملحقات المحتملة: يمكن أن توصف الكروموسومات مع تحقيقات لتنميط نووي الطيفي (SKY) أو متعدد الألوان فلوري التهجين في الموقع(mFISH) لتحديد translocations 5،6. كما تمكن هذه التقنيات وتيرة translocations الصبغي وهيكل translocations الصبغي معقدة يتم تحديدها، الذي يوفر معلومات إضافية تتجاوز ما هو ممكن مع هذا البروتوكول. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد تحقيقات تسلسل معين وتستخدم لاختبار تردد الكسر DNA في مواقع الجينومية اختيار 7.

في هذا البروتوكول، ونحن تصف إعداد كروموسوم الطورية ينتشر من الخلايا الليمفاوية B. يستخدم الببتيد حمض النووي (PNA) التحقيق fluorescently المسمى ليكرر الكروموسومات، الذي يصادف التيلوميرات بكفاءة في كروموسوم الطورية ينتشر هذا البروتوكول لديه العديد من المزايا. خلايا B يمكن أن يتسبب في النمو في مؤشر الإنقسامية عالية جدا، بحيث يمكن أن تنتج باستمرار هوامش عالية الجودة. خلايا B من الفئران المعدلة وراثيا هي أيضا أقل احتمالا لاحتواء الطفرات الوراثية الثانوية التي يمكن أن نخلط تحليل مساهمة كبيرةجينات محددة لسلامة الجينوم. يمكن أن تكتمل النهج PNA-FISH في يوم واحد، ويسمح التهديف أكثر دقة من الاعفاءات كروموسوم. باستخدام هذا النهج، وخاصة في تركيبة مع معدات معينة الموصوفة في هذا البروتوكول، فمن الممكن لإنتاج متسقة للغاية، وينتشر عالية الجودة وتحليل بسرعة معدل ونوع من عدم الاستقرار الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق هذا الإجراء من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدم في روتجرز، جامعة ولاية نيو جيرسي. عولجت فئران وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يجب استشارة العلماء المنظمات الوطنية والمؤسسية للحيوان المبادئ التوجيهية الموضوعة والمعتمدة.

قبل البدء، وإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1.

1. B عزل الخليوي والتنشيط

الموت ببطء باستخدام الماوس CO 2 تليها خلع عنق الرحم. ضع الماوس وبالتالي فإن الجانب الأيسر من الجسم هو ما يصل رذاذ والفأر مع الايثانول 70٪ حتى هو الفراء رطبة. تشريح الطحال ومكان في 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع 2 مل غسل العازلة. في غطاء تدفق الصفحي، وكسر بلطف صعودا الطحال في طبق زراعة الأنسجة باستخدام نهاية شقة من حقنة 5 مل.

  1. إدراج 70 ميكرومتر شبكة النايلون إلى 50مل أنبوب ونقل عينة الطحال في 2 مل غسل العازلة داخل شبكة من النايلون. تعطيل بلطف الطحال في شبكة باستخدام نهاية شقة من الحقنة.
  2. شطف الجزء الخلفي من حقنة و35 ملم مع لوحة 8 مل من غسل العازلة وتصفية 70 ميكرون من خلال شبكة من النايلون. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. نضح وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 3 مل من ACK العازلة تحلل. ماصة صعودا وهبوطا لفترة وجيزة لتعطيل كتل واحتضان لمدة 5 دقائق. إضافة 10 مل من غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. نضح وتجاهل طاف و resuspend بيليه من خلال الاستفادة من الجزء السفلي من الأنبوب ثم من قبل pipetting في 1 مل من غسل العازلة. إضافة 50 ميكرولتر من مكافحة CD43 MACS الخرز الصغير واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. إضافة 10 مل من غسل العازلة، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة 10 مل من غسل العازلة، مزيج بلطف، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. تشكيل لالعمود المصغرة MACS عن طريق وضع عمود على المغناطيس MACS. وضع وصفت 15 مل أنبوب مخروطي تحت العمود. إضافة 1 مل من غسل العازلة إلى العمود والسماح لتشغيل وصولا إلى أنبوب 15 مل.
  6. نضح وطاف resuspend في 1 مل من غسل العازلة. تحميل العينة في العمود بعد تشغيل من خلال غسل العازلة.
  7. بعد تشغيل العينة من خلال العمود، إضافة 1 مل غسل عازلة لغسل العمود. إضافة 7 مل من غسل العازلة مباشرة إلى العينة التي تم جمعها في أنبوب 15 مل.
  8. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. نقل حجم المطلوب من الخلايا اللازمة ل5،000،000 خلية / جيدا في أنبوب 50 مل. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. الملحق المتوسطة خلية B مع LPS 1: 500 وIL4 1: 1،000.
  9. نضح طاف وإضافة حجم مناسب لاستكمال المتوسطة الخلايا B اللازمة لتركيز النهائي من 1،000،000 خلية / مل.
  10. لوحة الخلايا في 6 لوحات جيدة مع 5 مل من الخلايا في خلية 1،000،000 / مل ومكان في الرطوبة فيإد ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

2. B تثبيت خلية

  1. إضافة 50 ميكرولتر من colcemid إلى جانب تحتوي على 5 مل من الخلايا البائية (لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل)، واحتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. Prewarm 75 ملي بوكل حل في 37 ° C حمام الماء. نقل الخلايا B إلى المسمى أنبوب 15 مل. تغطية التسمية مع الشريط وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. نضح طاف وترك 1 مل في الأنبوب و resuspend بيليه من قبل pipetting. إضافة 5 مل من قطرة قطرة بوكل prewarmed بينما التنصت أو ينبض في دوامة.
  3. إضافة 10 مل من بوكل وتخلط بواسطة قلب. احتضان في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. إضافة 5 قطرات من تثبيتي الطازجة ومزيج من قلب. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف وترك 1 مل في الأنبوب و resuspend بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
  4. إضافة 5 مل من قطرة قطرة تثبيتي الطازجة بينما التنصت أو يتقطع على VORتكس. إضافة 10 مل إضافية من تثبيتي، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح طاف وترك 1 مل في أنبوب و resuspend من قبل pipetting. إضافة 14 مل من مثبت الطازجة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. كرر الخطوة 2.7 مرتين أكثر.
  7. إضافة 14 مل من تثبيتي الطازجة. ختم قبعات مع parafilm وتخزينها بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.

3. إعداد الطورية ينتشر كروموسوم

  1. وضع غرفة البيئية تنظم إلى 22.9 درجة مئوية والرطوبة 52٪.
  2. الطرد المركزي الخلايا B الثابتة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تثبيتي نضح ترك 70 ميكرولتر في الأنبوب و resuspend من قبل pipetting.
  3. وضع الشرائح وصفت في غرفة الرطوبة في زاوية 35 درجة. إسقاط 35 ميكرولتر من الخلايا B معلق على شريحة وإسقاط شريحتين لكل عينة. تسمح الشرائح لتجف في غرفة الرطوبة لمدة 30 دقيقة ثم تخزين الشرائحفي مربع الشريحة عند 37 درجة مئوية.

4. التيلومير السلطة الوطنية الفلسطينية FISH

  1. إعداد التحقيق
    1. الفورماميد منزوع الأيونات قبل الدافئ إلى 37 درجة مئوية. خلط 2 ميكرولتر من التيلومير التحقيق مع السلطة الوطنية الفلسطينية قبل تحسنت الفورماميد 7 ميكرولتر منزوع الأيونات واحتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة.
    2. قبل دافئ مزيج الرئيسي FISH إلى 37 درجة مئوية. إضافة 7 ميكرولتر قبل تحسنت مزيج الرئيسي FISH إلى خليط من الخطوة 4.1.1 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعة.
    3. تفسد الخليط التحقيق لمدة 8 دقائق عند 80 درجة مئوية. قبل يصلب التحقيق لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. المعالجة من الشرائح كروموسوم
    1. قبل تسخين وعاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على 50 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.01 M إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. مكان الشرائح في مختلف عاء زجاجي يحتوي على الشريحة تلطيخ 2X SSC لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة 2 ميكرولتر من الأسهم البيبسين على الزجاج قبل تحسنت الشريحة تلطيخ جرة وتخلط بواسطة قلب. نقل الشرائح لهذا SL زجاججرة IDE تلطيخ واحتضان 90 ثانية في 37 درجة مئوية.
    4. تغسل الشرائح 2X في مختلف عاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في درجة حرارة الغرفة، والهز. ثم تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X / MgCl 2 في درجة حرارة الغرفة، والهز.
    5. نقل الشرائح إلى وعاء زجاجي يحتوي على الشريحة تلطيخ الطازجة 1٪ الفورمالديهايد / 1X PBS / MgCl 2 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في مختلف عاء زجاجي الشريحة تلطيخ تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة، والهز.
    7. إعداد سلسلة الجفاف الايثانول من خلال وجود زجاج الجرار منفصل الشريحة تلطيخ تحتوي على 70٪، 90٪، والإيثانول بنسبة 100٪.
    8. نقل الشرائح إلى كل جرة لمدة 3 دقائق، بدءا من الايثانول 70٪، ثم 90٪ من الإيثانول، ثم الإيثانول بنسبة 100٪. وضع الجرار الإيثانول في -20 ° C عند الانتهاء.
    9. تسمح الشرائح للهواء الجاف من خلال استغلال الإيثانول الزائد على منشفة ورقية والذين يدعمون الشرائح في زاوية 35 درجة. مرة واحدة جافة، يا أماهRK مساحة 18 × 18 مم للتهجين على خلفية الشرائح باستخدام قلم الماس.
  3. تمسخ من الشرائح لFISH
    1. تطبيق الفورماميد 120 ميكرولتر 70٪ منزوع الأيونات / 2X SSC إلى 24 × 60 مم ساترة. تلمس الشريحة إلى ساترة. تفسد الشريحة في 80 درجة مئوية على طبق ساخن لمدة 90 ثانية.
    2. بسرعة وبدقة الانزلاق قبالة ساترة ومكان الشريحة في الجليد الباردة الايثانول 70٪ لمدة 3 دقائق، تليها 90٪ من الإيثانول، والإيثانول بنسبة 100٪ كل لمدة 3 دقائق. تسمح الشرائح للهواء الجاف.
    3. إعداد غرفة رطبة من بطانة مربع من البلاستيك مع غطاء محكم والمناديل الورقية المبللة. وينبغي أن تكون ورقة رطبة، ولكن ليس مشبعة بالماء.
    4. في غرفة رطبة، وتطبيق مزيج صلب التحقيق قبل من الخطوة 4.1.3 الى المجال ملحوظة على الشريحة، وتغطي مع 18 × 18 مم زلة تغطية واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. يغسل بعد الحضانة
    1. قبل دافئ 50٪ الفورماميد / SSC 2X، 1X SSC، و4X SSC / 0.1٪ توين 20 في 45 °، C حمام الماء.
    2. إزالة بعناية لل coverslips وتغسل الشرائح في درجة حرارة ما قبل 50٪ الفورماميد / 2X SSC 3xfor كل 5 دقائق في الظلام وتهتز. تغسل الشرائح في قبل تحسنت 1X SSC 3xfor كل 5 دقائق، والهز. أخيرا، وغسل الشرائح في قبل تحسنت 4X SSC / 0.1٪ توين 20 3xfor 5 دقائق لكل منهما.
    3. وصمة عار على الشرائح لمدة 3 دقائق في دابي في ضوء محمية الزجاج الشرائح تلطيخ الجرة.
    4. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في 2X SSC، والهز. تطبيق 35 ميكرولتر من Mowiol المتوسطة المتزايدة، مع تغطية 24 × 60 ملم coverslips وتخزين الشرائح في 4 درجات مئوية.

5. تحليل مجهرية من الكروموسومات

  1. تحليل الشرائح الطورية باستخدام مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان القياسية. استخدام منصة التصوير مع مرحلة الآلية مثل منصة MetaSystems Metafer للحصول على أفضل النتائج. لكل انتشار الطورية، وجمع صورة واحدة للدابي مضان لتصور الكروموسومات، وصورة واحدة للإشارة الفلورسنت من التيلومير صرداء. (على سبيل المثال، يتم fluors غيرها من Cy3- المتاحة ونعمل بنفس القدر أيضا.)
  2. تراكب الصور مع برنامج تحليل الصور وتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يجب الكروموسومات الطورية المشتقة من خلية واحدة تشكل مجموعة منفصلة تحتوي على 40 صبغيا (إذا باستخدام خلايا فأر) (الشكل 1A). كل كروموسوم يحتوي على السنترومير في نهاية واحدة، وهو أمر واضح باعتباره المجال الأزرق الفاتح. في الصبغيات العادية، وينظر إشارتين التيلومير في نهاية الصبغيات وإشارتين من قبل كل السنترومير. سوف نواة الطور البيني تكون موجودة على الشريحة كذلك. وهذه تكون مرئية والمجالات الأزرق، مع إشارات التيلومير الحمراء، ولكن لا الكروموسومات المختصرة (انظر على سبيل المثال الشكل 1B). يمكن تجاهلها نواة الطور البيني لأغراض قياس عدم الاستقرار الجيني.

ويمكن ملاحظة عدد من أنواع مختلفة من الانحرافات الصبغية. فواصل فواصل الكروماتيدات هي في واحدة من اثنين من الصبغيات الشقيقة التي تشكل كل كروموسوم الطورية. يمكن إذا أحرز يرى المحقق انقطاع في الكروماتيدات واحد، أو فقدان إشارة التيلومير واحدة من نهاية واحدة ساتحاد كرة القدم الصبغي (انظر الأمثلة في الشكل 1B). يتم تحديد فواصل كروموسوم بالبحث عن فقدان الإشارات التيلومير واحدة من نهاية الكروموسوم (على سبيل المثال في الشكل 1C). في بعض الحالات، نهاية المكسورة من الكروموسوم يمكن ملاحظة وجزء مع إشارات التيلومير في نفس انتشار الطورية (كما هو الحال في الشكل 1C). في حالات أخرى، في نهاية الكروموسوم قد لا تكون موجودة.

يمكن ملاحظة عدة أنواع من إعادة ترتيب الكروموسومات. الكروموسومات شعاعي تتخذ عددا من الأشكال، وتتميز إعادة ترتيب المعقدة التي تنطوي على اثنين من الكروموسومات (ثلاثة وترد أمثلة مع السهام الحمراء في الشكل 1D). تشمل أيضا إعادة ترتيب الكروموسومات شعاعي أكثر تعقيدا، وتشمل ثلاثة أو أكثر من الكروموسومات. قد تصبح أيضا الكروموسومات انضم لتشكيل الكروموسومات ذو مركزين، والتي تظهر باعتبارها الانصهار نهاية إلى نهاية الكروموسومات مع القسيم عند كلا الطرفين (كما هو موضح مع السهم الأبيض في الشكل 1D </ قوي>). translocations روبرتسوني هي نوع من النبات بين القسيم اثنين من الكروموسومات، والتي تبدو وكأنها أربعة أذرع الكروماتيدات الشقيقة تعلق على السنترومير واحد (ينظر في الشكل 1E).

ويبين الشكل 1F الطورية ليس لديها إشارات التيلومير الحاضر. يمكن أن يحدث غياب الإشارات التيلومير من الأخطاء في إعداد التحقيق أو فقاعات الهواء في ساترة خلال التهجين.

الشكل 1
الرقم 1. الانحرافات الكروموسومية في خلايا فأر B كما تصور من قبل السلطة الوطنية الفلسطينية FISH التيلومير. أ) هيكل كروموسوم الخلية B الماوس العادية في الطورية. 40 الكروموسومات واضحة، مع اثنين من الإشارات التيلومير على حد سواء. B) خلية العارضة لاثنين فواصل الكروماتيدات (الأسهم الخضراء). C) D) خلية عرض 3 الكروموسومات شعاعي (الأسهم الحمراء) وكروموسوم واحد ثنائي القسيم المركزي (السهم الأبيض). E) والطورية انتشار مع كروموسوم واحد مع إزفاء روبرتسوني (السهم الأصفر ). F) مثال على التهجين فشلت، تظهر الكروموسومات دون إشارات التيلومير. يمثل الشريط على نطاق و10 ميكرومتر في كل صورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بينما هي مناسبة خاصة الخلايا الليمفاوية B المنشط لإعداد ينتشر كروموسوم الإنقسامية، أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا. الخلايا اللمفية تي تشترك العديد من مزايا خلايا B، حيث يمكن تنقيته من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ولها مؤشر الإنقسامية عالية عندما حفز النمو في المتوسط ​​تحتوي mitogens مناسبة 8. هي مناسبة الخلايا الجذعية الجنينية (خلايا ES) أيضا لتحليل كروموسوم الطورية 9. إذا هذه ليست متاحة، والخلايا الليفية يمكن استخدامها، على الرغم من أن العلاج أطول مع colcemid (على سبيل المثال، 16 ساعة مع colcemid بتركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل) ويوصى إلى اعتراض أكثر من الخلايا في الطورية قبل التثبيت.

نجد أن الاتساق في إعداد الطورية ينتشر مما يسهل إلى حد كبير من خلال إسقاط الكروموسومات ثابتة في غرفة الرطوبة تسيطر عليها مثل CDS-5 اختبار حرارية راثي خلوي غرفة التجفيف، ولكن من الممكن الحصول على نتائج جيدة WHإيل يعمل في مقاعد البدلاء اعتمادا على الرطوبة ودرجة الحرارة في بيئة معملية. للحصول على نتائج موثوقة، فإنه من المستحسن أن يسجل الانحرافات كروموسوم من لا يقل عن 100 metaphases لكل عينة. كما أن عملية التصوير يدويا في كل الطورية في كل قناة يمكن أن يكون شاقة، ونحن الحصول metaphases باستخدام نظام المجهر الآلي Metasystems Metafer4، والتي يمكن العثور بسرعة ومسح عدد كبير من الكروموسومات الطورية بدقة.

تحليل الكروموسومات الطورية المسمى مع تحقيقات التيلومير هو المثالي لقياس كروموسوم والكروماتيدات فواصل، وإشارات التيلومير أيضا تساعد على تحديد إعادة ترتيب الكروموسومات معقدة مثل اندماج والهياكل شعاعي. تلطيخ من الكروموسومات الطورية ثابتة مع حل غيمزا هو أيضا مناسبة لقياس الانحرافات الصبغية، ويوفر ميزة لا تتطلب فلوري المجهر 10. وصفها التيلوميرات مع التحقيق الذي تجريه السلطة الوطنية الفلسطينية pantelomeric يمتد رن(ه) من الانحرافات الصبغية التي يمكن قياسها كميا، من خلال السماح للاندماج تحديد التيلومير، التي تنشأ، على سبيل المثال، في الخلايا من الفئران خروج المغلوب DNAPKcs-11. ويمكن أيضا PNA-FISH أن تستخدم لقياس ترددات شذوذ التيلومير، بما في ذلك كروموسوم الازدواجية التيلومير والكروماتيدات فقدان التيلومير 12،13. فقدان إشارة التيلومير يمكن أن يكون سبب تقصير التيلومير فضلا عن كروموسوم الكسر. PNA-FISH يمكن استخدامها لقياس طول التيلومير بحساسية باستخدام Q-FISH (FISH الكمي) 14.

خلايا تفتقر مختلف الأنشطة إصلاح الحمض النووي تتراكم أنواع مختلفة من الانحرافات الصبغية. على سبيل المثال، نقص في الحمض النووي ردا ضرر العامل 53BP1، يؤدي إلى تراكم يكسر كروموسوم 15. على النقيض من ذلك، لوحظت نسبة عالية من الهياكل المعقدة شعاعي كروموسوم في الخلايا التي تفتقر إلى BRCA1 4. هذه إعادة ترتيب الكروموسومات متنوعة في بنيتها المحدد،ولكنها تنطوي دائما الانصهار من المواد في اثنين أو أكثر من الكروموسومات. عندما الخلايا لديها مستويات عالية جدا من عدم الاستقرار الجيني، كما يحدث مثلا لبعد العلاج مع جرعات عالية من العوامل التي تسبب فواصل الحمض النووي، يصبح من الصعب على نحو متزايد ليسجل الانحرافات الصبغية الفردية، الأمر الذي يضع حدا لمجموعة ديناميكية من التجربة.

الكمي للفواصل وإعادة ترتيب الكروموسومات في هوامش الطورية مفيد لاختبار ما إذا كانت جينات معينة لها دور في إصلاح الحمض النووي. واحدة مشكلة محتملة في استخدام تحليل كروموسوم الطورية لهذا الغرض هي أن الخلايا التي تفتقر إلى أنشطة إصلاح الحمض النووي قد لا تنمو بشكل طبيعي. إذا خلايا إصلاح ناقص لا تصل الطورية، يمكن التقليل من أهمية وجود الجين للوساطة في إصلاح الحمض النووي. على سبيل المثال، RNF8 - / - الخلايا، والتي تخضع لتعتمد على البروتين p53 الشيخوخة، تظهر مستوى متواضع من عدم الاستقرار كروموسوم، في حين RNF8 - تظهر خلايا المزدوج خروج المغلوب أماه - / - P53 - /نيويورك الانحرافات أكثر كروموسوم، لأن الحذف من البروتين p53 يسمح أفضل نمو الخلايا 16. ولذلك فمن المهم أن الزوج القياسات من عدم الاستقرار كروموسوم مع مقايسة دورة الخلية، يمكن أن تظهر أن السكان الخلية خروج المغلوب تنمو بشكل طبيعي وتحتوي على نسبة ذات مغزى الخلايا الإنقسامية.

مراقبة عدم الاستقرار الجيني لا في حد ذاته يعطي نظرة ثاقبة وظيفة الدقيقة لنشاط الإصلاح المقدمة من جين معين، ولكن مجرد تعمل كنقطة انطلاق لمزيد من الدراسات الميكانيكية. وأخيرا، على الرغم من أن هذا النهج هو مفيد لقياس فواصل كروموسوم إعادة ترتيب ومعقدة، فمن المستحسن استخدام mFISH أو SKY لقياس translocations الصبغي. تبدأ هذه التقنيات أيضا مع هوامش الطورية كروموسوم، ولكن استخدام مزيج من التحقيقات أن "الطلاء" كل كروموسوم مع مجموعة محددة من fluorophores. أي من هذه التقنيات ويوصى لقياس الطيف الكامل من الصبغي instability في خلايا إصلاح ناقص.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم المصالح المتضاربة.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00 CA160574 (SFB) وزمالة من برنامج التدريب التكنولوجيا الحيوية روتجرز (إلى SMM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Dextran sulfate Intergen S4030
Deionized formamide Ambion 9342
Pepsin (5 g) Sigma P 6887 
FCS Gemini 100-106
LPS (100 mg) Sigma L2630
IL-4 (5 μg) Sigma I1020
PNA Telomere Probe PNA Bio Inc F1002 (CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid Roche 295892
Mowiol 4-88 Sigma 81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads Miltenyl Biotec. 130-049-801
DAPI Sigma 32670-5MG
Eclipse E800 Nikon
AxioImager.Z2 Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber Thermotron

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
  2. Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
  3. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  4. Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
  5. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
  6. Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
  8. Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  9. Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
  11. Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
  12. Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
  13. Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
  14. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
  15. Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
  16. Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).

Tags

علم المناعة، العدد 90، عدم الاستقرار الجيني، وإصلاح الحمض النووي، والماوس، وانتشار الطورية، FISH، والثقافة الابتدائية
تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid … More

Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. J. Vis. Exp. (90), e51806, doi:10.3791/51806 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter