Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Published: August 19, 2014 doi: 10.3791/51806

Summary

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Abstract

Defecte DNA herstel leidt tot genomische instabiliteit, wat de oorzaak van mutaties die leiden tot tumorvorming toegenomen. Analyse van de frequentie en de aard van de chromosoomafwijkingen in verschillende celtypes laat defecten in DNA-herstel trajecten worden opgehelderd. Inzicht zoogdieren DNA-reparatie biologie is enorm geholpen door de productie van muizen met uitstoters in specifieke genen. Het doel van dit protocol is om genomische instabiliteit in de muis B-lymfocyten te kwantificeren. Etikettering van de telomeren met PNA-FISH probes (peptide nucleïnezuur - fluorescerende in situ hybridisatie) vergemakkelijkt de snelle analyse van genomische instabiliteit in metafase chromosoom spreads. B-cellen hebben specifieke voordelen ten opzichte van fibroblasten, omdat ze normaal ploïdie en een hogere mitotische index. Korte termijn kweek van B-cellen kunnen dus nauwkeurige meting van genomische instabiliteit in een primaire celpopulatie die waarschijnlijk minder secundaire genetische mutaties dan is typisch in getransformeerde fibroblasten of patiënt cellijnen.

Introduction

Kanker wordt veroorzaakt door de accumulatie van mutaties die genen die normale celgroei reguleren. Mutatie is een gevolg van veranderingen in de structuur en sequentie van het genoom veroorzaakt door beschadiging van DNA. DNA schade kan ontstaan ​​door een verscheidenheid van proces, waaronder exogene middelen zoals ioniserende straling, en als een bijproduct van normale cellulaire metabolisme zoals spontane deaminatie van nucleotide basen of schade ontstaat contact met reactieve zuurstof species 1.

Hoewel zoogdiercellen een scala aan reparatie activiteiten die DNA-schade kan terugdraaien of herstellen van de volgorde bij breuk locaties bezitten, mutaties toch verzamelen gedurende de levensduur van een cel. DNA schade kan bovendien bijdragen tot senescentie en verlies van vermogen van stamcellen, twee processen die zijn geassocieerd met veroudering geassocieerde ziekte 2. Inzicht in de reparatie van DNA-schade is daarom van vitaal belang voor het aanpakken van twee tekenificant vraagstukken in volksgezondheid. Meer gegevens suggereren dat zoogdier-DNA herstelmechanismen kan bijdragen aan de evolutie van de kankercel genoom 3,4, waardoor het nog noodzakelijk om de bij het ​​onderdrukken mutatie op moleculair niveau processen te begrijpen.

Directe visualisatie van chromosoomafwijkingen is een krachtige en kwantitatieve wijze bepalen van de mate van genomische instabiliteit in een bepaald celtype. Gecondenseerde chromosomen uit cellen in metafase kan worden geïsoleerd en geïnspecteerd door licht of fluorescentiemicroscopie. Dergelijke cytogenetische benaderingen in de praktijk al tientallen jaren en kan worden gebruikt om het uiterlijk van translocaties of specifieke types chromosoomafwijkingen aan een verminderde DNA reparatiewerkzaamheden tonen. Het protocol leent zich voor verschillende potentiële extensies: chromosomen kunnen met probes voor spectrale karyotypering (SKY) of meerkleurige fluorescerende in situ hybridisatie worden geëtiketteerd(MFISH) om translocaties 5,6 identificeren. Deze technieken de frequentie van chromosoom translocaties en de structuur van complexe chromosoom translocaties te bepalen, die aanvullende informatie biedt dan wat er mogelijk is met dit protocol in te schakelen ook. Alternatief kunnen sequentie-specifieke probes gegenereerd en gebruikt om de frequentie van DNA breuken testen geselecteerde genome locaties 7.

In dit protocol beschrijven we bereiding van metafase chromosoom spreads van B lymfocyten. Een fluorescentie-gemerkt peptide nucleïnezuur (PNA) probe voor telomeer herhalingen gebruikt, die efficiënt merken telomeren in metafase chromosoom spreads Dit protocol heeft verschillende voordelen. B-cellen kunnen worden geïnduceerd te groeien bij hoge mitotische index zodat hoogwaardige spreads logischerwijze kan worden geproduceerd. B-cellen van genetisch gemodificeerde muizen zijn ook veel minder waarschijnlijk secundaire genetische mutaties die de analyse van de bijdrage kan verwarren bevattenspecifieke genen genomische integriteit. De PNA-FISH aanpak kan in een dag worden afgerond, en maakt het mogelijk nauwkeuriger scoring van chromosoom breekt. Door deze benadering, met name in combinatie met specifieke apparatuur beschreven in dit protocol is het mogelijk om zeer consistent hoge kwaliteit spreads produceren en snel analyseren de snelheid en aard van genomische instabiliteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze procedure werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan Rutgers, de State University van New Jersey. Muizen werden behandeld in overeenstemming met de NIH Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren. Wetenschappers moeten hun nationale en institutionele dierlijke organisaties raadplegen voor gevestigde en erkende richtlijnen.

Voordat u begint, voor te bereiden van de in tabel 1 vermelde oplossingen.

1 B Cell Isolatie en Activering

Euthanaseren een muis met behulp van CO 2, gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats de muis, zodat de linkerkant van het lichaam is op en spuit de muis met 70% ethanol tot de vacht is vochtig. Ontleden de milt en in een 35 mm weefselkweekplaat met 2 ml wasbuffer. In een laminaire stroming kap voorzichtig breken de milt in de weefselkweek schaal met het vlakke uiteinde van een injectiespuit 5 ml.

  1. Plaats een 70 pm nylon mesh in een 50ml buisje en breng de milt monster in 2 ml wasbuffer in de nylon mesh. Voorzichtig verstoren de milt in het gaas met het platte uiteinde van de spuit.
  2. Spoel de achterkant van de injectiespuit en de 35 mm plaat met 8 ml wasbuffer en filtreer door 70 urn nylon mesh. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  3. Zuig en gooi en resuspendeer de pellet in 3 ml ACK lysis buffer. Pipet op en neer kort om klonten te verstoren en incubeer gedurende 5 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  4. Zuig en verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door de bodem van de buis te tikken vervolgens pipetteren in 1 ml wasbuffer. Voeg 50 ul van anti-CD43 MACS micro-kralen en incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Voeg 10 ml wasbuffer, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  5. Het opzetten van eenMini-MACS kolom door het plaatsen van een kolom aan de MACS magneet. Plaats een gelabelde 15 ml conische buis onder de kolom. Voeg 1 ml wasbuffer naar kolom en laat doorlopen tot de 15 ml buis.
  6. Zuig het supernatant en resuspendeer in 1 ml wasbuffer. Plaats het monster in de kolom na het wassen buffer is doorgelopen.
  7. Nadat het monster door de kolom, 1 ml wasbuffer op de kolom te wassen. 7 ml wasbuffer direct naar opgevangen monster in de 15 ml buis.
  8. Tel de cellen met een hemocytometer. Breng de gewenste hoeveelheid cellen die nodig zijn voor 5.000.000 cellen / putje in een 50 ml buis. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Supplement B-celmedium met LPS 1: 500 en IL4 1: 1.000.
  9. Zuig het supernatant en voeg de juiste hoeveelheid aangevuld B celmedium nodig voor eindconcentratie van 1.000.000 cellen / ml.
  10. Plaat cellen in 6-well platen met 5 ml van cellen bij 1.000.000 cellen / ml en in een bevochtigered celkweek incubator bij 37 ° C, 5% CO2.

2 B Cell Fixation

  1. Voeg 50 ul van colcemide het putje met 5 ml van B-cellen (een eindconcentratie van 100 ng / ml) en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Voorverwarming 75 mM KCl oplossing in een 37 ° C waterbad. Breng de B-cellen een gelabeld 15 ml buis. Bedek het label met tape en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  2. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer de pellet door pipetteren. Voeg 5 ml van de voorverwarmde KCl druppelsgewijs terwijl tikken of pulseren op een vortex.
  3. Voeg 10 ml van KCl en meng door. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Voeg 5 druppels verse fixatief en meng door. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis en resuspendeer pellet door en neer te pipetteren.
  4. Voeg 5 ml vers fixatief er druppelsgewijs bij tikken of pulseren op een vortex. Een extra 10 ml fixeermiddel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  5. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in tube en resuspendeer door pipetteren. Voeg 14 ml vers fixeermiddel en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  6. Herhaal stap 2.7 tweemaal.
  7. Voeg 14 ml vers fixeermiddel. Sluit de doppen met Parafilm en bewaar overnacht bij -20 ° C.

3 Voorbereiding van de metafase chromosoom Spreads

  1. Stel een gereguleerd klimaatkamer tot 22,9 ° C en 52% luchtvochtigheid.
  2. Centrifugeer de vaste B-cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Zuig fixeermiddel verlaten 70 ul in de buis en resuspendeer door pipetteren.
  3. Plaats het label dia's in de vochtige kamer bij een 35 ° hoek. Drop 35 ul van de geresuspendeerde B-cellen op een dia en drop twee glaasjes per monster. Laat de dia's te drogen in de vochtige kamer gedurende 30 minuten vervolgens de dia's op te slaanin een dia doos bij 37 ° C.

4 telomeren PNA FISH

  1. Bereiding van Probe
    1. Pre-warm gedeïoniseerd formamide bij 37 ° C. Meng 2 ui telomere PNA probe met 7 pl gedeioniseerd voorverwarmde formamide en incubeer bij 37 ° C onder schudden gedurende 1 uur.
    2. Pre-warme FISH master mix tot 37 ° C. Voeg 7 ul voorverwarmde FISH master mix aan het mengsel van stap 4.1.1 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1-3 uur.
    3. Denatureren de sonde mengsel gedurende 8 minuten bij 80 ° C. Pre-de probe hybridiseren gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  2. Voorbehandeling van chromosoom Slides
    1. Pre-warm een ​​glasplaatje-kleuring pot bevattende 50 ml 0,01 M HCl tot 37 ° C in een waterbad.
    2. Plaats de glaasjes in een andere objectglaasje-kleuring pot met 2x SSC gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    3. Voeg 2 pl pepsine bouillon aan de voorverwarmde glasplaatje-kleuring pot en meng door. Breng de dia's aan dit glas slide-kleuring pot en incubeer 90 seconden bij 37 ° C.
    4. Was de dia 2x in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur schudden. Was daarna de objectglaasjes gedurende 5 min in 1x PBS / MgCl2 bij kamertemperatuur schudden.
    5. Breng de dia een glasplaatje-kleuring pot die vers bereide 1% formaldehyde / 1x PBS / MgCl2 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
    6. Was de dia's voor 5 min in een andere objectglaasje-kleuring pot met 1x PBS bij kamertemperatuur schudden.
    7. Bereid een ethanol uitdroging serie van met verschillende glasplaatje-kleurbakjes bevattende 70%, 90% en 100% ethanol.
    8. Breng de objectglaasjes elke pot gedurende 3 minuten, te beginnen met 70% ethanol, vervolgens 90% ethanol en vervolgens 100% ethanol. Plaats ethanol potten bij -20 ° C als u klaar bent.
    9. Laat de dia's aan de lucht drogen door een teveel ethanol te tikken op een papieren handdoek en stutten dia's in een 35 ° hoek. Eenmaal droog, mark een 18 x 18 mm stippellijn voor hybridisatie op de achterkant van de objectglaasjes met een diamant pen.
  3. Denaturatie van Dia's voor FISH
    1. Solliciteer 120 ul 70% gedeïoniseerd formamide / 2X SSC tot een 24 x 60 mm dekglaasje. Tik op de schuif om het dekglaasje. Denatureren de glijbaan bij 80 ° C op een hete plaat gedurende 90 sec.
    2. Snel en voorzichtig schuif het dekglaasje en plaats de dia in ijskoude 70% ethanol gedurende 3 min, gevolgd door 90% ethanol en 100% ethanol elk voor 3 minuten. Laat de glaasjes aan de lucht drogen.
    3. Bereid een vochtige kamer door de voering van een plastic doos met een strakke deksel en nat vloeipapier. Het papier moet vochtig, maar niet verzadigd met water.
    4. In een vochtige kamer, passen de pre-gehybridiseerde probe-mengsel uit stap 4.1.3 tot het gemarkeerde gebied op de dia, bedekken met een 18 x 18 mm dekglaasje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
  4. Post-incubatie Wast
    1. Voorverwarmen 50% formamide / 2 x SSC, 1 x SSC en 4x SSC / 0,1% Tween-20 in een 45 °, C waterbad.
    2. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes en het wassen van de objectglaasjes in de voorverwarmde 50% formamide / 2x SSC 3xfor 5 min elk in het donker en schudden. Was de dia's in de voorverwarmde 1x SSC 3xfor 5 minuten elk, schudden. Tot slot, was de dia's in voorverwarmde 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 min elk.
    3. Vlekken op de dia's voor 3 min in DAPI in een licht beschermde glasplaatje kleuring pot.
    4. Was de dia's voor 5 min in 2x SSC, schudden. Breng 35 pl Mowiol fixeermiddel, behandel met 24 x 60 mm dekglaasjes en de glijbanen bewaren bij 4 ° C.

5 Microscopische analyse van Chromosomen

  1. Analyseer de metafase dia's met behulp van een standaard epi-fluorescentie microscoop. Gebruik een imaging platform met een geautomatiseerd stadium zoals de MetaSystems Metafer platform om de beste resultaten te verkrijgen. Voor elke metafase spread, voor het fluorescerend signaal van de telomeren p eentje op te halen het ene beeld voor DAPI fluorescentie om chromosomen te visualiseren, engewaad. (Bijvoorbeeld Cy3- andere fluoren zijn en even goed werken.)
  2. Overlay van de beelden met een beeldanalyse programma en analyseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metafase chromosomen afkomstig ve cel moet een discrete cluster met 40 chromosomen (bij gebruik muizencellen) (Figuur 1A) vormen. Elk chromosoom een ​​centromeer aan een einde, die zichtbaar als een lichtblauwe bol. In normale chromosomen, zijn twee telomeer signalen van eind van de chromatiden en twee signalen door elke centromeer. Interfase kernen zal aanwezig zijn op de foto ook. Deze zijn zichtbaar als blauwe bollen, rode telomere signalen, maar geen gecondenseerde chromosomen (zie bijvoorbeeld figuur 1B) zijn. De interfase kernen kunnen worden genegeerd voor de doeleinden van het kwantificeren genomische instabiliteit.

Een aantal verschillende types chromosoomafwijkingen kunnen worden waargenomen. Chromatide breuken zijn breuken in een van de twee zusterchromatiden die elke metafase chromosoom. Ze kunnen worden gemaakt indien de onderzoeker ziet een discontinuïteit in een chromatide of verlies van een enkel telomeer signaal vanaf een einde ofa chromosoom (zie voorbeelden in figuur 1B). Chromosoombreuk worden geïdentificeerd door te zoeken naar verlies van telomeren signalen van het ene uiteinde van een chromosoom (voorbeeld in figuur 1C). In sommige gevallen kan het gebroken uiteinde van het chromosoom worden waargenomen als een fragment met telomeer signalen in dezelfde metafase spread (zoals het geval is in figuur 1C). In andere gevallen kan het chromosoom einde niet aanwezig.

Verschillende soorten chromosoomherschikkingen worden waargenomen. Radial chromosomen nemen verschillende vormen, gekenmerkt door complexe herschikkingen waarbij twee chromosomen (drie voorbeelden getoond met rode pijlen in figuur 1D). Radiale chromosomen ook meer complexe herschikkingen, waarbij drie of meer chromosomen. Chromosomen kunnen ook worden verbonden dicentrische chromosomen, die als een end-to-end fusie van chromosomen met centromeren aan beide einden (getoond met een witte pijl in figuur 1D <verschijnt vormen/ Strong>). Robertsoniaanse translocaties zijn een soort translocatie tussen de centromeren twee chromosomen die vier zusterchromatiden armen bevestigd aan een centromeer (gezien in figuur 1E) lijken.

Figuur 1F toont een metafase die niet telomeren signalen heeft. Afwezigheid van telomere signalen optreden van fouten in de voorbereiding sonde of luchtbellen in het dekglaasje tijdens hybridisatie.

Figuur 1
Figuur 1 Chromosoomafwijkingen in muizen B cellen zoals gevisualiseerd door PNA telomere FISH. A) De chromosoom structuur van een normale muis B cel metafase. 40 chromosomen zijn zichtbaar, met twee telomeer signalen aan beide uiteinden. B) Een cel tonen twee chromatide breuken (groene pijlen). C) D) Een cel weergeven van 3 radiale chromosomen (rode pijlen) en een dicentrische chromosoom (witte pijl). E) Een metafase spread met een chromosoom met een Robertsoniaanse translocatie (gele pijl ). F) Een voorbeeld van een mislukte hybridisatie geeft chromosomen zonder telomere signalen. De schaal balk staat voor 10 micrometer in elk beeld. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dat geactiveerde B-lymfocyten zijn bijzonder geschikt voor bereiding van mitotische chromosomen smeersels kunnen andere celtypes worden gebruikt. T lymfocyten hebben veel van de voordelen van B-cellen, zoals ze kunnen worden gezuiverd uit de milt of lymfeknopen, en hebben een hoge mitotische index wanneer gestimuleerd door groei in medium dat adequate mitogenen 8. Embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn ook geschikt voor metafase chromosoom analyse 9. Indien deze niet beschikbaar zijn, kan fibroblast cellen worden gebruikt, hoewel een langere behandeling met colcemide (bijvoorbeeld 16 uur met colcemid bij een uiteindelijke concentratie van 10 ng / ml) wordt aangeraden te controleren meer cellen in metafase voor fixatie.

We vinden dat de samenhang van de bereiding van metafase smeersels wordt sterk vergemakkelijkt door het laten vallen vaste chromosomen in een gecontroleerde vochtigheid kamer zoals Thermotron CDS-5 cytogenetische droogkamer, maar het is mogelijk om goede resultaten te verkrijgen while werken bij een bank afhankelijk van de vochtigheid en temperatuur van de testomgeving. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, is het raadzaam om scoren chromosoom afwijkingen van ten minste 100 metafasen per monster. Aangezien het proces handmatig beeldvorming elke metafase in elk kanaal kan moeizaam zijn, verkrijgen we metafasen met een Metasystems Metafer4 geautomatiseerd microscopiesysteem, die snel en nauwkeurig voorbeeld scant een groot aantal metafase chromosomen.

Analyse van metafasechromosomen gelabeld met telomeren sondes is ideaal voor het meten van chromosoom en chromatide breuken, en de telomeer signalen de identificatie van complexe chromosoomherschikkingen zoals fusies en radiale structuren helpen ook. Kleuring van vaste metafase chromosomen met Giemsa oplossing is ook geschikt voor het kwantificeren chromosoomafwijkingen, en biedt het voordeel dat er geen fluorescentiemicroscopie 10. Het labelen van telomeren met een pantelomeric PNA probe breidt de range van chromosoomafwijkingen kunnen worden gekwantificeerd, doordat de identificatie van telomere fusies, die ontstaan, bijvoorbeeld in cellen van DNAPKcs-knockout-muizen 11. PNA-FISH kunnen ook worden gebruikt om de frequentie van telomere afwijkingen, waaronder chromosoom telomeer duplicaties en chromatide telomere verlies 12,13 meten. Verlies van telomeer signaal kan worden veroorzaakt door telomeerverkorting als door chromosoom breuk. PNA-FISH kan worden gebruikt om zorgvuldig te meten telomeerlengte met Q-FISH (kwantitatieve FISH) 14.

Cellen die verschillende DNA herstel activiteiten vaak verschillende chromosoomafwijkingen accumuleren. Bijvoorbeeld, deficiëntie in de DNA schade responsfactor 53BP1 leidt tot accumulatie van chromosoom 15 breekt. Daarentegen kan een grote hoeveelheid complexe radiale chromosoom structuren waargenomen in cellen die BRCA1 4. Deze chromosoom herschikkingen zijn gevarieerd in hun exacte structuur,maar altijd gepaard fusie van materiaal van twee of meer chromosomen. Wanneer cellen zeer hoge niveaus van genomische instabiliteit, zoals bijvoorbeeld optreedt na behandeling met hoge doses van middelen die DNA breuken, het steeds moeilijker om individuele chromosoomafwijkingen, die een beperking legt op het dynamische bereik van het experiment scoren.

Kwantificering van chromosoom breekt en herschikkingen in metafase spreads is handig om te testen of specifieke genen een rol bij DNA-herstel. Een potentieel probleem bij het gebruik van metafase chromosoom analyse voor dit doel is dat cellen die DNA-reparatie-activiteiten ontbreekt niet normaal kunnen groeien. Als reparatie-deficiënte cellen niet metafase te bereiken, kan het belang van een gen voor het bemiddelen van DNA-reparatie worden onderschat. Bijvoorbeeld, RNF8 - / - cellen, die onderworpen zijn aan p53-afhankelijke veroudering zijn, tonen een bescheiden niveau van chromosomale instabiliteit, terwijl RNF8 - / - p53 - / - double-knockout cellen tonen many meer chromosoomafwijkingen, omdat het schrappen van p53 zorgt voor een betere celgroei 16. Het is daarom belangrijk om metingen van chromosomale instabiliteit koppelen met een celcyclus assay aangetoond dat knockout celpopulaties kunnen groeien normaal en bevatten een zinvolle hoeveelheid mitotische cellen.

De waarneming van genomische instabiliteit op zich niet geven inzicht in de precieze functie van een reparatie-activiteit die door een specifiek gen, maar slechts fungeert als een startpunt voor meer mechanistische studies. Tot slot, hoewel deze benadering is nuttig voor het meten chromosoombreuk complexe herschikkingen, het gebruik van mFISH of SKY aanbevolen voor kwantificeren chromosoom translocaties. Deze technieken ook beginnen met metafase chromosoom spreads, maar gebruik maken van een cocktail van sondes die 'verf' elk chromosoom met een specifieke combinatie van fluoroforen. Elk van deze technieken wordt aanbevolen voor het meten van het volledige spectrum van chromosoom instabiliteit in reparatie-deficiënte cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​R00 CA160574 (SFB) en door een gemeenschap van de Rutgers Biotechnologie Training Program (naar SMM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50% Dextran sulfate Intergen S4030
Deionized formamide Ambion 9342
Pepsin (5 g) Sigma P 6887 
FCS Gemini 100-106
LPS (100 mg) Sigma L2630
IL-4 (5 μg) Sigma I1020
PNA Telomere Probe PNA Bio Inc F1002 (CCCTAACCCTAACCCTAA)
Colcemid Roche 295892
Mowiol 4-88 Sigma 81381-50g
CD43 (ly-48_) micro-beads Miltenyl Biotec. 130-049-801
DAPI Sigma 32670-5MG
Eclipse E800 Nikon
AxioImager.Z2 Zeiss
CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber Thermotron

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
  2. Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
  3. Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  4. Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
  5. Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
  6. Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
  7. Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
  8. Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  9. Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
  10. Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
  11. Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
  12. Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
  13. Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
  14. Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
  15. Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
  16. Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).

Tags

Immunologie instabiliteit van het genoom DNA reparatie muis metafase spread FISH primaire cultuur
Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid More

Misenko, S. M., Bunting, S. F. Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH. J. Vis. Exp. (90), e51806, doi:10.3791/51806 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter