Summary
DNA 수리 경로는 게놈 무결성의 유지 보수 및 예방 돌연변이 및 암 필수적이다. 이 프로토콜의 목적은 중기는 텔로미어 DNA 반복위한 원위치 혼성화 (FISH)에 형광체를 사용하여 마우스 B 세포로부터 확산에 염색체 이상을 직접 관찰하여 게놈 불안정성을 정량화하는 것이다.
Abstract
결함 DNA 수리 종양 이어질 돌연변이의 근본 원인 인 게놈 불안정성을 증가하도록 이끈다. 상이한 세포 유형에서 주파수 및 염색체 이상 유형의 분석은 DNA 복구 경로의 결함은 해명 할 수있다. 이해 포유 동물 DNA 수리 생물학이 크게 특정 유전자 녹아웃 생쥐의 생산에 도움이되고있다. 이 프로토콜의 목적은 마우스 B 림프구에서 게놈의 불안정성을 정량화하는 것이다. PNA-FISH 프로브 (펩티드 핵산 - 시츄 혼성화 형광)을 사용 텔로미어의 레이블링은 중기 염색체 스프레드 게놈 불안정성의 신속한 분석을 용이하게한다. 그들은 정상 배수성과 높은 유사 분열 인덱스를 가지고 있기 때문에 B 세포는 섬유 아세포에 비해 특정 장점을 가지고있다. B 세포의 단기 문화 따라서 적은 보조 유전자 변이를 가질 가능성이 차 세포 인구에 게놈 불안정성의 정확한 측정을 가능하게일반적으로 형질 전환 된 섬유 아세포 또는 환자의 세포 라인에있는 것보다의.
Introduction
암은 정상 세포의 성장을 조절하는 유전자에 영향을 미치는 돌연변이의 축적에 의해 발생합니다. 돌연변이 DNA의 손상에 의해 야기 게놈의 구조 및 서열에 대한 변경의 결과이다. DNA 손상 등의 전리 방사선 등 외인성 제제를 포함한 프로세스의 다양한 등을 통해 발생할 수있는 등의 활성 산소 종 (1)과 접촉하여 발생하는 뉴클레오티드 염기 또는 손상의 자발적인 탈 아미 노화 정상적인 세포 대사의 부산물로서.
포유 동물 세포가 DNA 손상 또는 역방향 브레이크 사이트의 시퀀스를 복원 할 수있는 보수 활동의 범위를 갖고 있지만, 그럼에도 불구하고 돌연변이 세포의 수명에 걸쳐 축적. DNA 손상은 또한 노화 - 관련 질환과 연관된 2 개의 프로세스를 노화 및 줄기 세포의 효능의 손실에 기여할 수있다. 이 응답을 어드레스에 따라서 중앙 중요성 DNA 손상의 복구된다 이해공중 보건 ificant 문제. 증거가 증가 포유류의 DNA 복구 경로가 더욱 필수적 돌연변이 분자 수준에서의 억제에 관여하는 과정을 이해하는 데있어 암세포 3,4 게놈의 발전에 기여할 수 있음을 시사한다.
염색체 이상을 직접 시각화는 특정 세포 유형에서 게놈의 불안정성의 정도를 판정하는 강력한 양적 수단이다. 중기에서 세포로부터 연유 염색체 분리 및 광 또는 형광 현미경을 사용하여 검사 될 수있다. 이러한 유전 학적 접근은 수십 년 동안 실제로 왔고 전좌 또는 DNA 복구 활동의 손실과 관련된 염색체 이상 특정 유형의 모양을 보여주기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 몇 가지 잠재적 인 확장에 빌려 준다 : 염색체가 현장 하이브리드의 스펙트럼 핵형 (SKY) 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 프로브를 표시 할 수(mFISH)는 전좌 5,6를 식별합니다. 이러한 기술은 또한이 프로토콜 가능합니다 것 이상으로 추가 정보를 제공 염색체 전좌의 빈도와 결정 복잡한 염색체 전좌의 구조를 가능하게한다. 대안 적으로, 특정 프로브 시퀀스가 생성되고 선택된 사이트 7 게놈 DNA에서 파손의 주파수를 테스트하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜에서는, 우리는 중기 염색체의 준비가 B 림프구에서 확산에 대해 설명합니다. 텔로미어 반복하는 형광 표지 된 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 효율적으로 중기 염색체에 텔로미어를 표시하는 데 사용되는이 프로토콜은 몇 가지 장점이 펼쳐집니다. B 세포는 높은 품질의 퍼짐 일관 제조 할 수 있도록 높은 유사 분열 지수 성장하도록 유도 될 수있다. 유전자 변형 마우스의 B 세포도 훨씬 덜 기여의 분석을 혼동 할 수 있습니다 차 유전 변이를 포함 할 가능성이있다게놈 무결성의 특정 유전자. PNA-FISH 방법은 하루에 완료하고, 염색체 휴식의보다 정확한 득점을 허용 할 수 있습니다. 특히 이런 프로토콜에 기재된 특정 장비와 함께,이 방법을 사용함으로써, 매우 일관된 고품질의 퍼짐을 생성하고 신속 레이트 및 게놈 불안정성의 유형을 분석 할 수있다.
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Protocol
이 절차는 럿 거스에서 기관 동물 관리 및 사용위원회, 뉴저지 주립 대학에 의해 승인되었습니다. 마우스는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 처리 하였다. 과학자들은 설립 승인 지침은 자신의 국가 및 기관 동물 조직을 문의해야합니다.
시작하기 전에 표 1에 나와있는 솔루션을 준비합니다.
1 B 세포의 분리 및 활성화
경추 탈구이어서 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. 몸의 왼쪽면이 위로 오도록 마우스를 위치시키고 모피에 습기가 될 때까지 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. 2 ML 세척 버퍼를 가지는 35mm 조직 배양 접시에 비장과 장소를 해부하다. 층류 후드에서 조심스럽게 5 ㎖ 주사기의 평평한 단부를 이용하여 조직 배양 접시에 비장을 분쇄.
- 50에 70 μm의 나일론 메쉬 삽입ML 튜브 및 나일론 메쉬로 2 ml의 세척 완충액에서 비장 샘플을 전송. 조심스럽게 주사기의 평평한 끝 부분을 사용하여 메쉬에서 비장을 방해.
- 세척 버퍼의 8 mL를 주사기의 뒷면 35mm 판을 씻어 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
- 기음은 상층 액을 제거하고 ACK 용해 버퍼의 3 ㎖에 펠렛을 재현 탁합니다. 대단히 짧은 시간을 방해하고 5 분 동안 배양 아래로 간단히를 피펫. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세척 버퍼와 원심 분리기 10 ML을 추가합니다.
- 대기음 상층 액을 제거하고 세척 완충액 1 ㎖에 피펫 팅 한 후 튜브의 바닥을 터치하여 펠렛을 재현 탁하고. 항-CD43 MACS 마이크로 비즈의 50 μl를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에, 세척 버퍼의 10 ML을 추가 부드럽게 섞어 원심 분리기.
- 설정MACS 자석에 열을 배치하여 미니-MACS 열입니다. 열 아래 표시된 15 ML 원뿔 튜브를 배치합니다. 열 세척 버퍼의 1 ML을 추가하고 15 ML 튜브를 통해 실행할 수 있습니다.
- 세척 완충액 1 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 기음. 세척 버퍼를 통해 실행 후 열에서 샘플을로드합니다.
- 샘플이 칼럼을 통해 실행 된 후, 열을 씻어 1 ML 세척 버퍼를 추가합니다. 직접 15 ML 튜브에 수집 된 샘플에 세척 버퍼의 7 ML을 추가합니다.
- 혈구를 사용하여 세포를 카운트. 50 ㎖의 튜브에 / 웰 5,000,000 세포에 필요한 세포의 필요한 양을 전송. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. LPS 1과 부록 B 세포 배지 : 500 IL4 일 : 1000.
- 상등액을 흡인하고 백만 세포 / ml의 최종 농도에 필요한 보충 된 B 세포 배지의 양을 적절한 추가.
- humidifi 1,000,000 세포 / ㎖과 장소에서 세포 5 ㎖를 6 - 웰 플레이트에서 플레이트 세포37 ° C에서 에드 세포 배양 인큐베이터, 5 % CO 2.
2 B 세포 고정
- 잘 (100 NG / ㎖의 최종 농도) B 세포의 5 mL를 함유하고 37 ℃에서 1 시간 배양 C에 colcemid의 50 μl를 추가합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 75 밀리미터의 KCl 솔루션입니다. 레이블이 15 ML 튜브로 B 세포를 전송합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 테이프와 원심 분리기와 레이블을 커버.
- 튜브에 1 ㎖에 떠나는 뜨는을 기음과 피펫으로 펠렛을 재현 탁. 누르거나 소용돌이에 펄스 동안 드롭에 의해 데워진의 KCl 드롭의 5 ML을 추가합니다.
- KCl을 10 ㎖를 추가하고 반전 섞는다. 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 품어. 반전 신선한 정착과 혼합 5 방울을 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 로 pipetting 아래로 튜브에 resuspend 펠렛 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음.
- 누르거나 보르에 펄스 동안 드롭으로 신선한 정착액 드롭의 5 ML을 추가텍스. 정착액의 추가 10 mL를 넣고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 피펫 팅 튜브에 resuspend 1 ML을 떠나 뜨는을 대기음. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 신선한 정착 원심 분리기의 14 ML을 추가합니다.
- 단계를 반복 2.7 두 번 더.
- 신선한 정착액의 14 ML을 추가합니다. 파라 필름으로 뚜껑을 밀봉 및 -20 ° C에서 하룻밤 저장합니다.
중기 염색체 스프레드의 3 준비
- 22.9 ° C 및 52 % 습도로 조절 된 환경 챔버를 설정합니다.
- 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 B 세포를 고정. 대기음은 피펫 팅 튜브와에 resuspend 70 μl를 떠나 정착액.
- 35 ° 각도로 습도 챔버에 표시된 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드에 재현 탁 B 세포의 35 μl를 삭제하고 샘플 당이 슬라이드를 놓습니다. 30 분 후 슬라이드를 저장하기위한 슬라이드 습도 챔버에서 건조하도록 허용37 ° C에서 슬라이드 상자에.
4 텔로미어 (telomere) PNA의 FISH
- 프로브의 제조
- 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 탈 포름 아미드. 7 ㎕의 탈 미리 예열 포름 아미드와 텔로미어 (telomere)의 PNA 프로브의 2 μl를 혼합하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 배양한다.
- 37 ° C에 대한 사전 따뜻한 FISH 마스터 믹스. 4.1.1 단계에서 혼합물에 7 ㎕를 미리 예열 FISH 마스터 믹스를 추가하고 1-3 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 80 ° C에서 8 분 동안 프로브 혼합물을 변성. 37 ° C에서 1 시간 동안 프로브를 사전 어닐링.
- 염색체 슬라이드의 전처리
- 수조에서 37 ° C로 0.01 M 염산 50 ㎖를 포함하는 유리 슬라이드 염색 항아리를 미리 따뜻하게.
- 실온에서 5 분 동안 2X SSC를 포함하는 다른 유리 슬라이드 오염성 항아리에 도시 슬라이드.
- 예열 유리 슬라이드 염색 항아리에 펩신 주식의 2 μl를 추가하고 반전 섞는다. 이 유리 SL에 슬라이드로 이동IDE-염색 항아리와 37 ° C에서 90 초를 배양.
- 슬라이드 떨고, 실온에서 5 분마다 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 배 씻으십시오. 그런 다음 떨고, 실온에서 1X PBS / MgCl2를 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 실온에서 10 분 동안 갓 제조 한 1 % 포름 알데히드 / PBS 1X / MgCl2를 함유 유리 슬라이드 오염성 항아리에 슬라이드를 이동.
- 떨고, 실온에서 1X PBS를 포함하는 다른 유리 슬라이드 염색 항아리에 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 70 %, 90 %, 및 100 % 에탄올을 함유하는 별도의 유리 슬라이드 염색 단지를 구비하여 탈수 에탄올 시리즈를 준비한다.
- 다음, 70 % 에탄올, 90 % 에탄올을 100 % 에탄올로 시작하여 3 분 동안 각 항아리에 슬라이드를 이동. 완료되면 -20 ° C에서 에탄올 항아리를 놓습니다.
- 종이 타월로 여분의 에탄올을 눌러과 35 ° 각도로 슬라이드를 지탱하여 건조 공기 슬라이드를 허용합니다. 일단 건조, mA다이아몬드 펜을 사용하여 슬라이드의 뒷면에 혼성화 18 X 18mm 영역 애먹.
- 물고기를 슬라이드의 변성
- 24 X 60mm coverslip에 120 ㎕의 70 % 탈 포름 아미드 / 2X SSC를 적용합니다. 커버 슬립에 슬라이드를 터치합니다. 90 초 동안 핫 플레이트에서 80 ° C에서 슬라이드를 변성.
- 신속하고 신중하게 커버 슬립을 밀어 넣고 3 분 동안 90 % 에탄올 다음 3 분, 100 % 에탄올 각 얼음 차가운 70 % 에탄올에 슬라이드를 배치합니다. 건조 공기 슬라이드를 허용합니다.
- 꽉 뚜껑 젖은 휴지와 플라스틱 상자를 안감으로 습기 챔버를 준비합니다. 용지에 습기가 될 수 있지만 물과 포화 안된다.
- 습기 챔버에서 슬라이드에 표시된 부분에 단계 4.1.3에서 사전 열처리 프로브 믹스를 적용 18 X 18mm 커버 슬립 커버와 1 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 후 배양 세척
- 사전 따뜻한 50 % 포름 아미드 / 2X SSC, 1X SSC, 그리고 4 배 SSC / 0.1 % 트윈 20 45 °에서; C 물 목욕.
- 조심스럽게 된 커버를 제거하고 어둠과 흔들림에 미리 예열 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC 3xfor 5 분에 각각의 슬라이드를 씻으십시오. 떨고 3xfor 5 분 미리 예열 1X SSC에 각각 슬라이드를 씻으십시오. 마지막으로, 예열 배 SSC에서 슬라이드를 씻어 / 0.1 % 트윈 20 3xfor 5 분 각을.
- 빛 보호 유리 슬라이드 염색 항아리에 DAPI에서 3 분 동안 슬라이드를 얼룩.
- 흔들리는 배 SSC에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 24 X 60mm의 커버 슬립 커버, Mowiol 장착 매체의 35 μl를 적용하고 4 ° C에서 슬라이드를 저장합니다.
염색체의 5 현미경 분석
- 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 중기 슬라이드를 분석한다. 최상의 결과를 얻기 위해 이러한 MetaSystems Metafer 플랫폼으로 자동 스테이지 이미징 플랫폼을 사용한다. DAPI 형광이 염색체를 시각화하기 위해 각각의 중기 스프레드를 들어, 하나의 이미지를 수집하고, 텔로미어 (P)으로부터 형광 신호에 대한 하나의 이미지가운. (예를 들어, Cy3- 다른 루어를 사용할 수 있으며 잘 동일하게 작동합니다.)
- 이미지 분석 프로그램과 영상을 오버레이 분석.
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Representative Results
하나의 셀로부터 유도 중기 염색체 (도 1a)를 (마우스의 세포를 사용하는 경우)를 함유하는 염색체 40 이산 클러스터를 형성한다. 각각의 염색체는 밝은 파란색 영역으로 표시 한 끝에서 중심 소체가 있습니다. 보통 염색체에서 텔로미어이 신호는 각 동원체 의해 염색 분체와 두 신호의 끝에서 볼 수있다. 간기 핵뿐만 아니라 슬라이드에 존재합니다. 다음은 빨간색 텔로미어 (telomere)의 신호에 파란색 분야,하지만 응축 된 염색체 (예 : 그림 1B에 대한 참조)로 표시됩니다. 간기 핵 게놈 불안정성을 정량화 할 목적으로 무시할 수있다.
염색체 이상 서로 다른 유형의 수는 관찰 될 수있다. 염색 분체가 나눠 각 중기 염색체를 구성하는 두 자매 염색 분체의 일에 휴식입니다. 연구자는 일단 오에서 하나의 텔로미어 (telomere) 신호의 한 염색 분체의 불연속 또는 손실을 보면 그들은 득점 할 수있다FA 염색체 (그림 1B의 예를 참조). 염색체 나누기 염색체 (그림 1C 예)의 한쪽 끝에서 텔로미어 (telomere) 신호의 손실을보고 식별됩니다. 어떤 경우에는, 염색체의 깨진 단부 (도 1C의 경우와 같이) 동일한 중기 스프레드 텔로미어 신호에 단편으로 관찰 할 수있다. 다른 경우에, 염색체 단부가 존재하지 않을 수있다.
염색체 재 배열의 몇 가지 유형을 관찰 할 수있다. 레이디 얼 염색체는 두 개의 염색체를 포함하는 복잡한 재 배열을 특징으로 다수의 형식을 취 (세 가지 예는 그림 1D에서 빨간색 화살표로 표시됩니다). 방사형 염색체 또한 세 개 이상의 염색체를 포함하는 더 복잡한 재 배열을 포함한다. 염색체도 될 수도 1D <에서 흰색 화살표로 도시 양단 중심절 염색체와 종단 간 융합 (로 표시 dicentric 염색체를 형성하는 접합/ strong>에서). Robertsonian 전좌 (그림 1E에서 본) 하나의 동원체에 부착 된 네 자매 염색 분체 무기로 나타납니다이 염색체의 중심절 사이의 전위의 유형입니다.
그림 1 층은 텔로미어 (telomere) 신호가 존재하지 않는 중기을 보여줍니다. 텔로미어 (telomere) 신호의 부재는 하이브리드 동안 coverslip에 프로브 준비 또는 공기 거품에 오류를 발생할 수 있습니다.
마우스 B 세포에서 그림 1 염색체 수차는 PNA의 텔로미어 FISH에 의해 시각으로. A) 중기에 정상적인 마우스의 B 세포의 염색체 구조. 40 염색체는 세포가 두 개의 염색 분체 나누기 (녹색 화살표). C)를 표시 양쪽 끝. B)에서이 텔로미어 (telomere) 신호로 볼 수 있습니다 D) 3 반경 염색체 (빨간색 화살표)과 한 dicentric 염색체 (흰색 화살표) Robertsonian 전좌 한 염색체. E) 중기 확산을 표시하는 셀 (노란색 화살표와 함께 중기 확산 ). F) 텔로미어 신호없이 염색체를 나타내는 혼성화 실패의 예. 눈금 막대가 각 이미지에 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
활성화 된 B 림프구, 특히 유사 분열 염색체 스프레드의 제조에 적합한 반면, 다른 세포 유형 또한 사용될 수있다. T 림프구가 이들이 비장 또는 림프절로부터 정제 될 수있는, B 세포의 많은 장점을 공유 할 수 있으며, 적절한 8 분열 촉진 물질을 함유하는 배지에서의 성장에 의해 자극 될 때 높은 유사 분열 지수가 있습니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)도 중기 염색체 분석 구에 적합하다. 이 사용할 수없는 경우 colcemid와 장기간 치료 (예를 들면, 10 NG / ㎖의 최종 농도 colcemid 16 시간)을 고정하기 전에 중기에 트랩 이상의 셀을 사용하는 것이 좋지만, 섬유 모세포가 사용될 수있다.
우리는 중기의 준비의 일관성이 크게 이러한 Thermotron CDS-5로 제어 된 습도 챔버에 세포 유전학 건조 챔버를 고정 염색체 낙하에 의해 용이하게 스프레드되는 것을 발견하지만 ㅁ 좋은 결과를 얻을 수있다실험실 환경의 습도와 온도에 따라 벤치에서 작업 ILE. 신뢰할 수있는 결과를 얻으려면, 그것은 샘플 당 최소 100 중기에서 염색체 이상을 득점하는 것이 좋습니다. 수동으로 각 채널의 각 중기 힘드는 될 수 묘화 프로세스로서, 우리는 신속하고 정확하게 발견 중기 염색체의 다수를 스캔 할 수 Metasystems Metafer4 자동화 현미경 시스템을 사용하여, 중기를 획득.
텔로미어 프로브로 표지 중기 염색체 분석 염색체와 염색 분체 브레이크 측정에 적합하며, 텔로미어 신호는 또한 융합체 및 방사형 구조와 같은 복잡한 염색체 재 배열의 식별을 돕기. 지엠 사 (Giemsa)의 용액으로 고정 중기 염색체의 염색은 또한 염색체 이상을 정량화에 적합하고, 형광 현미경 (10)을 필요로하지 않는 이점을 제공한다. pantelomeric PNA 프로브 말단 소립에 레이블을 울렸다 확장DNAPKcs 녹아웃 마우스 (11)로부터 세포를, 예를 들면, 발생 텔로미어 융합체의 식별을 허용하여, 정량 할 수있는 염색체 수차의 전자. PNA-FISH는 염색체의 텔로미어 (telomere)의 중복 및 염색 분체 텔로미어 (telomere) 손실 (12, 13)를 포함하여 텔로미어 (telomere) 이상의 주파수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 텔로미어 (telomere) 신호의 손실은 텔로미어의 단축에 의해뿐만 아니라 염색체 파손으로 인해 발생할 수 있습니다. PNA-FISH는 민감 Q-FISH (정량적 FISH) 14을 이용하여 텔로미어의 길이를 측정 할 수있다.
다른 DNA 수리 활동이 부족한 세포 염색체 이상 다른 종류의 축적하는 경향이있다. 예를 들어, DNA 손상 반응 인자 53BP1의 결핍은, 염색체의 축적이 15 나누기로 이끈다. 이와 대조적으로, 복잡한 방사형 염색체 구조의 높은 비율은 BRCA1 4 결핍 세포에서 관찰된다. 이러한 염색체 재 배열은, 자신의 정확한 구조의 다양그러나 항상 두 개 이상의 염색체에서 물질의 융합을 포함한다. 예 DNA 파손을 일으킬 에이전트 고용량의 투여 후 발생 용으로 세포 게놈 불안정성의 매우 높은 수준에있을 때, 실험의 동적 범위에 제한을두고 각각의 염색체 이상을, 점수로 점점 어려워진다.
중기 스프레드 염색체 휴식과 재 배열의 정량화는 특정 유전자가 DNA 수리의 역할이 있는지 여부를 테스트하는 데 유용합니다. 이러한 목적 중기 염색체 분석을 사용하여 하나의 잠재적 인 문제는 DNA 수리 활동이없는 세포가 정상적으로 성장할 수 있다는 것이다. 수리 결핍 세포 중기에 도달하지 않는 경우, DNA의 복구를 매개하는 유전자의 중요성은 과소 평가 될 수있다. - / - p53의 - / - 더블 녹아웃 세포 mA를 보여 예를 들어, RNF8는 - / - RNF8는 반면 p53에 의존 노화 될 수 있습니다 세포는 염색체 불안정성의 완만 한 수준을 보여뉴욕 더 많은 염색체 이상, p53의 삭제는 더 나은 세포 성장 16 수 있기 때문에. 또한, 세포주기 분석으로 염색체 불안정성 측정 페어링이 녹아웃 세포 집단이 정상적으로 성장하고 유사 분열 세포의 의미있는 부분을 포함 할 수있는 표시하는 것이 중요하다.
게놈 불안정성의 관찰은 특정 유전자에 의해 제공된 보수 활동의 정확한 기능에 대한 통찰력을 제공 자체로하지 않지만, 단순히 더 많은 역학적 연구를위한 시작점으로서 역할을한다. 이 방법은 염색체 휴식 복잡한 재 배열을 측정하는 데 유용하지만 마지막으로, mFISH 또는 SKY의 사용은 염색체 전좌를 정량화하는 것이 좋습니다. 이러한 기술은 또한 중기 염색체 스프레드로 시작하지만, 프로브의 칵테일이 '페인트'형광의 특정 조합으로 각각의 염색체를 사용합니다. 이러한 기술 중 하나는 염색체 instab의 전체 스펙트럼을 측정하는 것이 좋습니다수리가 결핍 된 세포에서 ility.
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Disclosures
저자는 충돌하는 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R00 CA160574 (SFB)으로하고 (SMM에) 럿 거스 생명 공학 교육 프로그램의 교제에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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