完整的犁鼻器和副嗅球的体外制剂

Summary

鼠标嗅球（AOB）已难以在感官编码的上下文中学习。在这里，我们表明，产生体外制剂，其中AOB神经元保持功能连接到他们的外设输入，便于研究的小鼠费洛蒙和利它素信息处理解剖。

Abstract

鼠标附件嗅觉系统（AOS）是一个专门感觉传导通路检测非易失性社会异味，费洛蒙，和利它素。第一个神经回路在AOS途径，称为嗅球（AOB），它在建立性的典型行为，如领土的侵略和交配的重要作用。这个小（<1 ^立方毫米）电路具有区分独特的行为状态，如性别，品系，并在同种的分泌物和排泄物化学感受线索压力的能力。虽然这个系统的紧凑型组织呈现为同时从电路的大部分记录了独特的机会，在AOB感觉处理的调查仍然充满挑战，主要是由于其大脑中的实验不利的位置。在这里，我们证明了多阶段夹层，消除了完好的AOB的前小鼠头盖骨的单个半球内，留下连接离子两者的周犁鼻感觉神经元（的VSN）和局部神经回路完好。该过程公开的AOB表面直接目视检查，便于在没有麻醉剂的电生理和从AOB电路元件的光学记录。在插入细导管进入犁鼻器（VNO），这家的VSN，可以直接在外围暴露于社会的气味和信息素，同时记录在AOB下游活动。此过程使控制查询到AOS信息处理，它可以揭示信息素连接变动风险行为机制的光。

Introduction

在哺乳动物大脑感觉处理通常跨越多个往复连接的神经元回路，其中每个抽取特定的特征从感觉输入。在感觉通路，早期信息处理是正常的认知和行为至关重要。在附件嗅觉系统（AOS）的嗅球（AOB）是感官外围连接到该决定的荷尔蒙平衡^1,2，3的侵略和觉醒⁴下游结构的主要神经回路。因此，该电路内的信息处理是密切相关的变化，动物的行为。

在嗅球位于小鼠和大鼠在主嗅球（MOB）下方的致密的背侧/尾/后一方面，血管化鼻腔鼻窦。该AOB接收传入的神经支配来自驻留在犁鼻器（VNO）的犁鼻周围感觉神经元（的VSN）的轴突，一个SMaL在口鼻前正上方的软腭升盲端管。这些轴突穿越隔组织在鼻腔的内侧边界的微妙片。使用麻醉小鼠^5-7或可自由探索动物⁸一些研究探讨AOB的神经反应，以AOS的气味（如小鼠尿液） 在体内的来源。 在涉及（一）气管切开术，以确保麻醉过深，防止液体刺激^5-7的心愿，（二）刺激交感型颈椎节⁶或犁鼻器^5,7的直接插管引进非挥发性气味体内研究英勇麻醉以及（c）开颅手术带或不带额叶消融，以允许电极前进到AOB ^6。清醒/行为研究微驱动^8-10参与手术植入。总之，这些实验范式是强大的，但非常困难，往往需要麻醉。

体外 ）外取得了一些成功^11-15。因为VNO和AOB之间的连接保持同侧，且由于中线室间隔组织可以在单个半球暴露于含氧的灌流，我们试图开发这样的单半球体外方法来分离这些结构，同时保持其功能性连接。最近，我们成功地实现了这一目标^16。该制剂保持VNO和AOB活着和功能上连接至少4两 - 6小时，因为无论是轴突（沿中线软室间隔组织）和AOB较浅<600μm的特征都可以访问的灌流充氧人工脑脊液（学联）。这VNO-AOB 体外制备允许引入控制刺激到VNO通过薄插管，并直接的视觉进入小AOB进行有针对性的电极放置和/或现场荧光显微镜。这种方法是有利的，如果一个人渴望学习这些电路在没有麻醉剂。因为这种方法切断离心连接，它不能很好地适合于查询到AOB功能的离心调制。该VNO-AOB 体外的准备是很难学，但一旦实现产生一个可靠的平台，探讨电路组织，信息处理和神经可塑性在这个强大的感测电路。

Protocol

所有实验均按照批准的得克萨斯大学西南机构动物护理和使用委员会的协议，并被选为以尽量减少应激，不适，疼痛经历的实验动物。

1，解剖商会

自定义夹层室，小，薄塑料板所需要的最好的结果（ 图1）。提前尝试此协议的建造或取得该室。

2，解剖解决方案

1. 准备1升的标准人工脑脊液（ACSF）中的步骤3.22-5.4使用。加氯化钠125毫米，氯化钾2.5毫米，氯化钙₂为2mM，MgCl ₂的1毫米，的NaHCO ₃的25mM，将NaH ₂ PO ₄ 1.25毫米，肌醇3毫米，丙酮酸钠2mM的，抗坏血酸钠0.4毫米，和葡萄糖25 1mM至1升的无热原的水。
2. 准备初步解剖学联（200毫升）在步骤3.3-3.22使用。采取200毫升标准学联和提高_氯化镁浓度由9毫米加入0.366克的_氯化镁六水。
3. 制备标准林格氏液通过导管用于进行刺激的VNO中含有氯化钠115毫米，氯化钾5毫米， _{氯化钙，2}毫米， _氯化镁 ，2毫米， _碳酸氢钠 25毫米，HEPES 10 mM的步骤4.11-5.4，葡萄糖10毫米。
4. 泡的0.8 L标准学联和0.5升林格与95％O _{2，5％CO 2}气体在37℃水浴中至少15分钟，直到使用。
5. 气泡的200毫升初始剥离的aCSF入95％O _{2，5％CO 2}的气体在冰上15-20分钟，直到达到4℃。

3。主要解剖

1. 准备解剖区域。将3张35毫米培养皿，含氧学联，斩首剪刀，弯解剖剪刀，直解剖剪刀，镊子阿德森，一个＃11的头皮埃尔刀片和手柄，在冰刀片。
2. 后的含氧脑脊液冷却至4℃，深深地麻醉动物中使用2-5毫升Isothesia（99.9％异氟烷）一干燥室中。执行的尾巴和脚捏测试，以确保动物深度麻醉。
3. 一旦深麻醉确认，杀头的动物，并立即将头在培养皿中充满了冷剥离学联。注：浸入冷剥离学联组织要爽保持它在整个过程在不使用时。
4. 用弯剪卸下下纵横（腹侧咽，下颌部和舌）。
5. 使用阿德森镊子deglove（剥离）的浅表皮肤和颅骨肌肉附着。从剥离尾头皮，直到喙附件的唯一网站是在门牙。使用弯曲的剪刀切割组织的附着点。用抓钳将其取下眼睛和配制而成其拉出。 Ñ耳朵的皮肤脱套过程结束，通过使用阿德森镊子从上颚骨游离肌肉附着避免对精致的鼻软骨过大的力量。注：从直剪头骨的尾部方面拆下头皮。
6. 与直剪，剪下来的尾头骨吻端的中线，直到剪技巧是几个毫米到额骨（只是之前的鼻腔鼻窦）。
7. 删除使用阿德森镊子头骨的顶骨和额骨。注：额骨饮片往往会保持连接到鼻骨尾椎到鼻腔鼻窦。移除这些作品小心注意不要接触嗅球。
8. 使用手术刀通过额叶2毫米尾椎到鼻窦，使冠状切口，然后取出大脑尾的切割。保证手术刀接触腹头骨的骨性轮廓的尖端彻底断绝后路组织。注意：这使除去大部分的脑的不上施加机械应力侧嗅束或嗅球。
9. 取出头骨腹直剪刀尾外露方面。离开鼻窦和剩余的神经组织。
10. 采用直剪刀去除颧弓和面部肌肉的解剖右侧颅骨
11. 把鼻子比（腹朝上），暴露上膛。
12. 切除多余的口感立即向尾侧门牙。通过插入在平行于口腔顶部硬腭手术刀刀片的尖端做到这一点，然后走向门牙刀片。
13. 两手抓，阿德森钳腭的释放（喙）边缘拉尾侧取出。
14. 在头骨的解剖左侧，使用手术刀刀片延长腭孔尾端，从靠近磨牙的小孔开始。通过将手术刀BLA的尖端达到这个去到附近的臼齿虚空和旋转手腕。注意：要特别小心，只使用刀片的尖端 - 一个深的伤口可能会损坏室间隔组织。
15. 使用手术刀刀片的顶端，切离腭孔穿过门齿，开始延髓的解剖左犁鼻器。使用多个评分削减。通过插入刀片太深不要损坏室间隔组织和犁鼻神经。
16. 所以转背头骨朝上的组织，然后定向直刀片垂直（平行于中线）在准备的尾部边缘。
17. 在组织的腹缘，触摸刀片立即向中线的左侧的最前沿。轻轻摇动叶片和沿左腭孔（切割步骤3.14引入区域）移动。
18. 在组织的背缘，放置在剃刀的刀刃立即向中线的左边（小于1毫米）。
19. 保存叶片平行于中线，以朝向组织的前压力摇动刀片缓慢。请注意在筛板阻力。通过这种阻力突破后立即停止。注：在这一点上，右半球是从左脑松动。剩下的唯一连接是沿背吻前方筛板的半球之间。
20. 抓住他们靠近尾部两侧用戴手套的手指，轻轻横向和向前旋转它们分开的半球。注：此步骤是实验性的变异的来源，尤其是在小鼠斜井或脆口鼻（ 例如 ，年纪较大的老鼠）。另外，当试图以旋转半球彼此远离，如果强遇到阻力。比分背侧吻（前向筛板），以削弱结缔组织。虽然这样做，采取极端谨慎不深插入的手术刀，它可以破坏的间隔TISSUE和犁鼻神经。
21. 适用的组织胶量小（50-100微升），以木板和右半球的横向边缘轻轻地放置到使用阿德森镊子胶水。使用纸巾，以防止过早聚合胶和松散粘附在板准备的侧面除去多余的水分。注：应用数滴于样品冷冻解剖学联的加速胶水聚合后组织被放置到胶水。这确保了组织保持紧密地保持到板条。
22. 将在二级清扫室的中间真空润滑脂少量（3-5毫米直径2毫米深），然后将板侧面的组织坚决反对油脂相反。马上补上剥离室中冷藏解剖学联，转移到精细解剖区域，并开始灌注氧合标准学联。定向木板，以便嗅球是直接在新鲜含氧学联标准的流。

4，二次解剖

1. 从用细镊子准备移除任何可见对侧（左）嗅球或皮层组织。捏在一起的细镊子（形成半钝点），然后将其放置在背部和组织的尾侧中线附近。轻轻沿中线运行捏钳，剥离组织远离右半球在缓慢前向运动。删除所有对侧组织，包括对侧嗅球组织。要格外注意不要刺伤通过组织，这可能会导致损坏AOB或犁鼻神经。
2. 观察该白色硬膜沿嗅球的背侧/内侧表面。通过抓两对细镊子的硬脑膜最白的部分撕裂这个硬膜沿嗅球的背/尾边和拉他们远离该点。硬脑膜是紧密缠绕在嗅球，并可以很容易地通过本身的组织切片，而它被去除。避免损坏嗅球和AOB本身的内侧表面上。注：如果硬脑膜抵抗在这一点上很容易流泪，引入一小截细春尖解剖剪刀，方便的分​​离。
3. 慢慢地，小心地剥开额叶皮层用细镊子不损坏底层的嗅球。观察显示为半透明的净紧接尾于AOB血管的集合。用细镊子取出该网以方便在电生理实验电极渗透。抓住网用钳子，因为它从AOB分离过程中额叶皮层收缩和拉尾侧和内侧取下，小心不要触碰AOB。一旦额叶皮层已经分开嗅球，通过用钳子腹侧和后向的AOB切割移除它。注：取前极端与护理去除净，因为如果它是做了大致的肾小球层可以被损坏。
4. 在暴露对侧鼻腔，用细镊子取出所有剩余的对侧间隔组织（包括血管脆弱黄片）。掌握组织在尾/背区（靠近室间隔骨），然后拉/解除对前侧的组织。注意：对侧间隔组织可以在半切步骤（步骤3.20）被无意中删除。在这种情况下，观察到白色的，无血管鼻中隔软骨和略透明的，血管室间隔骨。如果是这样的话，在步骤4.4，可以跳过。
5. 小心通过运行一个单点的鼻中隔软骨和犁鼻“翼”（一块薄薄的骨组织沿两个VNOS背边缘之间运行的精细镊子取出对侧VNO。
   1. 下面由软骨翼支队，将镊子尖腹到中线附近对侧VNO。在几个地点沿对侧VNO的喙/尾轴松开重复此步骤，使其能够抓住钳和起重远离被删除。
6. 准备通过使切口在腹部/尾缘（它缩小到一个白色的股骨头缺血性带状运行沿室间隔骨的腹缘）用细镊子取出鼻中隔软骨。
7. 按捏细镊子在一起，使一个半钝点取出鼻中隔软骨。识别步骤4.6获得了晋级，后面插入（横向）的镊子夹住该切割，然后慢慢抬起软骨远离室间隔组织和继续吻侧。注意：不要破坏底层的室间隔组织。由于软骨被抬起，观察室间隔组织弹力底层表因粘连松动的软骨。捏细镊子沿松一此站点周期性的，温柔的，且稳定的运动dhesion可以极大地方便了两种结构的成功分离。
8. 使用一对＃3镊子与弯曲尖端取出鼻中隔骨。在一个角度接近室间隔骨几乎平行于室间隔骨的平面。插入室间隔组织和中隔骨之间的弧形齿。抓住与骨钳，轻轻移动骨来回，直到筛板附近出现裂缝。注：在某些情况下，隔骨会抵制破坏筛板附近。在这种情况下，用细镊子沿背/腹轴轻轻比分室间隔骨只是前筛板，然后重复步骤4.8。
9. 通过与一对细镊子的手捏在入口处，并与另一对细镊子之吻侧拉动取出白色软骨只是喙的VNO。
10. 附聚酰亚胺套管以快速灌注装置并启动的林格氏溶液（0.1-0.3毫升/分钟），通过在聚酰亚胺套管的流动。注：测量流速与在线，小体积流量的仪表。利用计算机控制的气动激励开关器件的刺激时可减少流量的变化。比较神经反应与反应的模拟刺激（控制林格氏液）测试激励，以确保响应是刺激特定的。
11. 取向平行于VNO入口插管。当套管被令人满意地平行于VNO入口，手表作为出口的压力使所述VNO到“膨胀”，导致血管撤离。立即插入插管进入VNO，保持套管恒定的角度，使之保持平行于VNO开口。注意：它可以帮助保持插管与一对对塑料板材细镊子，并使用另一对细镊子对角套管的末端微微向上。如果无意中置于所述套管的VNO后面，流出也会造成VNO血管撤离，导致印象进行适当的插管。适当的位置可以通过在林格氏溶液掺入染料的确认。当套管被妥善安置，染料应该只通过VNO入口出口。此外，人们可以通过确保套管是容易看到通过所述VNO的半透明的内侧面确认正确放置。
12. 将塑料板慢慢地，直到AOB是在标准学联的直接流量，小心不要从VNO打跑套管。解剖完整，生理功能的评估可以立即开始。第5步简要介绍了一种方法作出这样的评估。

5。评估

1. 穿透该AOB的表面与附着于细胞外的放大器和示波器2-4兆欧硼硅酸盐玻璃微电极。
2. 慢慢地从推进微电极，以100-200微米的深度面以50微米/分钟的速率。注：在此组织深度，人会遇到由微电极电压尖锐，短暂（约1-2毫秒）挠度例证偶尔自发动作电位波形。
3. 当遇到一个动作电位波形，停止前进的微电极。
4. 观察和/或记录动作电位的速率，同时改变从控制林格氏刺激交付解决方案，以VSN活动的一个已知的激活剂（ 如含50毫米氯化钾林格氏液）。如果夹层是成功的，在动作电位的速率或局部场电位的刺激依赖的变化可以观察到。注意：并非所有的AOB神经元将每一个刺激响应增加射速（包括含50毫米氯化钾林格氏液）。在射速刺激依赖性下降也预示功能连接和一个成功的清扫。在两个或更多个神经元中遇到的事件是反应迟钝VNO刺激，或者如果没有动作电位的多个电极穿透之后即可观察到，这表明一个不成功的解剖。如果是这样的情况下，一个新的夹层可以在步骤3中被启动。

Representative Results

取得成功，这种准备需要大量的实践，有几个步骤，在它可能会失败。每个人都应该想到需要很多的尝试取得成功之前。自定义剥离室需要成功完成该协议，并应事先在开始解剖的后期阶段获得。腔室的设计在图1中给出的是足以达到此目的，并且可以由相对廉价的塑料以最小的加工要求。如果一个人没有产生这样的腔容量，本地或在线加工企业可以进行协商，并可以构造室收费。

变异横跨准备一个大来源是实验动物的头骨和鼻子的骨骼的密度和脆性。在半切的步骤（步骤3.14-3.20），其目标是隔离两个犁鼻器连同同侧室间隔组织和同侧嗅球。然而，这种情况并不少见的室间隔组织保持附着在对侧半球，特别是靠近连接点的口鼻部的背侧的骨头， 图2示出了一个有效的和无效的半切的一个例子。

细解剖，在此期间，犁鼻神经的轴突可以在中隔组织附近的犁鼻器（ 图3A和3B）或附近的AOB（ 图3C和3D）被损坏时出现其他常见夹层错误。这些以及类似的事件将导致的VSN和AOB之间的不完整连接，使制剂无法使用。

最后的障碍准备的成功是犁鼻插管步骤（步骤4.11）。妥善安置的VNO插管将导致VNO内腔加压，造成立即驱逐从犁鼻泵残血。套管应清晰可见下方的相对透明的犁鼻上皮和套管的外观应沿其长度的VNO内均匀的。在成功完成该过程，可以响应于VNO刺激VSN的加臭剂的已知来源（ 图4）使用一种生理测定法，诸如神经活动的单个单元电生理记录验证功能连接。

在步骤3.22-5.4使用的自定义解剖腔图1 A）的工程图纸。注：小孔可钻，以适应解决方案和放气入口和出口在本协议中使用的夹层室所需的B）示例照片。 m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。

图2：A，成功（A和B）代表图像）和半切段（步骤3.20）未果后（B）的准备工作。所述VNO，室间隔组织和嗅球（OBS）都必须保持从同侧半球（在这种情况下，右（下）半球。如鼻甲骨是上同侧半球可见，剥离失败。刻度线1mm处。 请点击此处查看该图的放大版本。

d/51813/51813fig3highres.jpg“宽度=”600“/>
图3：A，B）的VNO和AOB的完好和损坏的室间隔组织的代表图像。在B中，解剖钳取得与组织不慎接触，损坏VN轴突束，C，D）及损坏的AOB。在D中，去除周边同侧OB硬脑膜导致撞断了犁鼻器神经附近的AOB，引起组织的靠近内侧的AOB一个可见的斑点。比例尺是1毫米的长度。

图4 A）例光栅从AOB神经元（细胞外单单位记录），在一个成功的准备记录的动作电位的情节。在黑色的痕迹显示在射速控制时，林格氏液被送到VNO持续5秒（灰色B没有变化牛）。在红色显示痕迹的BALB / c雌性小鼠尿液中的相同的神经元至VNO刺激的反应稀释100倍到林格氏液B）围刺激时间在A中的相同反应的直方图。误差棒代表平均值的标准误差。

Discussion

该VNO-AOB 体外在本协议中所述的制备是一个有用的替代体内^5-7和急性现场片¹⁷实验AOB函数来麻醉。不像急性AOB切片实验，这也暴露了电路元件的电和光学记录，该制剂保留所有感觉传入和国内AOB连接。尽管这也可以在体内方法所述的麻醉剂，麻醉剂的存在不一定会改变神经功能，即兴奋性/抑制性的平衡，这是在这个和其他的嗅觉电路^18，用于信息处理的关键。因为该制剂避免了使用麻醉剂，并且由于该AOB表面完全暴露于灌流，它是适合于药理学查询到局部神经处理。

还有，当然，该制剂的一些限制。有EVidence最深AOB层，内部细胞层，里面有许多抑制颗粒细胞¹⁶即深部逐渐退化。此外，离心式输入的解剖过程中切断，从AOB功能，积极参与消除它们。所述VNO插管绕过犁鼻泵的正常操作，并冲走存在于VNO管腔内源性流体。

关键的步骤，以成功实现这种方法是微妙的半切（步骤3.20）和VNO插管（步骤4.11）。谁也无法预料到需要广泛的实践，以可靠地生产功能性连接体外的准备。二次解剖腔此处使用的可使用的VNO的刺激的小鼠外激素（如稀释的尿液）源中使用单电极记录，以评估功能性连接^。13,15修改二次解剖腔可以bË提出，允许编制旋转角度适用于其他用途，如多光子成像。

在许多技术障碍学习生活AOB早就提出了一个屏障，我们的社会气味和信息素感觉处理的理解。通过解剖走在这夹层协议这感觉传导通路的最早的神经组成部分，一个是能够​​获得实验获得这些难以研究电路。我们已经利用这种准备详细的询问到犁鼻器感觉处理¹⁹和感官映射（Hammen 等 ，未发表）。这种技术将可以用于未来的研究成感觉处理的AOB，特别是那些需要光纤接入的组织（ 例如 ，多光子成像和光遗传学）。这种方法的好处互为补充体内的方法，并改善我们的工具包，用于调查的神经机制犁鼻介导的使cial和生殖行为。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight Scissors	Fine Science Tools	14002-14
Fine Scissors-Straight	Fine Science Tools	14060-10
Fine Scissors-Curved	Fine Science Tools	14061-10
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
#11 Scalpel Blades	Fisher Scientific	3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades	Fisher Scientific	12-640
35 mm Petri Dish	Fisher Scientific	08-772-21
Dissection Chamber	Custom	N/A	See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm	Custom	N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease	Fisher Scientific	146355D
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip	Fine Science Tools	11295-10
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08
1/16" Male Luer	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" Tubing	Fisher Scientific	14-171-129
Two ton epoxy	Grainger	5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink digital/manual controller	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 hexahydrate	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-inositol	Sigma-Aldrich	various
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	various
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	various
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	various
Glucose	Sigma-Aldrich	various