Summary
Musen tillbehör luktbulben (AOB) har varit svårt att studera i samband med sensorisk kodning. Här visar vi en dissektion som producerar en ex vivo preparat där AOB nervceller förblir funktionellt kopplade till deras perifera ingångar, underlätta forskning om behandling av mus feromoner och kairomoner information.
Abstract
Musen tillbehörsLuktSinnet (AOS) är en specialiserad sensorisk väg för att upptäcka icke-flyktiga sociala lukter, feromoner och kairomoner. Den första neurala kretsen i AOS vägen, som kallas tillbehöret luktbulben (AOB), spelar en viktig roll för att skapa könstypiska beteenden såsom territoriell aggression och parning. Denna lilla (<1 mm 3) krets besitter förmågan att särskilja unika beteende stater, såsom kön, stam, och stress från chemosensory ledtrådar i sekret och utsöndringar av artfränder. Medan den kompakta organisation av detta system innebär unika möjligheter för inspelning från stora delar av kretsen samtidigt, utredning av sensorisk bearbetning i AOB är fortsatt utmanande, till stor del på grund av dess experimentellt ofördelaktig plats i hjärnan. Här visar vi en flerstegs dissektion som tar bort den intakta AOB i en enda halvklotet av främre musen skallen, lämnar anslutajoner till både de perifera vomeronasala sensoriska neuroner (VSNs) och lokala neuronala kretsar intakta. Förfarandet exponerar AOB yta till direkt visuell inspektion, underlätta elektrofysiologiska och optiska inspelningar från AOB-kretselement i frånvaro av anestetika. Vid insättning av en tunn kanyl i vomeronasala organet (VNO), som inrymmer de VSNs kan en direkt exponera periferin till sociala lukter och feromoner under inspelning nedströms aktivitet i AOB. Detta förfarande möjliggör kontrollerade undersökningar AOS informationsbehandling, som kan belysa mekanismer som kopplar feromon exponering för beteendeförändringar.
Introduction
Sensorisk bearbetning i däggdjurshjärnan spänner typiskt multipla reciprokt-kopplade neuronala kretsar, vilka var och extraherar särdrag från sinnesintryck. I sensoriska banor, är tidig informationsbehandling avgörande för normal perception och beteende. I tillbehörs olfaktoriska systemet (AOS), är tillbehöret luktbulben (AOB) huvudmannen neural krets som förbinder den sensoriska periferin till strukturer nedströms som dikterar hormonbalansen 1,2, aggression 3, och upphetsning 4. Som sådan, är informationsbehandling inom denna krets starkt kopplade till förändringar i djurens beteende.
Tillbehöret luktbulben ligger i mus och råtta vid den dorsala / kaudala / bakre delen av huvud luktbulben (MOB) under den täta, vaskulariserad rhinal sinus. Den AOB emot afferenta innervation från axoner av perifer vomeronasala sensoriska neuron (VSNs) som bor i Vomeronasalorganet (VNO), en small blinda ändar rör i främre nosen strax ovanför mjuka gommen. Dessa axoner korsa känsliga ark septal vävnad vid den mediala gränsen för de nasala passager. Flera studier har sond AOB neurala reaktioner på källor till AOS lukter (t.ex. mus urin) in vivo med hjälp av sövda möss 5-7 eller fritt utforska djur 8. Den heroiska bedövas in vivo studier inblandade (a) tracheotomies att säkerställa djup anestesi och förhindra aspiration av vätska stimuli 5-7, (b) stimulering av det sympatiska livmoderhalscancer ganglion 6 eller direkt kanyle av Vomeronasalorganet 5,7 för att införa icke-flyktiga lukter och (c) craniotomies med eller utan pannloben ablationer att tillåta elektroden avancemang in i AOB 6. Awake / beter studier 8-10 involverade kirurgisk implantation av en Microdrive. Sammantaget dessa experimentella paradigm är kraftfulla, men ytterst svårt och ofta kräver narkos.
(ex vivo) med viss framgång 11-15. Eftersom anslutningarna mellan VNO och AOB förblir ipsilaterala, och eftersom mittlinjen septal vävnad kan utsättas för syresatt superfusate i en enda halvklotet, försökte vi utveckla en sådan enkel-halvklotet ex vivo metod för att isolera dessa strukturer samtidigt som deras funktionella anslutningsmöjligheter. Vi lyckades nyligen i att uppnå detta mål 16. Detta preparat håller både VNO och AOB levande och funktionellt ansluten i minst 4-6 timmar eftersom båda axoner (längs mittlinjen mjuk septal vävnad) och AOB är relativt grunda <600 nm funktioner som är tillgängliga för superfuseras syre artificiell cerebrospinalvätska ( aCSF). Denna VNO-AOB ex vivo förberedelse möjliggör införande av kontrollerade stimuli till VNO via en tunn kanyl, ochdirekt visuell tillgång till den lilla AOB för riktade elektrodplacering och / eller levande fluorescensmikroskopi. Denna metod är fördelaktig om man önskar att studera dessa kretsar i frånvaro av anestetika. Eftersom detta tillvägagångssätt bryter centrifugal anslutningar, är det inte väl lämpade för undersökningar av centrifugal modulering av AOB funktion. VNO-AOB ex vivo förberedelser är svårt att lära sig, men en gång uppnått ger en pålitlig plattform för att undersöka kretsorganisation, informationsbehandling, och neural plasticitet i denna kraftfulla sensoriska krets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Southwestern Institutional Animal Care och Use Committee, och har valts för att minimera stress, obehag och smärta som upplevs av försöksdjuren.
1. Dissection avdelningen
En anpassad dissektion kammare och liten, tunn plast planka krävs för bästa resultat (Figur 1). Konstruera eller skaffa en sådan kammare innan du försöker detta protokoll.
2. Dissection Lösningar
- Förbered ett L av standard artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) för användning i steg från 3,22 till 5,4. Lägg NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, myo-inositol 3 mM, natriumpyruvat 2 mM, natriumaskorbat 0,4 mM och glukos 25 mM till 1 L av pyrogenfritt vatten.
- Förbered den inledande dissektion aCSF (200 ml) föranvändning i steg från 3,3 till 3,22. Ta 200 ml standard aCSF och höja MgCl2 koncentrationen med 9 mM genom tillsats av 0.366 g MgCl2 hexahydrat.
- Bered standard Ringers lösning för att bära stimuli till VNO genom kanylen för användning i steg från 4,11 till 5,4 innehållande NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2, 2 mM MgCl2, 2 mM, NaHCOs 3 25 mM, HEPES 10 mM, glukos 10 mM.
- Bubbla den 0,8 L av standard aCSF och 0,5 L av Ringers med 95% O2, 5% CO2-gas i en 37 ° C vattenbad under minst 15 min tills användning.
- Bubbla de 200 ml av initial dissekering aCSF med 95% O2, 5% CO2 gas på is under 15-20 minuter tills den når 4 ° C.
3. Primär Dissection
- Förbered dissektion området. Placera tre 35 mm petriskålar, syresatt aCSF, halshuggning sax, böjda dissekera sax, rak dissekera sax, Adson pincett, en # 11 hårbottenel blad och handtag och ett rakblad på is.
- Efter oxygenerad aCSF kylts till 4 ° C, djupt söva djuret i en uttorkning kammare med 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluoran). Utför svans och fot nypa tester för att se till att djuret är djupt sövd.
- När djup anestesi bekräftas, halshugga djuret och omedelbart placera huvudet i en petriskål fylld med kyld dissektion aCSF. OBS: Doppa vävnaden i kyld dissektion aCSF att hålla det svalt under hela förfarandet när den inte används.
- Ta bort den nedre aspekten (ventrala svalget, underkäken, och tunga) med en böjd sax.
- Använda Adson pincett deglove (skal) den ytliga huden och muskelfästen från skallen. Peel hårbotten från caudal till rostralt till den enda platsen för fastsättning är över framtänderna. Skär vävnaden vid fästpunkten med hjälp av en böjd sax. Ta ögonen genom att greppa den med pincett och dra bort den från beredningen. Nöra slutet av degloving förfarande, undvika onödig kraft på den känsliga nasal brosk genom att använda Adson pincett för att gratis muskelfästen från de övre käken ben. OBS: Lossa hårbotten från svans aspekten av skallen med raka sax.
- Med de raka sax, skära ner mittlinjen av skallen från caudal till rostralt tills sax tips är några mm i pannben (strax före rhinal sinus).
- Avlägsna parietal och pannben av skallen med hjälp Adson pincett. OBS: kommer Bitar av pannbenet ofta kvar på näsbenen stjärtfenan till rhinal sinus. Ta bort dessa bitar med omsorg vidtagits inte att kontakta lukt lökar.
- Använd skalpell för att göra en koronalt snitt genom pannloben 2 mm kaudalt till bihålorna och sedan ta bort hjärnan kaudalt snittet. Se till att spetsen på skalpellen kontakter beniga konturen av den ventrala skalle för att fullständigt avskilja den posteriora vävnad. OBS: Detta gör det möjligtavlägsnande av majoriteten av hjärnan utan att mekaniska belastningen av de laterala lukt skrifter eller lukt glödlampor.
- Ta bort de exponerade caudal aspekterna av den ventrala skallen med raka sax. Lämna bihålor och vävnad kvar nervös.
- Ta bort zygomatic båge och ansiktsmusklerna på anatomiska högra sidan av skallen med raka sax
- Vrid nos över (ventrala sidan uppåt) för att exponera gommen.
- Kapa och ta bort gommen omedelbart caudal till framtänderna. Gör detta genom att föra in spetsen av skalpellblad enligt gommen parallellt med taket i munnen och flytta bladet mot framtänderna då.
- Ta tag i befriat (rostral) kanten av gommen med Adson pincett och ta bort genom att dra kaudalt.
- På den anatomiska vänstra sidan av skallen, använda skalpellblad för att förlänga Palatine foramen kaudalt, med början från de små foramen nära kindtänderna. Uppnå detta genom att sticka in spetsen på skalpellen blaDe in i tomrummet nära molarerna och vrida handleden. OBS: Var mycket försiktig att bara använda spetsen på bladet - ett djupt snitt kan skada septal vävnad.
- Med användning av spetsen av skalpellblad, skuren från Palatinen foramen genom framtänderna, med början rostralt till den anatomiska vänstra vomeronasala organet. Använd flera scoring nedskärningar. Skada inte septal vävnad och vomeronasala nerver genom att sätta kniven för djupt.
- Vrid vävnaden så den dorsala skalle är riktad uppåt och sedan orientera rak rakblad vertikalt (parallellt med mittlinjen) vid den bakre spetsen av preparatet.
- Vid den ventrala kanten av vävnaden trycker framkanten av rakbladet omedelbart till vänster om mittlinjen. Skaka bladet och röra sig längs vänster Palatine foramen (skär region införs i steg 3.14).
- Vid den dorsala kanten av vävnaden genom att placera framkanten av rakhyveln omedelbart till vänster om mittlinjen (mindre än 1 mm).
- Keepingbladet parallellt med mittlinjen gungas rakbladet långsamt under tryck mot den främre av vävnaden. Lägg märke till motstånd vid cribrosa plattan. Stanna omedelbart efter att kommit igenom detta motstånd. OBS: Vid denna punkt, är den högra hjärnhalvan lossnat från den vänstra hjärnhalvan. Det enda kvarvarande anslutningen mellan halvkloten längs rygg tryne anterior till cribrosa plattan.
- Separera halvkloten genom att greppa dem nära stjärtfenan sidorna med handskar och försiktigt vrida dem i sidled och anteriort. Anmärkning: Detta steg är en källa till experimentell variation, i synnerhet i möss med avvek eller sköra nosar (t.ex. äldre möss). Dessutom, samtidigt som man försöker rotera halvkloten från varandra, om starka motstånd märks poäng ryggens nos (anterior till cribrosa plattan) för att försvaga den bindväv. Medan du gör det, ta extrem försiktighet att inte sätta skalpellen djupt, vilket kan skada septal tissue och vomeronasala nerver.
- Applicera en liten mängd (50-100 fil) av vävnadslim på plankan och försiktigt placera den laterala kanten av den högra hjärnhalvan på lim med användning av de Adson pincett. Avlägsna överskott av fukt från den laterala sidan av preparatet med användning av en pappershandduk för att förhindra för tidig lim polymerisation och lös vidhäftning till planka. OBS: Applicera några droppar av den kylda dissektion aCSF på provet för att påskynda limmet polymerisation efter vävnaden placeras på limmet. Detta säkerställer att vävnaden förblir tätt hålls till plankan.
- Placera en liten mängd (3-5 mm diameter och 2 mm djupa) av vakuum fett i mitten av den sekundära dissektion kammaren och placera den sida av plankan motsatt vävnaden ordentligt mot fett. Omedelbart fylla dissektion kammaren med kyld dissektion aCSF, överföra till den fina dissektion området och börja perfusion med syresatt standard aCSF. Orientera plankan så att luktbulben är direkt iström av färskt syresatt standard aCSF.
4. Sekundär Dissection
- Ta bort alla synliga kontra (vänster) luktbulben eller kortikal vävnad från beredningen med fin pincett. Nyp ihop fin pincett (som bildar en halv trubbig spets), och sedan placera den på rygg-och stjärt del av vävnaden nära mittlinjen. Kör försiktigt nöp tång längs mittlinjen, skalar vävnaden bort från den högra hjärnhalvan långsamt i anterior rörelse. Ta bort alla av den kontralaterala vävnad, inklusive den kontra luktloben vävnad. Var mycket noga med att inte sticka igenom vävnaden, vilket kan orsaka skador på AOB eller vomeronasala nerv.
- Observera den vita dura mater längs ryggens / mediala ytan av luktbulben. Riv denna dura mater längs ryggens / bakre spetsen på luktbulben genom att ta tag i det vitaste delen av dura med två par fin pincett och dra bort från den punkten dem. Dura är tättlindade runt lukt lökar, och kan lätt själv skära genom vävnaden medan den avlägsnas. Undvik skador på mediala ytan av luktbulben och AOB själv. OBS: Om dura motstår riva lätt på denna punkt, införa ett litet snitt med fina fjäder spets dissektion sax för att underlätta separation.
- Dra långsamt och försiktigt bort det frontala cortex med fin pincett utan att skada underliggande lukt glödlampor. Beakta en samling av blodkärl som uppträder som en halvtransparent nät omedelbart kaudalt om AOB. Ta bort detta nät med fin pincett för att underlätta elektrodpenetration i elektrofysiologiska experiment. Ta tag i nätet med pincett eftersom den separerar från AOB under frontal cortex indragning och ta bort den genom att dra kaudalt och medialt, var noga med att inte röra vid AOB. När det frontala cortex har separerats från lukt lökar, ta bort den genom att klippa med pincett ventrala och bakre till AOB. OBS: Ta extreme försiktig med nettoupptag, för om det görs för ungefär glomerulära lagret kan skadas.
- I den exponerade kontra näshålan, bort återstående kontra septal vävnad (tunn gulaktig ark innehåller blodkärl) med fin pincett. Ta tag i vävnaden vid stjärtfenan / ryggregionen (nära septal ben) och dra / lyfta vävnaden mot den främre sidan. OBS! Kontra septal vävnad kan oavsiktligt bort under hemisection steget (steg 3.20). I sådana fall, observera en vit, avaskulär septal brosk och lätt transparent, vaskulariserat septal ben. Om detta är fallet, kan Step 4,4 hoppas över.
- Ta försiktigt bort det kontra VNO genom att köra en enda av de fina pincett mellan septal brosk och VNO "vinge" (en tunn bit av benvävnad som löper längs ryggens kant både VNOs.
- Efter vingen lossnar från brosket, flytta spets pincett ventralti den kontra VNO nära mittlinjen. Upprepa detta steg på flera platser längs den rostrala / caudal axeln för kontra VNO att lossa den, så att den kan tas bort genom att ta tag med pincett och lyft bort.
- Förbered dig på att ta bort septal brosk genom att göra ett snitt vid den ventrala / bakre spetsen (där det smalnar av till en vit avaskulär remsa som löper längs den ventrala kanten av septal ben) med fin pincett.
- Avlägsna septal brosk genom att klämma ihop de fina pincett för att göra en semi trubbig. Identifiera snittet görs i steg 4.6, sätt de kläm pincett bakom (i sidled) för att skära, och sedan långsamt lyfta brosk från septal vävnad och fortsätter rostrally. OBS: inte störa den underliggande septal vävnad. Eftersom brosk lyfts, observera den underliggande ark septal vävnad sträcka på grund av lösa sammanväxningar i brosket. En periodisk, mild och stabil rörelse nöp fin pincett längs denna webbplats av lösa ettdhesion kan underlätta framgångsrik separation av de två strukturerna.
- Använd ett par # 3 pincett med en böjd spets för att ta bort septal ben. Närma septal ben i en vinkel nästan parallellt med planet för den septala ben. Sätt i den böjda pinnen mellan septal vävnad och septal ben. Ta tag i benet med pincett och försiktigt flytta benet fram och tillbaka tills den spricker nära cribrosa plattan. OBS: I vissa fall kommer det septal ben motstå bryta nära cribrosa plattan. I så fall fin pincett för att försiktigt slå in septal ben längs ryggens / ventral axel bara främre till cribrosa plattan, upprepa sedan steg 4.8.
- Ta bort den vita brosket precis rostralt till VNO genom att nypa med ett par fina tång vid ingången och dra rostrally med ett annat par fin pincett.
- Fäst polyimid kanyl till en snabb perfusionsanordning och starta flödet av Ringers-lösning (0,1-0,3 ml / min) genom polyimiden kanylen.OBS: Mät flödeshastighet med en in-line, liten volymflödesmätare. Användning av datorstyrd pneumatisk stimulans kopplingsanordning minskar förändringar flödes under stimulering. Jämför neurala reaktioner att testa stimuli med svar på en fingerad stimulans (kontroll Ringers lösning) för att säkerställa svar är stimulans specifik.
- Rikta in kanylen parallell med VNO ingång. När kanylen är tillfredsställande parallell med VNO ingången, titta på när utloppstrycket bringar VNO att "blåsa upp", vilket leder till evakuering av blodkärlet. Sätt omedelbart kanyl i VNO, att hålla vinkeln hos kanylen konstant så att den förblir parallell med VNO öppning. OBS: Det kan vara till hjälp för att hålla kanylen med ett par av fin pincett mot plast planka och använda ett annat par av fin pincett för att vinkla änden av kanylen något uppåt. Om man av misstag placerar kanylen bakom VNO, kan utflödet också orsaka VNO blodkärlevakueras, vilket leder till ett intryck av ett riktigt kanylering utfördes. Korrekt placering kan bekräftas genom att införliva ett färgämne i Ringerlösning. När kanylen är korrekt placerad, färgen ska bara avsluta via VNO entrén. Dessutom kan ett bekräfta korrekt placering genom att säkerställa att kanylen är lätt synlig genom den halvgenomskinliga mediala aspekten av VNO.
- Flytta plast plankan långsamt tills AOB är i det direkta flödet av standarden aCSF, försiktigt så att inte driva bort kanylen från VNO. Den dissektion är komplett och bedömning av fysiologisk funktion kan påbörjas omedelbart. Steg 5 beskrivs kortfattat en metod för att göra en sådan bedömning.
5. Utvärdering
- Tränga igenom ytan av AOB med en 2-4 Mohm borsilikatglas mikroelektrod kopplad till en extracellulär förstärkare och oscilloskop.
- Sakta föra mikroelektrod till ett djup av 100-200 nm frånyta med en hastighet av 50 ^ m / min. OBS: I denna vävnad djup, kommer man att stöta på enstaka spontana aktionspotential vågformer exemplifieras av skarpa, korta (~ 1-2 ms) nedtryckningen av de mikroelektrodspänningen.
- På att möta en aktionspotential vågform, sluta driva mikroelektrod.
- Observera och / eller spela in aktionspotentialens takt när du byter den stimulans leveranslösning från kontroll Ringers till en känd aktivator av VSN verksamhet (t.ex. Ringers lösning innehållande 50 mM KCl). Om dissektion var lyckad, kan observeras en stimulans beroende förändring av aktionspotential kurs eller lokal fältpotential. OBS: Inte alla AOB nervceller kommer att svara på varje stimulus med en ökad eldhastighet (inklusive Ringers lösning innehållande 50 mM KCl). En stimulans beroende minskning av eldhastighet indikerar också funktionell anslutning och en framgångsrik dissekering. I händelse av att två eller flera neuroner påträffas somsvarar inte på VNO stimulering, eller om inga aktionspotentialer observeras efter flera elektrodingar, tyder detta på ett misslyckat dissektion. Om så är fallet, kan en ny dissektion initieras i steg 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att nå framgång med detta preparat tar omfattande praxis, och har flera steg där det kan misslyckas. Man bör räkna med att kräva många försök innan nå framgång. Den anpassade dissektion Kammaren krävs för ett framgångsrikt slutförande av detta protokoll, och bör inhämtas före start de senare stadierna av dissekering. Utformningen kammaren presenteras i figur 1 är tillräckligt för detta ändamål, och kan vara tillverkad av relativt billiga plaster med minimala bearbetningskrav. Om man saknar kapacitet att producera en sådan avdelning, kan lokala eller online-bearbetningsföretag konsulteras och kan konstruera kammaren mot en avgift.
En stor källa till variabilitet över förberedelserna är tätheten och benskörhet i skallen och nosen av försöksdjuren. Under hemisection steg (steg från 3,14 till 3,20), är målet att isolera båda vomeronasala organ tillsammans med den ipsilaterala septal vävnad ochipsilaterala tillbehör luktbulben. Det är dock inte ovanligt att septal vävnad för att sitta kvar på kontralaterala hemisfären, speciellt nära fästpunkter till rygg ben i nosen. Figur 2 visar ett exempel på en effektiv och ineffektiv hemisection.
Andra vanliga dissektion fel uppstår under den fina dissektion, under vilken axoner i vomeronasala nerv kan skadas i septal vävnad nära vomeronasal organ (fig. 3A och 3B) eller nära AOB (figur 3C och 3D). Dessa och liknande händelser kommer att leda till ofullständig anslutning mellan VSNs och AOB, gör förberedelserna oanvändbar.
Det sista hindret för beredningen framgång är VNO kanylesteget (steg 4.11). Korrekt placering av VNO kanyl kommer att resultera i trycksättning av VNO lumen, vilket orsakar omedelbar utvisning av resterande blod från det vomeronasala pumpen. Kanylen ska vara klart synliga under den relativt öppen vomeronasala epitel och utseendet på kanylen bör vara enhetlig längs dess längd inuti VNO. Efter ett framgångsrikt slutförande av förfarandet, kan man verifiera funktionell uppkoppling med hjälp av en fysiologisk analys såsom enda enhet elektrofysiologiska inspelningar av neural aktivitet som svar på VNO stimulering med en känd källa till VSN odörer (Figur 4).
Figur 1. A) Tekniska ritningar av anpassade dissektion kammaren som används i steg från 3,22 till 5,4. OBS: Små hål kan borras för att rymma lösning och gasnings inlopp och utlopp som önskas B) Exempel fotografi av dissektion kammare används i detta protokoll.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. A, B) Representativa bilder av framgångsrika (A) och misslyckade (B) förberedelser efter hemisection stadiet (Steg 3.20). VNO, septal vävnad, och luktsinnet lökar (OBS) måste alla hållas från den ipsilaterala halvklotet (i det här fallet rätt (botten) halvklotet. Om nasala näsmusslan syns på ipsilaterala halvklotet har dissektion misslyckats. Kryssa märken är 1 mm från varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 3. A, B) Representativa bilder av intakt och skadad septal vävnad mellan VNO och AOB. I B, de dissekera pincett gjorde oavsiktlig kontakt med vävnaden, skadar VN axon trakter. C, D) Intakta och skadade AOB-bakterier. I D, borttagning av dura omger ipsilaterala OB ledde avskilja vomeronasala nerven nära AOB, vilket orsakar en synlig klump av vävnad nära den mediala AOB. Skala barer är 1 mm i längd.
Figur 4. A) Exempel raster tomt på aktionspotentialer som spelats in från en AOB neuron (extracellulärt enhet inspelning) i en lyckad beredning. Spår i svart visar ingen förändring i eldhastighet när kontroll Ringers lösning levererades till VNO 5 sek (grå box). Spår i rött visar svaret hos samma neuron till VNO-stimulering med BALB / c honmus urin späddes 100-faldigt i Ringers saltlösning. B) Peri-stimulus tids histogram av samma svar i A. Felstaplar representerar standardfel av medelvärdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VNO-AOB ex vivo preparat beskrivs i detta protokoll är ett användbart alternativ till sövda in vivo 5-7 och akut lever segment 17 experiment av AOB-funktion. Till skillnad från akut AOB skiva experiment, som också exponerar kretselement för elektrofysiologiska och optiska inspelningar, behåller denna beredning alla sensoriska afferenter och intra-AOB anslutningar. Även om detta också kan sägas om bedövad in vivo-metoder, förekomsten av anestetika förändrar nödvändigtvis neural funktion, nämligen retande / hämmande balans, vilket är avgörande för informationsbehandling i denna och andra lukt kretsar 18. Eftersom beredningen undviker användningen av bedövningsmedel, och eftersom AOB ytan är helt utsatt för superfusate är det mottaglig för farmakologiska undersökningar av lokal neural bearbetning.
Det finns naturligtvis vissa begränsningar i denna beredning. Det finns evidence gradvis degeneration av de djupaste AOB nivåer: den djupa delarna av inre cellskikt, som rymmer många hämmande granulceller 16. Dessutom är centrifugal ingångar avskurna under dissektion, eliminera dem från aktivt deltagande i AOB funktion. Kanylering av VNO kringgår normala verkan av det vomeronasala pump, och spolar bort de endogena vätskor närvarande i VNO lumen.
Kritiska steg för att nå framgång med denna metod är den känsliga hemisection (Steg 3.20) och VNO kanyle (steg 4.11). Man kan räkna med att kräva omfattande praxis att tillförlitligt producera funktionellt kopplade ex vivo förberedelser. Den sekundära dissektion kammare utnyttjas här kan användas för att bedöma funktionell uppkoppling med hjälp av enkel-elektrodinspelningar under stimulering av VNO med källor av mus feromoner (såsom utspädd urin). 13,15 Modifieringar av den sekundära dissektion kammaren kan be gjorde som att läkemedlet kan roteras till vinklar lämpade för andra ändamål, till exempel multi avbildning.
De många tekniska hinder för att studera den levande AOB har länge utgjort ett hinder för vår förståelse av social lukt-och feromon sensorisk bearbetning. Genom att dissekera bort de tidigaste neurala komponenter i denna sensoriska bana i denna dissektion protokoll, är en möjlighet att få experimentell tillgång till dessa är svåra att studera kretsar. Vi har använt detta preparat för detaljerade undersökningar vomeronasala sensorisk bearbetning 19 och sensorisk kartläggning (Hammen et al., Opublicerad). Denna teknik kommer att vara användbara för framtida studier av sensorisk bearbetning i AOB, i synnerhet sådana som kräver optisk tillgång till vävnaden (t.ex. multifotonavbildning och optogenetics). Fördelarna med denna strategi kompletterar de av in vivo-metoder, och förbättra vår verktygslåda för att undersöka de neurala mekanismerna för vomeronasal-medierad såsiella och reproduktiva beteenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga väsentliga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) och Southwestern start medel (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
