Summary
L'ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l'information des phéromones de souris et kairomones.
Abstract
Le système olfactif accessoire de la souris (AOS) est une voie sensorielle spécialisé pour détecter les odeurs non volatiles sociaux, les phéromones, et kairomones. Le premier circuit de neurones dans la voie AOS, appelé le bulbe olfactif accessoire (AOB), joue un rôle important dans l'adoption de comportements sexuels typiques tels que l'agression territoriale et l'accouplement. Ce petit (<1 mm 3) circuit possède la capacité de distinguer des états comportementaux uniques, tels que le sexe, la souche et le stress à partir d'indices chimiosensoriels dans les sécrétions et des excrétions de leurs congénères. Bien que l'organisation de ce système compact offre des possibilités uniques pour l'enregistrement de grandes portions du circuit simultanément, l'enquête du traitement sensoriel dans le AOB reste difficile, principalement en raison de son emplacement expérimentalement désavantageuse dans le cerveau. Ici, nous démontrons une dissection multi-étape qui élimine l'AOB intacte à l'intérieur d'un seul hémisphère du crâne de souris antérieure, laissant connecterions à la fois les voméronasal périphérique neurones sensoriels (VSN) et circuits neuronaux locale intactes. La procédure expose la surface de AOB pour diriger l'inspection visuelle, ce qui facilite les enregistrements électrophysiologiques et optiques à partir des éléments de circuit AOB en l'absence d'anesthésiques. Lors de l'insertion d'une canule fine dans l'organe voméronasal (VNO), qui abrite les VSN, on peut exposer directement la périphérie des odeurs et des phéromones sociaux tout en enregistrant l'activité en aval dans la AOB. Cette procédure permet enquêtes contrôlées dans AOS traitement de l'information, qui peuvent faire la lumière sur les mécanismes reliant l'exposition à la phéromone à des changements de comportement.
Introduction
Traitement sensoriel dans le cerveau des mammifères couvre généralement plusieurs circuits neuronaux réciproquement connectés, chacun extrait les caractéristiques particulières de l'entrée sensorielle. Dans les voies sensorielles, début traitement de l'information est essentielle à la perception et le comportement normal. Dans le système olfactif accessoire (AOS), le bulbe olfactif accessoire (AOB) est le principal circuit neuronal qui relie la périphérie sensorielle aux structures en aval qui dictent l'équilibre hormonal 1,2, 3 agression, et l'excitation 4. En tant que tel, le traitement de l'information au sein de ce circuit est fortement liée à l'évolution du comportement animal.
Le bulbe olfactif accessoire se trouve chez les souris et les rats à l'aspect dorsal / caudale / postérieure du bulbe olfactif principal (MOB) sous la dense, vascularisé sinus rhinal. L'AOB reçoit innervation afférente de axones des neurones sensoriels voméronasal périphérique (VSN) qui résident dans l'organe voméronasal (VNO), un small tube borgne dans le museau antérieure juste au-dessus du voile du palais. Ces axones traversent la feuille sensible de tissu septal à la limite médiale de passages nasaux. Plusieurs études ont sondé les réponses neuronales AOB à des sources d'odeurs AOS (tels que l'urine de la souris) in vivo utilisant des souris anesthésiées 5-7 ou animaux librement explorer 8. L'héroïque anesthésiés dans les études in vivo concernés (a) trachéotomie pour assurer une anesthésie profonde et prévenir l'aspiration des stimuli 5-7 liquide, (b) la stimulation du ganglion sympathique cervical 6 ou canulation directe de l'organe voméronasal 5,7 à introduire les odeurs non volatiles et (c) avec ou sans craniotomies ablations du lobe frontal pour permettre l'avancement dans l'électrode AOB 6. Awake / se comporter études 8-10 implantation chirurgicale impliqués d'une microdrive. En somme, ces paradigmes expérimentaux sont puissants, mais extrêmement difficile et nécessitent une anesthésie souvent.
(ex vivo) avec un certain succès 11-15. Parce que les liens entre le VNO et AOB restent ipsilatéral, et parce que le tissu médiane septale peut être exposé à superfusat oxygéné dans un seul hémisphère, nous avons cherché à développer une telle approche ex unique de l'hémisphère vivo d'isoler ces structures tout en maintenant leur connectivité fonctionnelle. Nous avons récemment réussi à atteindre cet objectif 16. Cette préparation conserve à la fois le VNO et AOB vivant et relié fonctionnellement au moins 4 - 6 h parce que les deux axones (le long de la ligne médiane tissu septal doux) et AOB sont relativement peu profonds <600 um fonctionnalités qui sont accessibles à superfusées liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné ( aCSF). Cette ex préparation VNO-AOB vivo permet l'introduction de stimuli contrôlés dans le VNO par une canule mince, etun accès visuel direct à la petite AOB pour le placement des électrodes ciblée et / ou microscopie à fluorescence en direct. Ce procédé est avantageux si l'on souhaite étudier ces circuits, en l'absence d'anesthésiques. Parce que cette approche rompt les connexions centrifuges, il n'est pas bien adapté aux demandes de renseignements dans la modulation de la fonction centrifuge AOB. L'ex préparation VNO-AOB vivo est difficile à apprendre, mais une fois atteint produit une plate-forme fiable sur laquelle enquêter sur l'organisation du circuit, le traitement de l'information, et la plasticité neuronale dans ce circuit sensoriel puissant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le sud-ouest institutionnel Comité de protection et d'utilisation des animaux UT, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l'inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire.
1. Chambre Dissection
Une chambre de dissection personnalisé et petit, mince planche de plastique sont nécessaires pour obtenir les meilleurs résultats (figure 1). Construire ou obtenir une telle chambre avant de tenter ce protocole.
2. Solutions de dissection
- Préparer 1 litre de liquide céphalo-rachidien artificiel standard (aCSF) pour une utilisation dans les étapes 03.22 à 05.04. Ajouter NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, myo-inositol 3 mM, pyruvate de sodium à 2 mM, l'ascorbate de sodium 0,4 mM, et de glucose 25 mM à 1 L d'eau apyrogène.
- Préparer l'aCSF de dissection initiale (200 ml) pourutiliser dans les étapes 3.3 à 3.22. Prenez 200 ml de la norme aCSF et augmenter la concentration de MgCl2 par 9 mM en ajoutant 0,366 g de MgCl 2 hexahydraté.
- Préparer la solution de norme assortie d'effectuer des stimuli au VNO par la canule pour une utilisation dans les étapes 4.11 à 5.4 contenant NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM.
- La bulle de 0,8 L d'aCSF standard et 0,5 L de Ringer avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux dans un bain d'eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min jusqu'à utilisation.
- Bubble les 200 ml d'aCSF de dissection initiale avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux sur de la glace pendant 15 à 20 min jusqu'à ce qu'elle atteigne 4 ° C.
3. Dissection primaire
- Préparer la zone de dissection. Placez trois boîtes de 35 mm de Pétri, oxygéné aCSF, ciseaux de décapitation, courbes dissection, ciseaux de dissection droite ciseaux, pince Adson, un cuir chevelu # 11el lame et la poignée et une lame de rasoir sur de la glace.
- Après oxygéné aCSF a refroidi à 4 ° C, anesthésier l'animal profondément dans une chambre de dessiccation en utilisant 5.2 ml Isothesia (99,9% isofluorane). Effectuer des tests de pincement queue et pieds pour s'assurer que l'animal est sous anesthésie profonde.
- Une fois l'anesthésie profonde est confirmée, décapiter l'animal et placer immédiatement la tête dans une boîte de Pétri remplie avec la dissection aCSF réfrigérés. REMARQUE: Plonger le tissu dans la dissection froide aCSF pour le garder frais tout au long de la procédure lorsqu'il n'est pas utilisé.
- Retirer l'aspect inférieure (ventrale du pharynx, de la mâchoire inférieure et la langue) avec des ciseaux courbes.
- Utilisation Adson forceps deglove (zeste) la peau superficielle et insertions musculaires du crâne. Peler le cuir chevelu de caudal à rostral jusqu'à ce que le seul site de fixation est sur les dents de devant. Couper le tissu au point de fixation à l'aide des ciseaux courbes. Retirer les yeux en le saisissant avec une pince et retirez-le de la préparation. Nl'oreille la fin de la procédure dégantage, éviter une force excessive sur le cartilage nasal délicate en utilisant les forceps Adson de libre insertions musculaires des os de la mâchoire supérieure. REMARQUE: Retirez le cuir chevelu de la partie caudale du crâne avec des ciseaux droits.
- Avec les ciseaux droits, couper la ligne médiane du crâne de caudal à rostral jusqu'à ce que les pointes du ciseau sont quelques mm dans les os frontaux (juste avant le sinus rhinal).
- Retirez le pariétal et frontal du crâne avec une pince Adson. REMARQUE: Des morceaux de l'os frontal ne restent souvent attachés aux os du nez caudale du sinus rhinal. Enlevez ces morceaux en prenant soin de ne pas contacter les bulbes olfactifs.
- Utilisez le scalpel pour faire une coupe coronale par le lobe frontal 2 mm caudale pour les sinus, puis retirez la caudale du cerveau à la coupe. Assurer la pointe des contacts de scalpel le contour osseux du crâne ventrale de couper complètement le tissu postérieur. NOTE: Cela permetsuppression de la majorité du cerveau sans mettre le stress mécanique sur les voies olfactives latérales ou bulbes olfactifs.
- Retirez les aspects exposés caudale du crâne ventrale avec des ciseaux droits. Laissez les sinus et le reste du tissu nerveux.
- Retirer l'arcade zygomatique et des muscles faciaux sur le côté droit anatomique du crâne à l'aide des ciseaux droits
- Tournez le museau plus (face ventrale) pour exposer le toit de la bouche.
- Couper et enlever le palais immédiatement caudale pour les incisives. Pour ce faire, en insérant l'extrémité de la lame de scalpel sous le palais parallèle sur le toit de la bouche, puis déplacer la lame vers les incisives.
- Saisissez le (rostrale) libéré bord de la bouche avec une pince Adson et enlever en tirant caudale.
- Sur le plan anatomique gauche du crâne, utiliser la lame de scalpel pour étendre les trou palatin caudale, à partir des petits trou près des molaires. Atteindre cet objectif en insérant l'extrémité de la bla scalpeldé dans le vide près des molaires et en tournant le poignet. REMARQUE: Utilisez une extrême prudence pour utiliser uniquement la pointe de la lame - une coupure profonde peut endommager les tissus du septum.
- Avec la pointe de la lame de scalpel, couper du foramen palatin par les incisives, à partir rostrale de l'organe voméronasal gauche anatomique. Utilisez plusieurs coupes de notation. Ne pas endommager le tissu septal et les nerfs voméronasal en insérant la lame trop profonde.
- Tourner le tissu de sorte que le crâne dorsale est orientée vers le haut et ensuite orienter la lame de rasoir à la verticale (parallèle à la ligne médiane) au bord extrême de la préparation.
- Au niveau du bord ventral du tissu, toucher le bord de coupe de la lame de rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane. Balancer doucement la lame et se déplacer le long du trou palatin gauche (région introduit à l'étape 3.14 couper).
- A la partie dorsale du tissu, de placer le bord de coupe du rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane (moins de 1 mm).
- Tenuela lame parallèle à la ligne médiane, basculer la lame de rasoir avec la pression lentement vers la partie antérieure du tissu. Remarquez résistance à la lame criblée. Arrêtez immédiatement après le cassage par cette résistance. NOTE: A ce stade, l'hémisphère droit est desserré de l'hémisphère gauche. La connexion ne reste plus entre les hémisphères le long de la dorsale museau en avant de la lame criblée.
- Séparez les hémisphères en les saisissant près des côtés caudale avec les doigts gantés et délicatement tourner latéralement et en avant. REMARQUE: Cette étape est une source de variabilité expérimentale, en particulier chez la souris à museau déviées ou fragiles (par exemple, les souris plus âgées). En outre, lors de la tentative de faire tourner les demi-sphères à une distance l'une de l'autre, si une forte résistance est rencontrée marquer le museau dorsale (antérieure à la lame criblée) pour affaiblir les tissus conjonctifs. Ce faisant, prendre une extrême prudence de ne pas insérer le scalpel profondément, ce qui peut endommager le ti septalessu et les nerfs voméronasal.
- Appliquez une petite quantité (50-100 pi) de colle à tissu sur la planche et placez doucement le bord latéral de l'hémisphère droit sur la colle en utilisant les forceps Adson. Retirer l'excès d'humidité de la face latérale de la préparation à l'aide d'une serviette en papier pour empêcher la polymérisation de la colle prématurée et l'adhérence lâche à la planche. NOTE: appliquer quelques gouttes de la dissection aCSF refroidi sur de l'échantillon afin d'accélérer la polymérisation de la colle après que le tissu est placé sur la colle. Cela garantit que le tissu reste bien en attente à la planche.
- Placer une petite quantité (d'un diamètre de 5.3 mm, 2 mm de profondeur) de la graisse à vide dans le milieu de la chambre de dissection secondaire et placer le côté de la face de la planche en tissu fermement contre la graisse. Remplir immédiatement la chambre de dissection froide dissection aCSF, transférer dans la zone fin de dissection et de commencer la perfusion avec oxygénée aCSF standard. Orienter la lame de façon que le bulbe olfactif est directement dans l'flux fraîchement oxygéné aCSF standard.
4. Dissection secondaire
- Retirez tout controlatérale (gauche) bulbe olfactif visible ou tissu cortical de la préparation à l'aide de pinces fines. Pincez les pinces fines (formant une pointe émoussée semi), puis placez-le à la partie dorsale et caudale du tissu près de la ligne médiane. Doucement courir la pince pincé le long de la ligne médiane, le pelage du tissu loin de l'hémisphère droit lentement en mouvement antérieur. Retirez tout le tissu controlatéral, y compris le tissu de bulbe olfactif controlatéral. Prenez soin de ne pas poignarder à travers le tissu, ce qui peut causer des dommages à l'AOB ou voméronasal nerf.
- Observer la dure-mère blanc le long de la surface dorsale / médial du bulbe olfactif. Déchirez cette dure-mère le long du bord dorsal / caudale du bulbe olfactif en saisissant à la partie la plus blanche de la dure-mère avec deux paires de pinces fines et tirez-les loin de là. La durée est étroitementenroulé autour des bulbes olfactifs, et peut facilement se couper à travers le tissu pendant qu'il est retiré. Éviter d'endommager la surface interne du bulbe olfactif et l'AOB lui-même. NOTE: Si la durée résiste déchirer facilement à ce stade, d'introduire une petite coupe avec des ciseaux fins de dissection de pointe de printemps pour faciliter la séparation.
- Lentement et soigneusement décoller le cortex frontal avec des pinces fines sans endommager les bulbes olfactifs sous-jacents. Observer une collection de vaisseaux sanguins apparaissent comme un filet semi-transparent immédiatement caudale à l'AOB. Retirer ce filet avec des pinces fines pour faciliter la pénétration de l'électrode dans des expériences électrophysiologiques. Saisir le filet avec des pinces comme le sépare de la AOB lors de la rentrée de cortex frontal et l'enlever en tirant en bas et en dedans, en faisant attention de ne pas toucher l'AOB. Une fois que le cortex frontal a été séparé des bulbes olfactifs, retirez-en le coupant avec une pince ventrale et postérieure à l'AOB. REMARQUE: Prenez extreme soins à l'enlèvement net, car si cela est fait trop rudement la couche glomérulaire peut être endommagé.
- Dans la cavité nasale controlatérale exposée, enlever tout tissu septal controlatéral restant (feuille fragile jaunâtre contenant des vaisseaux sanguins) en utilisant les pince fine. Saisissez le tissu à la région caudale / dorsale (près de l'os de la cloison) et puis tirez / soulever le tissu vers le côté antérieur. NOTE: Le tissu septal controlatéral peut être retiré par inadvertance pendant l'étape d'hémisection (étape 3.20). Dans ce cas, respecter un blanc, cartilage septal avasculaire et le légèrement transparent, vascularisé septale os. Si tel est le cas, l'étape 4.4 peut être ignorée.
- Retirez délicatement le VNO controlatéral par l'exécution d'un point de la pince fine entre le cartilage septal et la "aile" VNO (un mince morceau de tissu osseux qui longe le bord dorsal de deux VNO unique.
- Après le détachement de l'aile du cartilage, déplacer la pointe de la pince sur le ventredans le VNO controlatéral près de la ligne médiane. Répétez cette étape à plusieurs endroits le long de l'axe caudale / rostrale du VNO controlatéral pour le desserrer, ce qui lui permet d'être éliminé en saisissant avec une pince et se soulever.
- Préparez-vous à retirer le cartilage septal en faisant une coupe au bord ventral / caudal (où il se rétrécit à un blanc avasculaire bande de fonctionnement du côté ventral de l'os de la cloison) avec des pinces fines.
- Retirer le cartilage septal par pinçant les pince fine pour faire un point émoussé semi. Identifier la coupe faite à l'étape 4.6, insérer la pince pincé derrière (latérale) à cette coupe, puis soulevez lentement le cartilage loin du tissu septale et de procéder rostralement. NOTE: Ne pas perturber le tissu septal sous-jacent. Comme le cartilage est levé, observer la feuille sous-jacente de l'étirement des tissus septale due à des adhérences lâches au cartilage. Un mouvement périodique, doux et stable des pinces fines pincés sur ce site d'un lâchedhesion peut grandement faciliter la séparation réussie des deux structures.
- Utilisez une paire de pinces # 3 avec une pointe recourbée pour enlever l'os de la cloison. Approcher l'os du septum à un angle à peu près parallèle au plan de l'os septal. Insérer la dent incurvée entre le tissu septal et septale os. Saisissez l'os avec la pince et déplacez doucement l'os en arrière jusqu'à ce qu'il fissures près de la lame criblée. REMARQUE: Dans certains cas, l'os septal résiste casser près de la lame criblée. Dans ce cas, utilisez une pince fine à marquer doucement l'os de la cloison le long de l'axe de dorsale / ventrale juste en avant de la lame criblée, puis répétez l'étape 4.8.
- Retirer le cartilage blanc juste rostrale au VNO par pincement avec une paire de pinces fines à l'entrée et en tirant rostralement avec une autre paire de pinces fines.
- Fixez la canule de polyimide à un dispositif de perfusion rapide et démarrer le flux de la solution de Ringer (0,1-0,3 ml / min) à travers la canule de polyimide.Débit Mesure avec un débitmètre petit volume en ligne: NOTE. Utilisation d'un dispositif de commutation pneumatique de relance piloté par ordinateur réduit les changements de débit pendant la stimulation. Comparer les réponses de neurones pour tester stimuli avec des réponses à un stimulus maquette (contrôler la solution de Ringer) pour assurer des réponses sont spécifiques stimulus.
- Orienter la canule parallèle à l'entrée VNO. Lorsque la canule est satisfaisante parallèle à l'entrée VNO, montre que la pression de sortie provoque le VNO à "gonfler", conduisant à l'évacuation du vaisseau sanguin. Insérer immédiatement la canule dans le VNO, en gardant l'angle de la constante de canule de sorte qu'il demeure parallèle à l'ouverture VNO. REMARQUE: Il peut être utile de tenir la canule avec une paire de pinces fines contre la planche de plastique et utiliser une autre paire de pinces fines à l'angle de la fin de la canule légèrement vers le haut. Si l'on place par inadvertance la canule derrière le VNO, la sortie peut également provoquer le vaisseau sanguin VNOà évacuer, ce qui conduit à l'impression d'une canule appropriée a été effectuée. Emplacement correct peut être confirmée par l'incorporation d'un colorant dans une solution de Ringer. Lorsque la canule est correctement placé, le colorant doit seule sortie par l'entrée VNO. En outre, on peut confirmer le positionnement correct en faisant en sorte que la canule est facilement visible à travers la face interne semi-transparent du VNO.
- Déplacer la planche de plastique lentement jusqu'à ce que la AOB est dans le flux direct de la aCSF standard, en prenant soin de ne pas déloger la canule du VNO. La dissection est terminée et l'évaluation de la fonction physiologique peut commencer immédiatement. Étape 5 décrit brièvement une approche pour faire une telle évaluation.
5. Evaluation
- Pénétrer la surface de la AOB 2-4 MQ avec une microélectrode de verre de borosilicate attaché à un amplificateur extracellulaire et oscilloscope.
- Avancer lentement la microélectrode à une profondeur de 100-200 um de lasurface à un débit de 50 pm / min. NOTE: A cette profondeur de tissu, on rencontrera l'action spontanée des signaux potentiels occasionnels, illustrés par de brèves (~ 1-2 msec) déviations brusques de la tension de microélectrodes.
- En rencontrant une action onde potentiel, cesser d'avancer la microélectrode.
- Observer et / ou enregistrer le taux potentiel d'action tout en changeant la solution de livraison de relance de contrôle Ringer à un activateur connu de l'activité de VSN (par exemple, la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Si la dissection a été un succès, un changement de stimulus-dépendante dans l'action taux potentiel ou potentiel de champ local peut être observée. REMARQUE: tous les neurones AOB répondront à tous les stimulus avec une augmentation de la fréquence de mise à feu (y compris la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Une diminution de stimulus-dépendante du taux de tir indique également la connectivité fonctionnelle et une dissection de succès. Dans le cas où deux ou plus de neurones que l'on rencontresont insensibles à VNO stimulation, ou si aucun des potentiels d'action sont observés après de multiples pénétrations d'électrodes, ce qui suggère une dissection sans succès. Si tel est le cas, une nouvelle dissection peut être initiée à l'étape 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Atteindre le succès avec cette préparation prend beaucoup de pratique, et a plusieurs étapes à laquelle il peut échouer. On devrait s'attendre à exiger de nombreuses tentatives avant de parvenir à la réussite. La chambre de dissection personnalisé est nécessaire pour la réussite de ce protocole, et doit être obtenue avant de commencer les étapes ultérieures de la dissection. La conception de la chambre présentée sur la figure 1 est suffisante à cette fin, et peut être réalisé en matière plastique relativement peu coûteux avec des exigences minimales d'usinage. Si l'on n'a pas la capacité de produire une telle chambre, les entreprises d'usinage locales ou en ligne peuvent être consultés et peuvent construire la chambre moyennant un supplément.
Une source importante de variabilité entre les préparations est la masse volumique et de la fragilité des os du crâne et du museau de l'animal de laboratoire. Au cours des étapes de Hémisection (étapes 03.14 à 03.20), le but est d'isoler les deux organes voméronasal avec le tissu septal ipsilatérale etbulbe olfactif accessoire ipsilatéral. Cependant, il n'est pas rare que le tissu septal à rester attachée à l'hémisphère controlatéral, des points particulièrement près de fixation à l'os dorsal du museau. Figure 2 montre un exemple d'un hémi efficaces et inefficaces.
D'autres erreurs de dissection communes se posent lors de la dissection fine, au cours de laquelle les axones du nerf voméronasal peuvent être endommagés dans le tissu septal près de l'organe voméronasal (figures 3A et 3B) ou près de l'AOB (figures 3C et 3D). Ces événements similaires et se traduira par la connectivité incomplète entre VSN et la AOB, rendre les préparations inutilisable.
Le dernier obstacle à la réussite de la préparation est l'étape de cathétérisme VNO (étape 4.11). Le positionnement correct de la canule VNO se traduira par la pressurisation de la lumière VNO, provoquant l'expulsion immédiate de le sang résiduel à partir de la pompe voméronasal. La canule doit être clairement visible sous la voméronasal épithélium relativement transparent et l'apparition de la canule doit être uniforme sur toute sa longueur à l'intérieur du VNO. À l'issue de la procédure, on peut vérifier la connectivité fonctionnelle en utilisant une analyse physiologique comme seule unité enregistrements électrophysiologiques de l'activité neuronale en réponse à la stimulation VNO avec une source connue de substances odorantes VSN (figure 4).
Figure 1. A) Les dessins techniques de la chambre de dissection personnalisé utilisé dans les étapes 03.22 à 05.04. REMARQUE: Les petits trous peuvent être percés pour accueillir solution et gazage entrées et sorties comme vous le souhaitez B) Exemple photo de la chambre de dissection utilisé dans ce protocole.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. A, B) images représentatifs de succès (A) et infructueuses (B) l'après l'étape de hemisection (étape 3.20). Le VNO, les tissus du septum, et bulbes olfactifs (OB) doivent tous être maintenus à partir de l'hémisphère ipsilatéral (dans ce cas, le droit (en bas) hémisphère. Si cornets nasaux sont visibles sur l'hémisphère ipsilatéral, la dissection a échoué. Graduations sont 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figure 3. A, B) images représentatives du tissu septal intact et endommagé entre le VNO et AOB. En B, les pinces à dissection pris contact par inadvertance avec le tissu, endommageant les axones tracts VN. C, D) AOB intacts et endommagés. En D, l'enlèvement de la dure-mère qui entoure l'OB ipsilatéral a abouti à sectionner le nerf voméronasal près de l'AOB, ce qui provoque une tache visible du tissu près de la médiane AOB. Barres d'échelle sont de 1 mm de longueur.
Figure 4. A) parcelle Exemple de trame de potentiels d'action enregistrés à partir d'un neurone de AOB (extracellulaire d'enregistrement de l'unité) dans une préparation réussie. Traces dans le show noir aucun changement dans le taux d'allumage lorsque la solution de contrôle de sonnerie a été livré à la VNO pendant 5 secondes (b grisbœuf). Traces en rouge indiquent la réponse de la même neurone à VNO stimulation avec BALB / c urine de souris femelle dilués 100 fois dans une solution saline. B de Ringer) péri-stimulus histogramme de temps des mêmes réponses à un. Les barres d'erreur représentent les erreurs types de la moyenne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'ex préparation VNO-AOB vivo décrite dans ce protocole est une alternative intéressante à anesthésiés in vivo 5-7 et tranche en direct aiguë 17 expériences de la fonction AOB. Contrairement aigus expériences AOB de tranche, qui exposent également des éléments de circuit pour des enregistrements électrophysiologiques et optiques, cette préparation conserve tous les afférences sensorielles et les connexions intra-AOB. Bien que cela peut aussi être dit de anesthésié dans des approches in vivo, la présence d'anesthésiques modifie nécessairement la fonction neuronale, à savoir l'équilibre excitation / inhibition, ce qui est crucial pour le traitement de l'information dans ce domaine et d'autres circuits olfactifs 18. Étant donné que la préparation permet d'éviter l'utilisation d'anesthésiques, et parce que la surface de AOB est complètement exposé à la superfusat, il se prête à des demandes pharmacologiques dans le traitement neuronal local.
Il existe, bien entendu, certaines limites de cette préparation. Il est evdence de la dégénérescence progressive des couches les plus profondes de AOB, à savoir les parties profondes de la couche cellulaire interne, qui abrite de nombreuses cellules granulaires inhibitrices 16. En outre, les entrées centrifuges sont rompus lors de la dissection, les éliminer de la participation active de la fonction AOB. Canulation du VNO contourne l'action normale de la pompe voméronasal, et à évacuer les fluides endogènes présentes dans la lumière VNO.
Étapes essentielles à la réussite de cette méthode sont la hemisection délicate (étape 3.20) et VNO canule (étape 4.11). On peut s'attendre à exiger beaucoup de pratique pour produire de manière fiable ex vivo préparations fonctionnellement liés. La chambre de dissection secondaire utilisée ici peut être utilisé pour évaluer la connectivité fonctionnelle en utilisant des enregistrements mono-électrode lors de la stimulation du VNO avec des sources de phéromones de la souris (comme urine diluée). 13,15 Modifications de la chambre de dissection secondaire peuvent be fait que la préparation permet de rotation à des angles adaptés à d'autres fins, telles que l'imagerie multiphotonique.
Les nombreux obstacles techniques à l'étude de l'AOB vie ont longtemps posé un obstacle à notre compréhension de l'odeur sociale et le traitement sensoriel de phéromone. En disséquant loin les premiers éléments de neurones de cette voie sensorielle dans ce protocole de dissection, on est capable d'avoir accès expérimental à ces circuits difficiles à l'étude. Nous avons utilisé cette préparation à l'examen détaillé de traitement sensoriel voméronasal 19 et cartographie sensorielle (Hammen et al., Non publié). Cette technique sera utile pour de futures études dans le traitement sensoriel dans le AOB, en particulier ceux nécessitant l'accès optique au tissu (par exemple, l'imagerie multiphotonique et optogenetics). Les avantages de cette approche sont complémentaires à celles des approches in vivo, et d'améliorer nos outils pour étudier les mécanismes neuronaux de voméronasal médiation afincomportements sociaux et de la reproduction.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont aucun d'importants conflits d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) et les fonds de démarrage UT Southwestern (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
