Abstract
Epitheliale eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische maligniteit in de Verenigde Staten. Hoewel patiënten in eerste instantie reageren op de huidige standaard van zorg die bestaat uit chirurgische debulking en combinatie chemotherapie bestaande uit platina en taxaanverbindingen, bijna 90% van de patiënten terugkeren binnen een paar jaar. Bij deze patiënten de ontwikkeling van chemoresistente ziekte beperkt de effectiviteit van de momenteel beschikbare chemotherapeutische middelen en derhalve bijdraagt tot de hoge mortaliteit. Om nieuwe therapie opties die terugkerende ziekte kunnen richten ontdekken, zijn geschikte dierlijke modellen die na te bootsen het klinische profiel van patiënten met terugkerende eierstokkanker nodig. De uitdaging controle intraperitoneale (ip) ziekte beperkt het gebruik van ip modellen en dus het meest xenotransplantaten gevestigd subcutaan. We hebben een gevoelige optische imaging platform dat de detectie en de anatomische locatie van ip tumormassa laat ontwikkeld. Het platform omvat de use optische reporters die zich uitstrekken van het zichtbare licht tot nabij infrarood, die in combinatie met 2-dimensionale röntgen coregistratie anatomische locatie van moleculaire signalen kunnen verschaffen. Detectie wordt aanzienlijk verbeterd door het gebruik van een systeem dat hierbij het dier meerdere hoekposities 360 graden beeldvorming drijft, waardoor de identificatie van tumoren die niet zichtbaar zijn in één richting zijn. Dit platform biedt een uniek model voor niet-invasieve tumorgroei controleren en evalueren van de effectiviteit van nieuwe therapieën voor de preventie of behandeling van recidiverende eierstokkanker.
Introduction
Diermodellen zijn onmisbare hulpmiddelen in life science onderzoek. Bij kanker in het bijzonder, de gegevens verkregen uit dierproeven zorgen voor de nodige informatie over het testen van nieuwe diagnostische of therapeutische toepassingen bij de mens 1-3 initiëren. Diermodellen voor vaste kankers zijn klassiek vastgesteld subcutaan omdat het een gemakkelijke manier om tumorlast effectiviteit van de behandeling te meten en te evalueren zonder de dieren offeren. Inderdaad, intraperitoneale (ip) modellen maken dieren opgeofferd ter detectie en meting veranderingen in tumorgroei. Voor ip kankers zoals eierstokkanker, orthotroop modellen bieden het voordeel van het bestuderen van de ziekte in de juiste omgeving 4-6. Voor een dergelijk model voor gebruik in de evaluatie van anti-tumor activiteit, moeten niet-invasieve beeldvorming te ontwikkelen dat kwantificering van ip tumorlast in levende muizen mogelijk.
Een belangrijke uitdaging in degebruik van ip diermodellen is de moeilijkheid in het nauwkeurig kwantificeren tumorbelasting door lichamelijk onderzoek. Kwantificatie van ip tumoren vereisen gewoonlijk de muizen worden opgeofferd voor dissectie. Deze benadering vereist het gebruik van grote aantal dieren dat zou worden opgeofferd op verschillende tijdstippen. Naast de kosten, introduceert hoge data variabiliteit gevolg van inherente variaties binnen elk dier. Niet-invasieve in vivo optische beeldvorming zorgt voor een meer passende aanpak te monitoren ip tumorbelasting in levende muizen.
Verschillende niet-invasieve beeldvorming methoden worden momenteel gebruikt in pre-klinisch onderzoek voor de monitoring van tumorgroei en de therapeutische respons. Deze omvatten computertomografie (CT), ultrageluid (US), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), positron emissie tomografie (PET), en optische beeldvorming zoals fluorescentie en bioluminescentie 7-12. CT is een transmissie imaging proces combineren X-ray en computre technologie. Het produceert een dwarsdoorsnede afbeelding van gedetecteerde balken hoogenergetische fotonen die door het lichaam met verschillende snelheid passeert. VS is een soort reflectie beeld, dat stuurt de hoge frequenties die aan het lichaam creëren geluidsgolven die worden gereflecteerd met verschillende snelheden, afhankelijk van tissue dichtheid en herkend door de computer om een visueel beeld te produceren van. MRI en PET zijn emissie beeldvormende modaliteiten die magnetische energie en nucleaire deeltjes te gebruiken, respectievelijk om het beeld te produceren. MRI maakt een sterk magnetisch veld dat cellen induceert hun eigen radiofrequenties, die worden gebruikt om een beeld te creëren produceren terwijl PET is een gevoelig camera om de radioactiviteit van de gemerkte toegediend 2-fluorodeoxy-D-glucose 7,9,11 detecteren. Tenslotte wordt optische beeldvorming gebaseerd op de detectie van de emissie van licht bioluminescente of fluorescente reporters of probes 9,12.
In dit rapport beschrijven we het gebruik van fluorescentie, dat biedtenkele voordelen boven andere soorten beeldvormende modaliteiten. Met fluorescentie beeldvorming, kunnen cellen genetisch gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten tot expressie voortdurend zonder de toevoeging van een substraat of ligatie probes die voorwaarde voor respectievelijk bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, zijn. Fluorescentie reporters ook typisch drukken een helderder signaal waardoor het gebruik van een minder gevoelige detectiemethode 8,12. Bovendien, met fluorescentie beeldvorming, is het mogelijk om tumoren kleiner dan 1 cm, hetgeen niet haalbaar CT 7-9 detecteren. Tenslotte, in tegenstelling tot bioluminescentie, fluorescentie signaal niet een aërobe omgeving vereisen en dus het signaal niet beperkt hypoxische omstandigheden, die gewoonlijk plaatsvinden in de kernen van grote tumoren 13.
Echter, zoals elke andere technologie, TL-based imaging methoden zijn nadelen. Een daarvan is het onvermogen van de machine-generated laag energetische fotonen door te dringen tot een voldoende diepte. Dus de hoeveelheid verspreide fotonen weefsel de dieren worden afgebeeld onder verschillende hoeken te minimaliseren. We beschrijven een protocol om een ip eierstokkanker in naakt muizen en een aanpak voor ip tumor controle dat hele dier beeldvorming biedt door rotatie vast te stellen. De rotator hoeken de muis om specifieke en herhaalbare posities verminderen van de weefsel storing die vaak optreedt tussen de lichtbron en de detector. Dit optimaliseert de visualisatie van kleinere tumoren die anders worden gemist.
Protocol
De Yale University Institutional Animal Care en gebruik Comite keuren alle in vivo werk beschreven. Monstername werd uitgevoerd met toestemming van de patiënt en door het Comité Human Onderzoeken van de Yale University School of Medicine goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de Mens eierstokkankercellen
- Voor het bereiden van de cellen of alle benodigde materialen voor de intra-uteriene injectie hieronder beschreven bereid en gemakkelijk toegankelijk. Injecteer de celsuspensie zodra het klaar is.
- Kweek fluorescent gelabelde kankercellen in kweek. We maken gebruik van een F2-generatie van de menselijke CD44 + / MyD88 + epitheliale eierstokkanker cellen, die we eerder aangetoond stemness eigenschappen zoals tumorgeniciteit, chemoresistance en hoge capaciteit voor tumor reparatie 14-19 haven. Deze cellen werden gegenereerd om stabiel tot expressie mCherry fluorescentie (F2-mCherry, fig. 1) met behulp van lentivirus uit het polyethyleenimine(PEI) protocol 20,21.
- Op dag van injectie, oogst de cellen door behandeling met trypsine en eenmaal wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Bepaal celgetal en opschorten van de cellen bij 3 x 10 6 cellen / 50 ul in geschikte groeimedia. Voor de eierstokkankercellen gebruiken we 160 RPMI met 10% FBS. Laat de cellen in de incubator tot klaar om te injecteren maar langer dan 15 minuten bewaren. Dit is voldoende voor een muis injectie.
2. Intra-uteriene Injectie van Human ovariumkankercellen in Athymische Naakt Muizen
Merk op dat de volgende procedure hulp van een tweede persoon nodig. Bovendien, omdat dit overleving chirurgie, steriel chirurgische instrumenten. Deze overleving chirurgische ingreep moet ongeveer 10 tot 15 minuten duren.
- Verdoven van de muis met behulp van 2% isofluraan. 7 tot 8 weken oude athymische naakt muizen wordt typisch gebruikt.
- Controleer of het dier is completely geanestheseerd door knijpen de voet pad met behulp van de vingers of een tang. Het dier dient geheel niet reageren op de pijn voor het starten van de operatie.
- Plaats de verdoofde muis ventrale zijde naar boven op een steriel gaasje met het hoofd weg van de onderzoeker.
- Solliciteer zalf op de ogen met een katoenen-tip applicator tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose.
- Plaats onmiddellijk de kop in een neuskegel systeem aangesloten op een isofluraan vaporizer (Fig. 2A). Dit levert de anesthesie gedurende de chirurgische procedure.
- Desinfecteren links (of rechts) van de buik met alcohol pads (fig. 2B), gevolgd door jodium plaats een steriele chirurgische laken over de operatieplaats.
- Met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet maak een 1-2 cm incisie in de huid op de linker kwadrant van de muis (Fig. 2C).
- Til de spieren en een insnijding om het peritoneum bereiken. <li> ontleden obliquus de buikholte bloot.
- Lokaliseren en identificeren van de linker baarmoedertak (Fig. 2D).
- Met behulp van steriele hemostaat, klem zowel voorste en achterste zijden van de hoorn (fig. 2E). Plaats de voorste klem direct onder de eileider en de achterste klem recht boven de baarmoederhals.
- Laat de tweede persoon te injecteren de celsuspensie. Plaats de naald bevattende cellen, bij 45 ° loodrecht op de hoorn (fig. 2F). Langzaam injecteren 50 pi celsuspensie in het lumen van de baarmoederhoorn.
- Verwijder de naald en laat de voorste klem.
- Laat de achterste klem en vervang de baarmoeder hoorn in de buikholte.
- Sluit het buikvlies met behulp van een synthetische absorbeerbare hechtdraad en sluit de huid met behulp van een tissue lijm.
- Verwijder de muis uit de neus en zet terug in de kooi. Wijzig indien nodig het beddengoed om een clea zorgenn kooi na de operatie. Zorg ervoor dat alle dieren zijn wakker en actief voor vertrek zonder toezicht.
- Zorg voor Ibuprofen bij 0,11 mg / ml van het drinkwater voor de eerste 48 uur na de operatie. Daarna, te vervangen door reguliere drinkwater.
- Opmerking: dat als athymische naakt muizen gebruikt en de huid wordt gesloten met weefsellijm plaats van hechtingen, is het niet nodig om de muizen te scheiden na de operatie. SCID muizen agressiever zijn en kunnen worden gescheiden.
- Nauwlettend toezien op de plaats van de incisie voor mogelijke infectie als gevolg van open wond.
3. Detectie van Early Stage Intra-peritoneale eierstokkanker door Leef in vivo beeldvorming
Bepaal de aanwezigheid van intra-peritoneale ip ziekte door het leven in vivo beeldvorming. Een Multimodaal Animal Rotation System (MARS) wordt gebruikt in dit protocol.
- Toegang tot de MARS capture software vanuit de MI-software. Deze module biedtgecoördineerde controle van de MARS-instellingen vast te leggen, terwijl gebruik te maken van acquisitie en analyse mogelijkheden van de imaging-systeem. Optimaliseer individuele opname-instellingen voor elke modaliteit gebruik van een single-view beeldvorming voorafgaand aan het ontwikkelen van de rotatie-protocol in stap 3.4.
- Input vooraf bepaalde capture waarden. Voor fluorescentie capture, gebruiken 10 sec belichting, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm instelling filter capture. Voor X-ray capture, gebruik dan een 10 sec belichting, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al instelling filter capture.
- Sla de parameters in stap 3.2 als individuele sessie bestanden.
- Maak een rotatie sequence protocol door de / Edit Protocollen knop Maken te selecteren in de interface verwerven venster.
- Selecteer het eerder opgeslagen fluorescentie sessie bestand en opslaan als Step One. Selecteer vervolgens het bijbehorende X-ray-sessie-bestand en sla als stap twee.
- Met Step One geselecteerd, gebruikt u de Set RotationSerie uit de Voordat Fotolader pop-up menu om de gewenste startpositie hoek, bereik en de toename op te stellen om te zorgen voor een naadloze weergave van functies. De specifieke waarden omvatten een starthoek van -180 graden, een reeks van 375 graden, en een toename van 15 graden.
- Sla het protocol en klik op de knop Gereed om de MARS initialiseren en de kaart van de stappenmotor posities die overeenkomen met elk van stappen van de hoek.
- Voer de laatste kalibratie hieronder beschreven om het ventrale, dorsale en zijaanzichten uitlijnen voor het specifieke dier gepositioneerd in het dierlijk specifieke graden rotatie te gebruiken door de software protocol.
- Verdoven de muis met een mengsel van medische lucht en 2% isofluraan bij een stroomsnelheid van 2 l / min.
- Beginnen met de aanpassing door op de knop Voorbeeld te selecteren vanuit het Acquire menu naar het tabblad Rotator brengen. Gebruik de reflecterende licht modaliteit in plaats van de meerdere golflengten of X-ray modaliteiten om het proces te versnellen.
- Selecteer de optie Load Mouse en verder door de reeks van positionering menu's.
- Zorg ervoor dat de tubed einde van het inklapbare neuskegel is in de neuskegel uitsparing en plaats de muis in buikligging oriëntatie met zijn hoofd in de neuskegel.
- Begin de kalibratie op 0 graden positie met de ventrale zijde van het dier naar beneden. Gebruik de twee knoppen op het roulatiesysteem om het dier zo te plaatsen dat het lijkt gecentreerd in het voorbeeldvenster.
- Herhaal het proces als gevraagd voor -180, - 90, 90, en 180 graden posities en klik op Gereed.
- Uitvoeren van de eerder opgeslagen protocol door te klikken op het protocol knop Uitvoeren van het belangrijkste verwerven venster. Tijdens de uitvoering van het protocol, te observeren een statusvenster real time status updates voor de huidige Capture, Exposure Duur, en de algehele Protocol stap.
- Monteer afzonderlijke beelden in een film formaat met behulp van deRotation software. Gebruik de Display Controls om de helderheid / contrast, de transparantie aan te passen, en om de kleur van het display voor de fluorescentie-signaal instellen.
- De uiteindelijke volgorde van de afbeeldingen te exporteren in het * .avi bestandsformaat voor presentatie.
4. Toediening van 1 e en 2 e ronde Chemotherapie
- Volgende ip tumor detectie door MARS, bepalen de initiële tumor last region of interest (ROI) met behulp van standaard tweedimensionale positionering. Dit wordt uitgevoerd op een transparante dier tray aangebracht in het beeldvormingssysteem zoals hierna beschreven in sectie 5 Zodra de eerste ROI wordt bepaald toedienen 4 doses van 12 mg / kg paclitaxel ip elke drie dagen. Paclitaxel wordt verkregen Hospira Inc. in een kant-en-klare formulering met Cremaphor als vehikel. We hebben eerder aangetoond dat deze behandeling regime significante antitumoractiviteit tegen de xenograft model vergeleken voertuig en induceert volledige uitroeiing van detecteerbare tumor last 20. Echter, vanwege de aard van de ziekte, ip tumoren terugkeren enkele dagen na de behandeling beëindigd 20.
- Monitor respons op behandeling door beeldvorming om de 3 dagen met standaard tweedimensionale positionering.
- Na de vierde dosis Paclitaxel, classificeren muizen met complete respons (ROI minder dan 2000), partiële respons (tot 35% vermindering van de oorspronkelijke ROI verkregen uit stap 4.1, stabiele ziekte (tot 50% verhoging van de oorspronkelijke ROI ) of progressie behandeld (meer dan 50% toename van oorspronkelijke ROI) op basis van het fluorescentiesignaal waargenomen.
- Voor muizen met een volledige respons, bewaken herhaling door beeldvorming om de 3 dagen. Zodra herhaling wordt waargenomen (ROI = om ROI te paraferen in stap 4.1), opnieuw beginnen met de tweede ronde van Paclitaxel, zoals beschreven in 4.1.
- Bij muizen met gedeeltelijke ziekte, stabiele ziekte, of die gevorderd met behandeling opnieuw beginnen tweede Paclitaxel 3 dagen na de 4e dosisPaclitaxel. Op dezelfde afbeelding deze om de drie dagen.
5. Monitoring respons op de behandeling met behulp van Standard Tweedimensionaal Positioning
- Verdoven de muizen te beelden met een mengsel van medische lucht en 2% isofluraan bij een stroomsnelheid van 2 l / min.
- Plaats de kop van de verdoofde muizen in afzonderlijke nosecones in de transparante dier lade in de beeldvorming kamer (fig. 3).
- Input van de vooraf bepaalde blootstelling parameters voor fluorescentie (10 sec belichting, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm) en X-ray (exposure 20 sec, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al filter).
- Klik Expose om beide afbeeldingen in de juiste volgorde vast te leggen.
- Open de beelden in de Bruker MI software voor visuele inspectie en de regio van belang analyse.
6. Image Overlay en Analyse
Om een goede vergelijking te bo biedenth visuele en kwantitatieve analyse van de tijd afbeelding volgtijdelijkheid proces alle voor- en achtergrond afbeeldingen op vergelijkbare wijze.
- Open zowel de voorgrond afbeelding (dwz fluorescentie) en de achtergrond beeldvorming in de software en selecteer de tegel-functie in het menu Venster op de top (Fig. 4A).
- Om de voorgrond afbeelding te verwerken; Open het tabblad Image Display op de bovenste balk (afb. 4A, rode pijl) en stel de min / max-waarden tot 260 en 5000, respectievelijk (Fig. 4A, blauwe pijl)
Opmerking: Image Display bereik verschilt van studie tot studie, afhankelijk van de fluorescentie-signaal intensiteiten in beeld gebracht. Afbeeldingen moeten worden vergeleken met een min / max dat tumor massa's zal laten zien, maar de achtergrond van autofluorescentie van het dier niet te laten zien. - Volgende geopend Auto-ROI Tab uit het navigatiepaneel aan de linkerkant (Fig. 4B, rode pijl) en selecteer de nieuwe ROI instellen in het menu (Afb. 4C, red eenrrow). Pas de instellingen voor de Threshold algoritme bij 630 grijsschaal niveaus te gebruiken en schakel het beperken grootte Max om alle potentiële ROI's zijn opgenomen (Fig. 4C) te waarborgen.
Opmerking: Threshold instellingen kunnen verschillen van studie tot studie, afhankelijk van de fluorescentie-signaal intensiteiten in beeld gebracht. Afbeeldingen thresholded om signaal van de tumor massa's te kwantificeren nog geen signaal meet van de achtergrond van autofluorescentie van het dier. - Vanuit het venster Afbeelding display selecteert de Mask functie. Nu alleen de oppervlakte die overeenkomt met de pixels die waarden gelijk aan of hoger dan de drempelwaarde van 630 grijstinten niveaus weergegeven.
- Voor het bekijken van de kwantitatieve resultaten selecteert u het tabblad Analyse van de bovenste menubalk en de selecteer de tab display (Fig. 4D, rode pijlen).
- Selecteer in het menu Weergave te selecteren van het serienummer, Som, Gemiddelde, en Area selectievakjes en klik vervolgens op OK.
- Sla de afbeelding, zodat de waarden ex kan zijnported langs zodra alle fluorescentie beelden worden verwerkt.
- Vervolgens markeert afbeelding de X-ray en weer open het beeld vanaf de bovenste menubalk. Instellingen voor het min, max en gamma de beste visuele representatie van de muis skelet geven.
Opmerking: Aangezien geen kwantificering wordt uitgevoerd op de röntgenbeelden ieder afzonderlijk beeld X-ray van de tijdreeks worden verwerkt (bijvoorbeeld min, max en gammawaarden) het dier naar representatie van dat gegevensset. - Opnieuw met afbeelding van de X-ray gemarkeerd schakelt u het selectievakje Overlay en kies de bijbehorende afbeelding fluorescentie bestandsnaam uit het drop down menu (Afb. 4E).
- Om de overlay-uitgang halen, selecteert u het tabblad Aantekeningen uit het navigatiemenu (Fig. 4B, blauwe pijl) aan de linkerkant. Selecteer de juiste tabbladen om aanvullende gegevens of tekst toe te voegen en tot slot voeg de intensiteit schaal bar, zodat de fluorescentie-intensiteit data snel kan worden bepaald uit de imleeftijd.
- Zodra de annotaties worden afgerond hoogtepunt alle objecten op de pagina Annotaties en selecteer Kopiëren in het menu Bewerken aan de bovenkant en de overlay beeldgegevens in het juiste bestand te plakken (bijvoorbeeld Word, PowerPoint, en / of Photoshop) voor weergave.
- Herhaal Stappen 6.1- 6.11 voor alle paren van fluorescentie en X-ray beelden in de reeks. Zorg ervoor dat u veilig alle beelden voordat ze te sluiten.
- Voor de uiteindelijke kwantificering open alle fluorescentie beelden tegelijkertijd en selecteer de tegel in het menu Venster langs de bovenkant.
- Daarna moet je de Export alle geopende documenten om de gegevens te bekijken.
Opmerking: In afwezigheid van Excel-programma, schakelt u op het tabblad. MI zal een door tabs gescheiden tekst (dwz .txt) bestand dat kan worden overgezet naar een geschikte computer voor verdere analyse te genereren.
Representative Results
Niet-invasieve live beeldvorming maakt het monitoren van ip tumorprogressie uit dezelfde muizen door de tijd. Intra-uteriene injectie van mCherry gelabelde F2 eierstokkanker cellen met de beschreven protocol genereert toegankelijk ip tumoren op dag 5 en metastasen op dag 32 (fig. 5). Figuur 6 toont het verband van de verkregen beelden met metastasen waargenomen na het opofferen van de muizen .
Beeldvorming met behulp MARS maakt detectie mogelijk van ip tumoren die anders missen als beeld wordt verkregen van één enkel vlak. Figuur 7 (bovenste paneel) toont aan dat zelfs in controle muizen met grote tumorlast, tumorgrootte te onderschatten afhankelijk van de hoek het beeld werd genomen uit. Het vermogen opdat tumormassa niet gemist of onderschat nog belangrijker aan het einde van 1e ronde chemotherapie bij dieren worden ingedeeld als volledig reagereneh, gedeeltelijke responder, of non-responder (Fig. 7 middelste paneel). Ook tijdens de onderhoudsbehandeling is het van het grootste belang om zeer kleine terugkerende tumoren te detecteren dagen goed te wijzen tot recidief, waarvan progressievrije interval (Fig. 7 middelste paneel) definieert.
Kwantitatieve beoordeling van tumorbelasting wordt geoptimaliseerd door rotatie dier. Rotatie van het dier hoeken die de diepte excitatie minimaliseren en emissie licht door zal voor de meest accurate vangst van fotonen van de fluorescentie, die duidt op de hoeveelheid tumorcellen en zo de tumorlast. Daarom is kwantificering geoptimaliseerd voor specifieke tumoren in het dier afhankelijk van zijn positie in de rotatie sequentie.
Bij de presentatie van beelden rotatie gegevens, is het belangrijk om de beelden wijs een min / max beeldcontrast bereik dat effectief alle tumormassa's wordt weergegeven, terwijl voor visu al afbakening van individuele tumor massa. Voor deze studie werd ideaal contrastomvang bleek minimaal 50 telt en een maximum van 1200 tellingen zijn. Deze waarden kunnen worden beschouwd als een richtlijn voor andere studies echter optimaal contrast varieert verschilt van onderzoek tot onderzoek afhankelijk tumorlast niveau fluorescent peptide expressieniveaus in cellen, imaging systeemconfiguratie en opname-instellingen.
Figuur 1: F2 eierstokkanker cellen die stabiel uitdrukken mCherry fluorescentie. (A) image Fase; (B) image fluorescentie; (C) overlay van A en B. Merk op dat 100% van cellen brengen de fluorescentie reporter.
s.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 2: Intra-uteriene injectie van eierstokkankercellen. (A) verdoving wordt continu toegediend via een neuskegel; (BE) huid wordt ingesneden te lokaliseren en klem de baarmoeder hoorn; (F) kankercellen langzaam geïnjecteerd in het lumen van de baarmoeder.
Figuur 3: (A) 2D-beeldvorming met een temperatuur geregelde en nauwe circuit geventileerd transparante dier lade binnen de beeldvorming kamer; (B, C) lade is voorzien van neus kegels om anesthesie te leveren en kan maximaal vijf muizen.
<strong> Figuur 4: Representatieve raampanelen uit de analyse software te helpen bij gegevensanalyse. Zie tekst voor uitleg.
Figuur 5: Detectie van mCherry fluorescentie gecolokaliseerd met X-ray in longitudinale beeldvormingssequentie. Drie muizen met ip tumor worden gevolgd door de tijd om ip progressie van de tumor te bepalen. Merk op dat tumorgroei kan variëren. Figuur is een representatief beeld van 3 muizen met verschillende tarieven van de progressie van de tumor en dus wisselend last van de tumor door de tijd.
Figuur 6: Correlatie tussen ip tumorbelasting (bovenste paneel) en fluorescentie / X-ray overlay image (onderste paneel). Ongeveer 32 dagen na de injectie van de F2-mCherry eierstokkanker cellen, 2D-beeldvorming wordt uitgevoerd en muizen opgeofferd om werkelijke tumorbelasting correleren met de verworven afbeelding. Rode pijlen wijzen naar tumorbelasting.
Figuur 7: Rotation datasets waardoor multi-angle beeldvorming en detectie van tumoren in Controle (bovenste paneel), paclitaxel behandeld (middelste paneel), en recidiverende muizen (onderste paneel). Figuur toont beeld van een enkele muis per paneel als het wordt gedraaid met behulp van het MARS-systeem. Merk op dat zelfs in controle muizen met grote tumorlast, tumorgrootte te onderschatten afhankelijk van de hoek van de opname uit.
Discussion
We beschrijven een protocol om een ip menselijke eierstokkanker diermodel dat het klinische profiel waargenomen bij patiënten nabootst vestigen. Verder beschrijven we het gebruik van een dier rotatie-inrichting die de gevoeligheid beperking van 2D imaging adressen. Tezamen kunnen deze technieken dienen als platforms om nieuwe verbindingen die chemoresistent terugkerende eierstokkanker kunnen richten ontdekken. Bovendien kunnen dergelijke model worden gebruikt om de biologie van kanker recidief en progressie begrijpen.
Door zijn retroperitoneale locatie, in een vroeg stadium ip eierstokkanker xenograften zijn bijna onmogelijk te detecteren door fysiek onderzoek van de muis. In de meeste gevallen, wanneer de ziekte kan worden gepalpeerd, de tumorlast reeds aanzienlijk en derhalve beperkt de therapie-effect. Het gebruik van fluorescent gelabelde cellen ons toelaat om de oprichting van ip tumor te evalueren in real time en dus het identificeren van de optimale tijd om te beginnen met tehandeling. Op soortgelijke wijze, fluorescent gelabelde xenotransplantaten laten volgen van respons op behandeling. Opgemerkt-echter dat ip tumoren dieper dan 1 cm zijn meestal niet detecteerbaar ongeacht het reportersysteem.
Het gebruik van menselijke eierstokkanker stamcellen 14,15,17,22 genereert xenograften dat het klinische profiel waargenomen bij patiënten na te bootsen. Als een primaire ziekte, het model reageert op Paclitaxel maar stopzetting van de behandeling uiteindelijk tot chemoresistent terugkerende ziekte. Introductie van de cellen door de baarmoederhoorns op de dichtheid opgegeven in het Protocol resulteert meestal in ovariële tumoren binnen 10 dagen met een paar peritoneale implantaten, en dus bootst een vroeg stadium van de ziekte. Het gebruik van fluorescent gelabelde cellen ons toelaat om de oprichting van ip tumor te evalueren in real-time en dus het identificeren van de optimale tijd om te beginnen met de behandeling. Op soortgelijke wijze, fluorescent gelabelde xenotransplantaten mogelijk controle of respons op de behandeling. Indien andere vormen van kanker cellijnen worden gebruikt, ovarium- of anders is het mogelijk dat dit profiel niet worden waargenomen. Wanneer SKOV3 wordt bijvoorbeeld gebruikt, is gerapporteerd dat het eerste ip tumoren al resistent 23. Indien echter gemerkt met een reporter zoals fluorescentie, ip, ziekte te volgen in real-time.
Als andere fluorescerende reporter wordt gebruikt, is het belangrijk initiële beeldvorming voeren met een controle (geen tumor) dieren. Dit zal optimalisatie van imaging protocol om de beste achtergrond om de verhouding signaal te bereiken. In onze ervaring, naakt muizen hebben doorgaans een hoge achtergrond wanneer afgebeeld met behulp van de GFP overname instellingen.
Het is belangrijk dat cellen intra-uteriene worden in enkele ophanging de vestiging van tumoren in de uterus voorkomen. Het is ook belangrijk om te voorkomen krassen de baarmoeder epitheellaag, die ook vergemakkelijkt enting van de kankercels in de baarmoeder waardoor aldus een intra-uterine tumor in plaats van een ip ziekte. Bovendien, tijdens data-analyse is het belangrijk om de gammawaarde 1. Dit zorgt ervoor dat de intensiteit van de beelden is lineair en maakt vergelijking tussen afbeeldingen instellen.
Tijdens de overname van MARS beelden, is het belangrijk dat de snowtuben einde van de inklapbare neuskegel is in de neuskegel uitsparing. De neuskegel dient als aanspreekpunt voor de muis en is daarom verplicht voor het verkrijgen van nauwkeurig gekalibreerd hoeken. Voor langere beeldvormingsprotocollen (bijvoorbeeld langer dan 1 uur), injecteer 100 ul steriele zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Dier lichaamstemperatuur te handhaven met warme lucht doorstroomd het systeem bij ongeveer 37 ° C. Een beperking van het MARS systeem is dat slechts één dier kan worden afgebeeld op een tijd met een totale looptijd van ongeveer 1 uur per dier.
Concluderend, beschrijven we het establishment van een diermodel dat nauw bootst eierstokkanker, zowel primair als terugkerende ziekte. Dit model kan worden gebruikt om de doeltreffendheid van nieuwe diagnostische en therapeutische modaliteiten evalueren.
Disclosures
Publicatie vergoedingen voor dit artikel werden gedeeltelijk gesponsord door Bruker Corporation.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NIH subsidies RO1CA118678 en RO1CA127913, door de Sands Family Foundation, en de Discovery naar Program Cure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
