Abstract
Cáncer epitelial de ovario es la neoplasia ginecológica más letal en los Estados Unidos. A pesar de que los pacientes responden inicialmente al tratamiento de referencia actual que consiste en una cirugía de citorreducción y quimioterapia de combinación que consiste en compuestos de platino y taxanos, casi el 90% de los pacientes se repita dentro de unos pocos años. En estos pacientes el desarrollo de la enfermedad quimiorresistente limita la eficacia de los agentes quimioterapéuticos actualmente disponibles y por lo tanto contribuye a la alta mortalidad. Para descubrir nuevas opciones de tratamiento que pueden dirigirse enfermedad recurrente, se requieren modelos animales adecuados que imitan de cerca el perfil clínico de los pacientes con cáncer de ovario recurrente. El reto en el seguimiento (ip) enfermedad intra-peritoneal limita el uso de modelos de IP y por lo tanto por vía subcutánea se establecen la mayoría de los xenoinjertos. Hemos desarrollado una plataforma de imagen óptico sensible que permite la detección y la localización anatómica de la masa tumoral ip. La plataforma incluye la uSE de reporteros ópticas que se extienden desde el rango de luz visible hasta el infrarrojo cercano, que en combinación con rayos X co-registro 2-dimensional puede proporcionar localización anatómica de señales moleculares. La detección se mejoró significativamente por el uso de un sistema de rotación que acciona el animal para múltiples posiciones angulares para formación de imágenes de 360 grados, lo que permite la identificación de tumores que no son visibles en la orientación individual. Esta plataforma proporciona un modelo único para el crecimiento del tumor monitor de forma no invasiva y evaluar la eficacia de nuevas terapias para la prevención o el tratamiento de cáncer de ovario recurrente.
Introduction
Los modelos animales son herramientas indispensables en la investigación de ciencias de la vida. En el cáncer en particular, los datos obtenidos a partir de estudios en animales proporcionan la información necesaria para iniciar el ensayo de nuevas aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en humanos 1-3. Los modelos animales de cánceres sólidos se establecen clásicamente por vía subcutánea, ya que proporciona un medio fácil de medir la carga tumoral y evaluar la eficacia del tratamiento sin tener que sacrificar a los animales. De hecho, los modelos intra-peritoneal (ip) requieren que los animales se sacrificaron para detectar y medir cualquier cambio en el crecimiento del tumor. Sin embargo, para los cánceres de IP tales cáncer de ovario, los modelos ortótropos ofrecen la ventaja de estudiar la enfermedad en su entorno adecuado 4-6. Para un modelo de este tipo que sea de utilidad en la evaluación de la actividad antitumoral, métodos de imagen no invasivos deben ser desarrollados que permiten la cuantificación de la carga tumoral ip en ratones vivos.
Un reto importante en lael uso de modelos animales ip es la dificultad de cuantificar con precisión la carga tumoral mediante un examen físico. La cuantificación precisa de los tumores de propiedad intelectual por lo general requieren que los ratones que ser sacrificado para la disección. Este enfoque requiere el uso de gran número de animales, que se sacrificó a diferentes puntos de tiempo. Además del costo, que introduce alta variabilidad de los datos debido a las variaciones inherentes dentro de cada animal. No invasiva en la imagen óptica in vivo proporciona un enfoque más apropiado para monitorear la carga tumoral ip en ratones vivos.
Varios métodos de imagen no invasivas se utilizan actualmente en la investigación pre-clínica para el seguimiento del crecimiento del tumor y las respuestas terapéuticas. Estos incluyen la tomografía computarizada (CT), ultrasonido (US), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), y formación de imágenes ópticas tales como la fluorescencia y bioluminiscencia 7-12. CT es un proceso de formación de imágenes que combina la transmisión de rayos X y computtecnología er. Se produce una imagen de sección transversal de los haces detectados de fotones de alta energía, que pasa a través del cuerpo con diferente velocidad. Estados Unidos es un tipo de imagen de reflexión, que envía sonidos de alta frecuencia al cuerpo creando ondas sonoras que se reflejan con diferente velocidad dependiendo de la densidad del tejido y reconocido por la computadora para producir una imagen visual de. MRI y PET son modalidades de imágenes de emisión que utilizan energía magnética y las partículas nucleares, respectivamente para producir la imagen. MRI crea un fuerte campo magnético que induce a las células a producir sus propias frecuencias de radio, que se utilizan para crear una imagen mientras PET requiere una cámara sensible para detectar la radiactividad de la etiqueta 7,9,11 2-fluorodeoxy-D-glucosa administrada. Finalmente, la imagen óptica se basa en la detección de la luz de emisión de reporteros o sondas 9,12 bioluminiscentes o fluorescentes.
En este reporte se describe el uso de la fluorescencia, que ofrecealgunas ventajas sobre los otros tipos de modalidades de imágenes. Con imágenes de fluorescencia, las células pueden ser genéticamente modificado para expresar proteínas fluorescentes constantemente sin requerir la adición de un sustrato o sondas a base de ligación, que son requisito para la bioluminiscencia y la resonancia magnética, respectivamente. Reporteros de fluorescencia también expresan típicamente una señal más brillante permitiendo así el uso de un método de detección menos sensible 8,12. Además, con imágenes de fluorescencia, es posible detectar tumores menores de 1 cm, que no es alcanzable con CT 7-9. Finalmente, en contraste con la bioluminiscencia, la señal de fluorescencia no requiere un ambiente aeróbico y por lo tanto la señal no está limitada en entornos hipóxicos, que por lo general se están produciendo en los núcleos de grandes tumores 13.
Sin embargo, como cualquier otra tecnología, métodos de imagen basados fluorescentes tienen sus desventajas. Una de ellas es la incapacidad de la machifotones de baja energía NE-generado para penetrar a una profundidad suficiente. Por lo tanto, para reducir al mínimo la cantidad de fotones de tejidos difusos los animales deben ser reflejados en diferentes ángulos. Se describe un protocolo para establecer un cáncer de ovario ip en ratones desnudos y un enfoque para el seguimiento de tumores ip que proporciona imágenes de los animales a través de toda la rotación. El rotador ángulos el ratón para posiciones específicas y repetibles que disminuye la interferencia tejido que a menudo se produce entre la fuente de luz y el detector. Esto optimiza la visualización de tumores más pequeños que de otra manera se perderían.
Protocol
El Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Yale aprobar todo el trabajo en vivo descrito. La recogida de muestras se realizó con el consentimiento del paciente y aprobado por el Comité de Investigaciones Humanos de la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale.
1. Preparación de células de cáncer de ovario humano
- Antes de preparar las células asegúrese de que todos los materiales necesarios para la inyección intra-uterino se describe a continuación están listos y de fácil acceso. Inyectar la suspensión celular tan pronto como esté listo.
- Crecer células cancerosas fluorescentes etiquetados en la cultura. Utilizamos una generación F2 de CD44 humano + / MyD88 + células de cáncer de ovario epitelial, lo que hemos demostrado previamente para albergar propiedades troncalidad como tumorigenicidad, chemoresistance y alta capacidad para la reparación del tumor 14-19. Estas células se generaron para expresar de forma estable mCherry fluorescencia (F2-mCherry, Fig. 1) utilizando lentivirus produce a partir de la polietilenimina(PEI) protocolo de 20,21.
- En el día de la inyección, recoger las células por tripsinización y se lava una vez con tampón fosfato salino (PBS).
- Determine el recuento de células y suspender las células en 3 x 10 6 células / 50 l de medio de cultivo apropiado. Para las células de cáncer de ovario usamos RPMI 160 con 10% de FBS. Mantener las células en la incubadora hasta que esté listo para inyectar pero no mantener más de 15 min. Esto es suficiente para una inyección de ratón.
2. Inyección Intra-uterino de células de cáncer de ovario humano en ratones desnudos atímicos
Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento requiere la ayuda de una segunda persona. Además, ya que esta es la cirugía supervivencia, utilizar instrumentos quirúrgicos estériles. Este procedimiento de cirugía de supervivencia debe tomar aproximadamente 10 a 15 minutos.
- Anestesiar el ratón usando 2% de isoflurano. De 7 a 8 semanas de edad, los ratones desnudos atímicos se utiliza normalmente.
- Verifique que el animal es completely anestesiado pellizcando la almohadilla del pie con los dedos o pinzas. El animal debe ser completamente no sensible al dolor antes de comenzar la cirugía.
- Coloque la parte ventral del ratón anestesiado sobre una gasa estéril con la cabeza lejos del investigador.
- Aplique una pomada en los ojos con un aplicador de algodón de punta para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Inmediatamente insertar la cabeza en un sistema de cono de la nariz conectado a un vaporizador de isoflurano (Fig. 2A). Esto ofrece la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico.
- Desinfectar la izquierda (o derecha) lado del abdomen utilizando almohadillas con alcohol (Fig. 2B), seguido de yodo a continuación, coloque un paño quirúrgico estéril sobre el lugar de la cirugía.
- Con unas tijeras y fórceps quirúrgicos estériles hacen una incisión en la piel de 1-2 cm en el cuadrante inferior izquierdo del ratón (Fig. 2C).
- Levantar el músculo y hacer una incisión con el fin de alcanzar el peritoneo. <li> diseccionar el músculo oblicuo para exponer la cavidad abdominal.
- Localizar e identificar el cuerno uterino izquierdo (Fig. 2D).
- El uso de pinza hemostática estéril, sujete ambos lados anterior y posterior de la bocina (Fig. 2E). Coloque la abrazadera anterior derecha por debajo de la trompa de Falopio y la abrazadera posterior derecha por encima del cuello del útero.
- Haga que la segunda persona inyectar la suspensión de células. Coloque la aguja que contiene células, a 45 ° de ángulo perpendicular a la bocina (Fig. 2F). Muy inyectar lentamente 50 l de suspensión de células en el lumen del cuerno uterino.
- Retire la aguja y suelte la abrazadera anterior.
- Soltar la abrazadera posterior y reemplazar el cuerno uterino en la cavidad abdominal.
- Cierre del peritoneo usando una sutura absorbible sintética y cerrar la piel utilizando un adhesivo de tejido.
- Retire el ratón desde el cono de la nariz y coloque de nuevo en la jaula. Si es necesario, cambiar la ropa de cama para asegurar una CLEAn jaula después de la cirugía. Asegúrese de que todos los animales están despiertos y activos antes de dejar desatendida.
- Proporcionar Ibuprofeno en 0,11 mg / ml de agua potable para la primera después de la cirugía de 48 horas. Después, sustituir con agua potable regular.
- Nota: que si se utilizan ratones desnudos atímicos y la piel se cierra con adhesivo tisular en lugar de suturas, no es necesario separar los ratones después de la cirugía. Ratones SCID son más agresivos y pueden tener que ser separados.
- Vigilar de cerca el sitio de la incisión para una posible infección debido a la herida abierta.
3. La detección de cáncer de ovario en etapa intra-peritoneal precoz Live En Vivo Imaging
Determinar la presencia de la enfermedad ip intra-peritoneal por vivo de imágenes in vivo. Un sistema de rotación Animal Multimodal (MARS) se utiliza en este protocolo.
- Acceder al software de captura de MARS desde el software de MI. Este módulo ofrececontrol coordinado de la MARS capturar ajustes al tiempo de aprovechar las capacidades de captura y análisis del sistema de formación de imágenes. Optimizar los ajustes de captura individuales para cada modalidad de formación de imágenes utilizando una visión única antes de desarrollar el protocolo de rotación en el paso 3.4.
- De entrada predeterminado los valores de captura. Para la captura de fluorescencia, utilice 10 segundos de exposición, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV de 120 mm, por ejemplo: 550 nm, Em: 600 nm ajuste de captura de filtro. Para la captura de rayos X, utilizar una exposición de 10 seg, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm de Al configuración de captura de filtro.
- Guarde los parámetros en el paso 3.2 como archivos de sesión individuales.
- Crear un protocolo de secuencia de rotación, seleccione el botón Crear / Editar Protocolos desde la ventana adquirir interfaz del sistema.
- Seleccione el archivo de sesión de fluorescencia previamente guardado y guardar como Paso uno. A continuación, seleccione el archivo de sesión de rayos X correspondiente y guardar como Paso Dos.
- Con Paso uno seleccionado, utilice la rotación de laSeries en el menú emergente Captura de imagen Antes de configurar el ángulo inicial, rango, y el incremento deseado para asegurar la visualización perfecta de características. Los valores específicos incluyen un ángulo inicial de -180 grados, una gama de 375 grados, y un incremento de 15 grados.
- Guarde el protocolo y haga clic en el botón Listo para inicializar el MARS y mapear las posiciones del motor paso a paso correspondientes a cada uno de los incrementos angulares.
- Realice la calibración final descrita a continuación para alinear la ventral, dorsal y lateral para el animal específico posicionado en el apoyo animal con grados específicos de rotación para ser utilizado por el protocolo de software.
- Anestesiar al ratón usando una mezcla de aire médico y 2% de isoflurano a un caudal de 2 L / min.
- Iniciar la alineación seleccionando el botón de vista previa desde el menú Acquire para que aparezca en la ficha de los rotadores. Utilice la modalidad de luz reflectante en lugar de múltiples longitudes de onda o el X-ramodalidades Y para agilizar el proceso.
- Seleccione la opción Ratón Cargar y proceder a través de la serie de menús de posicionamiento.
- Asegúrese de que el extremo entubada de la ojiva es plegable en el hueco ojiva y colocar el ratón en la posición tumbada con la cabeza en la ojiva.
- Comience la calibración en la posición de 0 grados con el lado ventral del animal hacia abajo. Utilice los dos botones en el sistema de rotación para posicionar el animal para que aparece centrada en la ventana de vista previa.
- Repita el proceso cuando se le solicite para -180, - 90, 90, y 180 grados posiciones y haga clic en Hecho.
- Ejecutar el protocolo previamente guardada haciendo clic en el botón Ejecutar Protocolo de la ventana principal de adquirir. Durante la ejecución del protocolo, observar una ventana de estado que proporciona actualizaciones de estado en tiempo real de la captura actual, Duración de la exposición, y el paso general Protocolo.
- Montar imágenes individuales en un formato de película usando laSoftware rotación. Utilice los controles de pantalla para ajustar el brillo / contraste, la transparencia, y para establecer el color de visualización de la señal de fluorescencia.
- Exportar la secuencia final de las imágenes en el formato de archivo * .AVI para su presentación.
4. La administración de 1 ° y 2 ° Ronda Quimioterapia
- Tras la detección de tumores ip por MARS, determinar la región de la carga tumoral inicial de interés (ROI) utilizando posicionamiento estándar de dos dimensiones. Esto se realiza en una bandeja animales transparente instalado en el sistema de imágenes como se describe a continuación en la Sección 5. Una vez que se determina ROI inicial, administrar 4 dosis de 12 mg / kg de paclitaxel ip cada tres días. Paclitaxel se obtiene de Hospira Inc. en una formulación lista para ir con Cremaphor como vehículo. Hemos demostrado anteriormente que este régimen de tratamiento tiene actividad anti-tumoral significativa contra el modelo de xenoinjerto en comparación con el control del vehículo e induce la erradicación completa de t detectableumor carga 20. Sin embargo, debido a la naturaleza de la enfermedad, los tumores ip se repiten unos pocos días después del tratamiento termina 20.
- Monitorear la respuesta al tratamiento por imágenes cada 3 días utilizando posicionamiento estándar de dos dimensiones.
- Después de la cuarta dosis de Paclitaxel, clasificar los ratones como tener respuesta completa (ROI menos de 2000), respuesta parcial (hasta 35% de disminución de la ROI inicial obtenida en la etapa 4.1, enfermedad estable (hasta 50% de aumento de la ROI inicial ), o la progresión con el tratamiento (aumento de más del 50% de ROI inicial) basándose en la señal fluorescente observada.
- Para los ratones con respuesta completa, vigilar la recurrencia por imágenes cada 3 días. Una vez que la recurrencia se observó (ROI = a ROI inicial en el paso 4.1), volver a iniciar la segunda ronda de paclitaxel como se describe en 4.1.
- En ratones con enfermedad parcial, enfermedad estable, o los que progresó con el tratamiento, re-iniciar segunda ronda de Paclitaxel 3 días después de la dosis 4ºde paclitaxel. Del mismo modo, estos imagen cada tres días.
5. Seguimiento de Respuesta al Tratamiento Utilizando Posicionamiento Estándar bidimensional
- Anestesiar a los ratones para formar una imagen utilizando una mezcla de aire médico y 2% de isoflurano a un caudal de 2 L / min.
- Coloque la cabeza de los ratones anestesiados en nosecones individuales en la bandeja de animales transparente dentro de la cámara de imágenes (Fig. 3).
- Entrada de los parámetros de exposición predeterminados para fluorescencia (10 segundos de exposición, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm) y rayos X (exposición de 20 s, 2 x 2 binning, f-stop 2.8, FOV de 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm de Al filtro).
- Haga clic Expose para capturar tanto imágenes en secuencia.
- Abrir las imágenes en el software de Bruker MI para la inspección visual y la región de análisis de interés.
6. Imagen de la superposición y Análisis
Para proporcionar una comparación válida para boº análisis visual y cuantitativo de la imagen supuesto proceso de secuencia de tiempo de todas las imágenes de primer plano y de fondo de manera similar.
- Abra tanto la imagen en primer plano (es decir, la fluorescencia) y la imagen de fondo en el software y seleccione la función de baldosas en el menú Ventana en la parte superior (Fig. 4A).
- Para procesar la imagen en primer plano; abra la ficha de la pantalla de imagen en la barra superior (Fig. 4A, flecha roja) y establecer los valores min / max a 260 y 5.000, respectivamente (Fig. 4A, flecha azul)
Nota: Rango de la pantalla de imagen difiere de un estudio a otro en función de las intensidades de señal de fluorescencia capturados en imágenes. Las imágenes deben ser contrastadas con un mínimo / máximo que se mostrará masas tumorales, que aun no mostramos fondo de autofluorescencia del animal. - Siguiente abierta Auto-ROI Tab desde el panel de navegación de la izquierda (Fig. 4B, flecha roja) y seleccione el Nuevo Juego de retorno de la inversión en el menú (Fig. 4C, un rojorrow). Ajuste la configuración para utilizar el algoritmo de umbral en 630 niveles de escala de grises y anule la selección de Restringir tamaño máximo retorno de la inversión para asegurar que todos los potenciales se registran de (Fig. 4C).
Nota: Los valores de umbral pueden diferir de un estudio a otro, dependiendo de la intensidad de señal de fluorescencia capturados en imágenes. Imágenes thresholded para cuantificar la señal de masas tumorales aún no medir la señal de fondo de autofluorescencia del animal. - Desde el interior de la pantalla de la ventana de imagen, seleccione la función Máscara. Ahora sólo se mostrará el área correspondiente a los píxeles que tienen valores iguales o superiores al valor umbral de 630 niveles de escala de grises.
- Para ver los resultados cuantitativos seleccione la pestaña Análisis de la barra de menú superior y seleccione la pestaña de la pantalla (Fig. 4D, flechas rojas).
- En el menú Display, seleccione el número de serie, la suma, la media, y la zona casillas de verificación y haga clic en Aceptar.
- Guarda la imagen por lo que los valores pueden ser exportado por una vez se procesan todas las imágenes de fluorescencia.
- A continuación, poner de relieve la imagen de rayos X y otra vez abrir la pantalla de imagen de la barra de menú superior. Establezca los valores de mínimo, máximo y gamma para dar la mejor representación visual del esqueleto de ratón.
Nota: Puesto que ninguna cuantificación se realiza en las imágenes de rayos X cada imagen de rayos X individuo de la secuencia de tiempo puede ser procesada (es decir, mínimo, máximo y los valores gamma) para producir la mejor representación en busca de ese conjunto de datos. - Una vez más la imagen de rayos X con resaltado seleccione la casilla de verificación de superposición y seleccione el nombre del archivo de imagen de fluorescencia correspondiente en el menú desplegable (Fig. 4E) hacia abajo.
- Para extraer la salida superpuesto, seleccione la ficha Anotaciones en el menú de navegación (Fig. 4B, flecha azul) a la izquierda. Seleccione fichas correspondientes añadir cualquier dato o texto adicionales y por último añadir la barra de escala de intensidad por lo que los datos de intensidad de fluorescencia se pueden determinar rápidamente de la imedad.
- Una vez que las anotaciones se completan más destacado de todos los objetos de la página Anotaciones y seleccione Copiar en el menú Editar en la parte superior y pegar los datos de las imágenes superpuestas en el archivo apropiado (por ejemplo, Word, PowerPoint, y / o Photoshop) para la visualización.
- Repita los pasos 6.1- 6.11 para todos los pares de fluorescencia de rayos X y las imágenes de la secuencia. Asegúrese de seguros todas las imágenes antes de cerrarlos.
- Para la cuantificación final de abrir todas las imágenes de fluorescencia a la vez y seleccione Tile en el menú de la ventana a lo largo de la parte superior.
- A continuación, seleccione los documentos de exportación abiertos a ver los datos.
Nota: En ausencia de programa de Excel, anule la selección de la ficha. MI generará un texto delimitado por tabuladores (es decir, .txt) que se pueden transferir a un ordenador apropiado para su posterior análisis.
Representative Results
Imágenes en vivo no invasiva permite la monitorización de la progresión del tumor ip de los mismos ratones a través del tiempo. Inyección intrauterina de las células de ovario F2-etiquetados mCherry cáncer utilizando el protocolo descrito genera tumores visibles ip en el día 5 y carcinomatosis al día 32 (Fig. 5). La Figura 6 muestra la correlación de las imágenes obtenidas con carcinomatosis observado después de sacrificar los ratones .
Imaging utilizando MARS permite la detección de tumores de propiedad intelectual que de otra manera se perderían si la imagen se adquiere a partir de un solo plano individual. Figura 7 (panel superior) muestra que, incluso en los ratones de control con carga tumoral significativa, el tamaño del tumor puede ser subestimada en función del ángulo la imagen fue tomada de. La capacidad de asegurar que la masa tumoral no es olvidada o subestimada es aún más importante en la conclusión de 1ª ronda de quimioterapia cuando los animales se clasifican ya sea como un responden completaer, respuesta parcial o no respondedor (Fig. 7 panel central). Del mismo modo, durante el tratamiento de mantenimiento es de suma importancia para detectar tumores muy pequeños recurrentes para designar adecuadamente días hasta la recurrencia, que define el intervalo libre de progresión (Fig. 7 panel central).
La evaluación cuantitativa de la carga tumoral se optimiza a través de la rotación de los animales. La rotación del animal para ángulos que reduzcan al mínimo la excitación profundidad y luz de emisión viaja a través permita la captura más precisa de los fotones de la fluorescencia, que es indicativo de la cantidad de las células tumorales y por lo tanto la carga tumoral. Por lo tanto, la cuantificación está optimizado para tumores específicos en el animal, dependiendo de su posición en la secuencia de rotación.
En la presentación de las imágenes de los conjuntos de datos de rotación, es importante asignar las imágenes de un min / rango de contraste de imagen máximo que se mostrará de manera efectiva todas las masas tumorales, permitiendo al mismo tiempo visu al delineación de masas tumorales individuales. Para este estudio, rango de contraste ideales resultó ser un mínimo de 50 cargos y un máximo de 1.200 cuentas. Estos valores pueden ser vistos como una guía para otros estudios, sin embargo, los rangos óptimos de contraste serán diferentes a partir de un estudio a otro dependiendo del nivel de carga del tumor, los niveles de expresión de péptidos fluorescentes en las células, la configuración del sistema de formación de imágenes, y los ajustes de captura.
Figura 1: las células de cáncer de ovario F2 de forma estable expresan mCherry fluorescencia. (A) Imagen de fase; (B) Imagen de fluorescencia; (C) de superposición de A y B. Obsérvese que 100% de las células expresan el reportero de fluorescencia.
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Figura 2: inyección intra-uterino de células de cáncer de ovario. (A) la anestesia se administra continuamente a través de un cono de la nariz; (BE) de la piel se realiza una incisión para localizar y sujetar el cuerno uterino; (F) células de cáncer se inyectan lentamente en el lumen del útero.
Figura 3: (A) de formación de imágenes en 2D con una temperatura controlada y circuito cerrado ventilado bandeja de animales transparente dentro de la cámara de formación de imágenes; (B, C) de la bandeja está equipado con conos de punta para ofrecer la anestesia y con capacidad para cinco ratones.
<> Figura 4 fuertes: Representante paneles de ventanas tomadas desde el software de análisis para ayudar en el análisis de datos. Por favor, ver explicación en el texto.
Figura 5: Detección de fluorescencia mCherry co-localizada con rayos X en la secuencia de imágenes longitudinal. Tres ratones con tumor ip son seguidos a través del tiempo para evaluar la progresión del tumor ip. Tenga en cuenta que la progresión del tumor puede variar. La figura es una imagen representativa de 3 ratones con diferentes tasas de progresión del tumor y por lo tanto variando la carga tumoral a través del tiempo.
Figura 6: Correlación entre la carga tumoral ip (panel superior) y superposición / fluorescencia de rayos X image (panel inferior). Cerca de 32 días después de la inyección de células de cáncer de ovario F2-mCherry, 2D de imágenes se lleva a cabo y los ratones se sacrificó para correlacionar la carga tumoral real con la imagen adquirida. Las flechas rojas indican la carga tumoral.
Conjuntos de datos que permiten la rotación de imágenes multi-ángulo y la detección de tumores en Control (panel superior), Paclitaxel tratado (panel central), y los ratones recurrente (panel inferior): la figura 7. La figura muestra la imagen de un solo ratón por panel, ya que se hace girar mediante el sistema MARS. Tenga en cuenta que incluso en los ratones de control con carga tumoral significativa, el tamaño del tumor puede ser subestimada en función del ángulo de la imagen fue tomada de.
Discussion
Se describe un protocolo para establecer un modelo animal de cáncer de ovario humano ip que imita el perfil clínico observado en los pacientes. Además, se describe el uso de un dispositivo de rotación animal que se refiere a la limitación de la sensibilidad de las imágenes 2D. Tomados en conjunto, estas técnicas pueden servir como plataformas para descubrir nuevos compuestos que pueden dirigirse cáncer de ovario recurrente quimiorresistentes. Además, dicho modelo se puede utilizar para comprender la biología de recurrencia y progresión del cáncer.
Debido a su localización retroperitoneal, en etapa temprana ip xenoinjertos de cáncer de ovario son casi imposibles de detectar mediante el examen físico el ratón. En la mayoría de los casos, una vez que la enfermedad se puede palpar, la carga tumoral ya es significativo y por lo tanto limita la evaluación de la eficacia del tratamiento. El uso de células marcadas fluorescentemente nos permite evaluar la fijación de tumor ip en tiempo real y por lo tanto identificar el momento óptimo para comenzar tratamiento. De manera similar, los xenoinjertos marcados con fluorescencia permiten el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Cabe señalar sin embargo, que-ip tumores más profundos de 1 cm típicamente no son detectables independientemente del sistema reportero.
El uso de células madre humanas de cáncer de ovario 14,15,17,22 genera xenoinjertos que imitan el perfil clínico observado en pacientes. Como una enfermedad primaria, el modelo es sensible a Paclitaxel pero la interrupción del tratamiento con el tiempo conduce a la enfermedad recurrente quimiorresistente. La introducción de las células a través de los cuernos uterinos en la densidad especificada en la sección Protocolo por lo general resulta en tumores ováricos dentro de 10 días con un par de implantes peritoneales, y por lo tanto imita la enfermedad en estadio temprano. El uso de células marcadas fluorescentemente nos permite evaluar la fijación de tumor ip en tiempo real y por lo tanto identificar el momento óptimo para comenzar el tratamiento. De manera similar, los xenoinjertos marcados con fluorescencia permiten el seguimiento of respuesta al tratamiento. Si se utilizan otros tipos de líneas celulares de cáncer, de ovario o de otra manera, es posible que este perfil no se puede observar. Cuando SKOV3 se utiliza, por ejemplo, se ha informado de que los tumores iniciales IP ya son resistentes 23. Sin embargo, si marcado con un informador tal como fluorescencia, ip, la enfermedad se puede seguir en tiempo real.
Si se utiliza otro indicador fluorescente, es importante para realizar las imágenes inicial con un control (sin tumor) animal. Esto permitirá la optimización del protocolo de imagen para lograr el mejor fondo para señalar la relación. En nuestra experiencia, los ratones desnudos suelen tener alta de fondo cuando fotografiado usando los ajustes de adquisición de las buenas prácticas agrarias.
Es importante que las células inyectadas intrauterino están en suspensión única para evitar el establecimiento de los tumores en el útero. También es importante para evitar rayar la capa epitelial del útero, lo que también facilita el injerto de la célula cancerosas en el útero produciendo así un tumor intra-uterino en lugar de una enfermedad ip. Además, durante el análisis de datos, es importante para establecer el valor gamma a 1. Esto asegura que la intensidad de las imágenes es lineal y permite la comparación entre las imágenes.
Durante la adquisición de imágenes de Marte, es importante asegurarse de que el extremo entubado de la ojiva es plegable en el rebaje ojiva. La ojiva sirve como un punto de contacto para el ratón, por lo que se requiere para la obtención de ángulos calibrados con precisión. Para los protocolos de formación de imágenes más largos (es decir, más de 1 hora), se inyecta por vía subcutánea 100 l de solución salina estéril para ayudar a prevenir la deshidratación. La temperatura del cuerpo animal debe ser mantenida usando aire caliente fluyó a través del sistema a aproximadamente 37 ° C. Una limitación del sistema MARS es que sólo un animal se pueden obtener imágenes a la vez con un tiempo total de aproximadamente 1 hora por animal.
En conclusión, se describe la establishment de un modelo animal que imita estrechamente el cáncer de ovario, tanto la enfermedad primaria y recurrente. Este modelo se puede utilizar para evaluar la eficacia de las modalidades de diagnóstico o terapéuticos.
Disclosures
Tasas de publicación de este artículo fueron parcialmente patrocinado por Bruker Corporation.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH RO1CA118678 y RO1CA127913, por la Fundación de la Familia Sands, y el descubrimiento para curar Programa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
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