Abstract
Epitelyal over kanseri ABD'de en ölümcül jinekolojik kanseridir. Hastalar başlangıçta tümör rezeksiyon cerrahisi sonrasında platin ve taksan bileşiklerinden oluşan kombinasyon kemoterapi oluşan bakım mevcut standart yanıt vermekle birlikte, hastaların neredeyse% 90'ı birkaç yıl içinde tekrarlar. Bu hastalarda Kemoterapiye hastalığının gelişimi mevcut kemoterapi maddelerinin etkinliğini sınırlar ve dolayısıyla, yüksek ölüm katkıda bulunur. Nüks hedefleyebilir yeni bir tedavi seçeneklerini keşfetmek için, yakından tekrarlayan yumurtalık kanseri olan hastaların klinik profilini taklit uygun hayvan modelleri gereklidir. Intra-peritoneal (ip) olarak hastalığının izlenmesi karşılaşılan zorluk IP modelleri ve bu nedenle en çok ksenogrefleri kurulan deri altından kullanımını sınırlamaktadır. Biz algılama ve ip tümör kitlesinin anatomik yerini sağlayan bir hassas optik görüntüleme platformu geliştirdi. Platform u içerir2-boyutlu X-ışını ko-kayıt ile birlikte moleküler sinyallerin anatomik konumu sağlayabilir yakın kızılötesi, görünür ışık aralığında, uzanan optik gazetecilere se. Algılama önemli ölçüde tek bir oryantasyonda görünmez tümörlerin tanımlanmasına izin veren, 360 derece görüntüleme için çok sayıda açısal konumlara hayvan sağlayan bir dönme sistemi sayesinde geliştirilmiştir. Bu platform, invasiv olmayan bir monitör tümör büyümesi için benzersiz bir modeli sağlar ve önlenmesi veya tekrarlayan yumurtalık kanseri tedavisi için yeni tedavilerin etkisini değerlendirmek.
Introduction
Hayvan modelleri yaşam bilim araştırma vazgeçilmez araçlardır. Kanserinde, özellikle hayvan çalışmalarından elde edilen veriler insanlarda 1-3 yeni teşhise yönelik veya terapötik uygulamaları test başlatmak için gerekli olan bilgi sağlar. Bu hayvanlar kurban gerek kalmadan tedavi etkinliğini tümör yükünü ölçmek ve değerlendirmek için kolay bir yol sağlar gibi katı kanserler için hayvan modelleri klasik deri altına kurulur. Nitekim, intra-peritoneal (ip) modelleri hayvanlar tespit ve tümör büyümesinde herhangi bir değişiklik ölçmek için kurban gerektirir. Ancak, IP kanser, yumurtalık kanseri için ortotrop modelleri bunun kendi uygun ortamı 4-6 hastalık okuyan bir avantaj sunmaktadır. Bu tür bir model, anti-tümör aktivitesinin değerlendirilmesinde yararlı olması için, invazif olmayan görüntüleme yöntemleri canlı farelerde IP tümör yükü kantifikasyonuna izin veren bu geliştirilmesi gerekmektedir.
Önemli zorlukIP hayvan modellerinin kullanımı kesin fiziksel muayene ile tümör yükü miktarının zorluktur. Ip tümörlerin doğru ölçümü genellikle diseksiyon için feda edilecek fareler gerektirir. Bu yaklaşım, farklı zaman noktalarında feda edilecek hayvanların çok yüksek sayıda, kullanımını gerektirir. Maliyetine ek olarak, bağlı her bir hayvanda doğal varyasyon için yüksek veri çeşitliliklerin. Vivo optik görüntüleme non-invaziv canlı farelerde ip tümör yükünü izlemek için daha uygun bir yaklaşım sağlar.
Invazif olmayan birkaç görüntüleme yöntemleri şu anda, tümör büyümesi ve terapötik tepkilerin izlenmesi için klinik öncesi araştırmalarda kullanılır. Bunlar floresan ve biyolüminesensin 7-12 olarak bilgisayarlı tomografi (BT), ultrason (US), manyetik rezonans görüntüleme (MRG), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve optik görüntüleme sayılabilir. CT X-ray ve Comput birleştiren bir iletim görüntüleme sürecier teknoloji. Farklı hız ile gövdeden geçer, yüksek enerjili foton, bir tespit kirişleri enine kesit görüntü üretir. ABD yüksek frekanslı farklı hız doku yoğunluğuna bağlı olarak ve görsel görüntü üretmek için bilgisayar tarafından tanınan yansıtılmıştır vücut yaratmak ses dalgaları sesleri gönderir yansıma görüntü, bir türüdür. MR ve PET görüntü üretmek için sırasıyla, manyetik enerji ve nükleer parçacıkları kullanabilirsiniz emisyon görüntüleme yöntemleridir. PET idare etiketli 2-fluorodeoxy-D-glikoz 7,9,11 radyoaktivite tespit duyarlı bir kamera gerekir iken MRG bir görüntü oluşturmak için kullanılan kendi radyo frekanslarını üretmek için hücreleri uyarmaktadır güçlü bir manyetik alan oluşturur. Son olarak, optik görüntüleme biyolojik olarak ışık veren veya floresanlı bir muhabir veya sonda 9,12 emisyon ışığın saptanmasına dayanır.
Bu raporda, sağlamadığı, floresan kullanımını tarif edergörüntüleme yöntemlerinin diğer türleri üzerinde birkaç avantajları. Floresan görüntüleme ile, hücreler sürekli olarak sırasıyla biyoluminesans ve manyetik rezonans görüntüleme için gerekli olan, bir alt-tabaka ya da bağlanmanın dayalı sondalar, eklenmesini gerektirmeden floresan proteinleri ifade etmek için genetik olarak tasarlanmış olabilir. Floresan muhabir ayrıca tipik olarak, böylece, daha az hassas bir algılama yöntemi 8,12 kullanımına olanak sağlayan daha parlak bir sinyali ifade eder. Buna ek olarak, flüoresan görüntüleme ile, bu BT 7-9 elde edilmesi mümkün olmayan bir 1 cm, daha küçük tümörleri tespit etmek mümkündür. Son olarak, biyolüminesans aksine, floresans sinyali aerobik bir ortam gerekli değildir ve bu nedenle, genellikle sinyal, büyük tümörlerde 13 çekirdeklerinde olarak oluşan hipoksik ortamda, sınırlı değildir.
Ancak, herhangi bir başka bir teknoloji olarak, flüoresan bazlı görüntüleme yöntemleri de dezavantajları vardır. Biri machi yetersizlikNE-üretilen düşük enerjili fotonlar yeterli bir derinliğe kadar nüfuz. Böylece hayvanlar, farklı açılarda görüntülü olmalıdır dağıtılmış doku fotonların miktarını en aza indirmek için. Biz çıplak farelerde bir ip yumurtalık kanseri ve rotasyonu yoluyla bütün hayvan görüntüleme sağlar ip tümör takibi için bir yaklaşım kurmak için bir protokol açıklar. Döndürücü, genellikle, ışık kaynağı ve detektör arasındaki meydana gelen doku girişimi azaltmak özel ve tekrarlanabilir konumlara fare açılar oluştururlar. Bu aksi cevapsız olabilir küçük tümörlerin görselleştirme optimize eder.
Protocol
Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi açıklanan tüm in vivo çalışmalarını onaylamak. Numune toplama hasta rızası ile gerçekleştirilmiştir ve Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi İnsan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylandı.
İnsan Yumurtalık Kanseri Hücrelerinin hazırlanması 1.
- Hazırlanması önce hücreler, aşağıda tarif edilen rahim içi enjeksiyon için gerekli tüm malzeme hazır ve erişimi kolay olduğundan emin olun. Hazır olduğunda en kısa sürede hücre süspansiyonu enjekte edilir.
- Kültürde-floresan etiketli kanser hücreleri büyümek. Biz daha önce böyle tümörgenezine, kemoterapi ve tümör onarım 14-19 yüksek kapasite olarak stemness özelliklerini barındırması gösterilen insan CD44 + / MyD88 + over kanseri hücrelerinin, bir F2 nesil kullanın. Bu hücreler, kararlı bir şekilde MCherry floresan ifade etmek için üretilmiştir (F2-MCherry, Şek. 1) lentivirüs polietilenimin elde kullanılarak(PEI) protokolü 20,21.
- Enjeksiyon gününde, tripsinizasyon ile hücrelerin hasat ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkanır.
- Hücre sayısını belirlemek ve 3 x 10 6 hücre / uygun büyüme ortamı 50 ul hücreleri askıya. Yumurtalık kanseri hücreleri için bize% 10 FBS ile RPMI 160 kullanımı. Enjekte hazır olana kadar inkübatör hücreleri tutun ama uzun 15 dakika tutmuyorum. Bu, bir fare enjeksiyon için yeterlidir.
Atimik çıplak farelerde insan yumurtalık kanser hücrelerinin 2. intra-uterin Enjeksiyon
Aşağıdaki yordam, ikinci bir kişiden yardım gerektirdiğini unutmayın. Bu hayatta kalma ameliyat olduğundan Ayrıca, steril cerrahi aletler kullanmayın. Bu hayatta kalma cerrahi işlemdir yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer.
- % 2 izofluran kullanılarak fare anestezisi. 7- ila 8 haftalık atimik çıplak farelere genellikle kullanılır.
- Hayvan Komplet olduğundan emin olunely parmaklarını veya forseps kullanarak ayak pedi kısma anesteziye. Hayvan ameliyatı başlamadan önce ağrı tamamen non-duyarlı olmalıdır.
- Uzakta araştırmacıdan kafa ile steril bir gazlı bez anestezi fare ventral yüzü yukarı yerleştirin.
- Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için bir pamuk uçlu aplikatör ile gözlerinize merhem sürün.
- Hemen izofluran buharlaştırıcı (Şek. 2A) bağlı bir burun konisi sisteminde sokulur. Bu, cerrahi prosedür boyunca anestezi sağlar.
- Sonra cerrahi sitesi üzerinden steril cerrahi örtü koyun sol dezenfekte (veya sağ) iyot ardından karın kullanarak alkol pedleri (Şekil. 2B) yan.
- Kullanımı steril cerrahi makas ve forseps fare (Res. 2C) sol alt kadranda 1-2 cm'lik cilt kesi yapmak.
- Kas kaldırın ve periton ulaşmak için bir kesi yapmak. <li> karın boşluğuna maruz eğik kas ayır.
- Bulun ve sol uterin boynuz (Şekil. 2B) tanımlamak.
- Steril hemostatın kullanarak, boynuz (Şekil. 2E) her iki anterior ve posterior taraftan kelepçe. Sağ fallop tüpünün altında ön kelepçesini ve sağ serviks yukarıda arka kelepçe yerleştirin.
- İkinci kişi, hücre süspansiyonu enjekte var. Boynuz (Şekil. 2F) dik 45 ° açıyla hücreleri içeren iğne, yerleştirin. Çok yavaş uterin boynuzu lümenine hücre süspansiyonu 50 ul enjekte edilir.
- İğneyi çıkarın ve ön kelepçesini.
- Posterior kelepçesini karın boşluğunda uterus boynuzu değiştirin.
- Bir sentetik emilebilir sütür kullanılarak periton kapatın ve bir doku yapıştırıcı kullanılarak cilt kapatın.
- Burun konisi gelen fareyi çıkarın ve kafesine geri koyun. Eğer gerekli ise, bir temizleme sağlamak için yatak takımları değiştirmekAmeliyattan sonra n kafes. Tüm hayvanlar bırakıp gitmeden önce uyanık ve aktif olduğundan emin olun.
- İlk 48 saat sonra ameliyat için içme suyu ve 0.11 mg / ml'de İbuprofen sağlar. Daha sonra, düzenli içme suyu ile değiştirin.
- Not: atimik çıplak fareler kullanılır ve deri, dikiş yerine doku yapışkan kullanarak kapalı ise, ameliyattan sonra fareler ayırmak gerekli değildir. SCID fareleri, daha agresif ve ayrılabilir gerekebilir.
- Yakından bağlı açık yara olası enfeksiyon için kesi sitesini izlemek.
Canlı İn Vivo Görüntüleme Erken Evre İçi periton Yumurtalık Kanseri 3. Algılama
In vivo görüntüleme canlı intra-peritoneal IP hastalık varlığını belirlemek. Bir Modlu Hayvan Rotasyon Sistemi (MARS) Bu protokolde kullanılır.
- MI yazılım içinde MARS yakalama yazılımına erişmek. Bu modül sağlargörüntüleme sisteminin yakalama ve analiz yetenekleri yararlanarak iken MARS koordineli denetim ayarlarını yakalamak. Adım 3.4 rotasyon protokolü geliştirmek için önce bir tek bakış görüntüleme kullanarak her yöntemi için ayrı çekim ayarlarını optimize eder.
- Giriş yakalama değerleri önceden belirlenmiş. 550 nm, em: 600 nm filtre yakalama ayar floresan yakalamak için, 10 sn pozlama, 2 x 2 binning kullanın, 2.8, FOV 120 mm, eski f-stop. X-ışını çekimi için, bir 10 sn pozlama kullanmak, 2 x 2 binning, 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0.4 mm Al filtre yakalama ayarını f-stop.
- Tek oturum dosyaları olarak adım 3.2 parametreleri kaydedin.
- Sistemi arabirimi edinmekte penceresinden Oluştur / Düzenle Protokoller düğmesini seçerek bir rotasyon sıra protokol oluşturmak.
- Önceden kaydedilmiş bir floresan oturumu dosyayı seçin ve Adım Bir olarak kaydedin. Sonra, gelen X-ışını oturum dosyasını seçin ve Adım iki olarak kaydedin.
- Adım Bir seçeneği seçildiğinde, Set Rotasyon kullanınÖnce Görüntü Yakalama açılır menüden Serisi özelliklerin sorunsuz görünüm için sağlamak için istenen başlangıç açısı, aralık ve artışını ayarlamak için. Özgül değerler -180 derecelik bir başlangıç açısı 375 derece aralığında ve 15 derece kadar bir artış bulunmaktadır.
- Protokolü kaydedin ve MARS başlatmak ve açı artışlarla her birine karşılık gelen step motor pozisyonları eşleştirmek için Bitti düğmesini tıklatın.
- Yazılım protokolü tarafından kullanılmak üzere dönüş belirli bir derece ile hayvan desteği yerleştirilmiş, belirli bir hayvan için ventral, dorsal ve lateral incelemeler hizalamak için aşağıda tarif edildiği gibi nihai bir kalibrasyon yapın.
- 2 L / dakikalık bir akış hızında tıbbi hava ve% 2 izofluran ile bir karışımını kullanarak fare anestezisi.
- Rotator sekmesini getirmek için Edinme menüsü içinden Önizleme düğmesini seçerek uyum başlayın. Multiwavelength ya da X-ra yerine yansıtıcı ışık modalitesini kullanıny modaliteleri süreci hızlandırmak için.
- Yük Fare seçeneğini seçin ve konumlandırma menülerin dizi devam edin.
- Katlanabilir roket ucu konisi ve tubed sonu roket ucu konisi tatilde emin olun ve roket ucu konisi onun kafası eğilimli yönde fareyi yerleştirin.
- Aşağı bakacak şekilde hayvanın ventral tarafı ile 0 derece pozisyonunda kalibrasyon başlayın. Önizleme penceresinde merkezli görünür, böylece hayvan konumlandırmak için rotasyon sistemi üzerinde iki düğmeyi kullanın.
- 90, 90, ve 180 derece pozisyonları ve Bitti düğmesini tıklatın - -180 için istendiğinde, bu işlemi tekrarlayın.
- Ana edinmekte penceresinden Protokol düğmesini Yürüt tıklayarak önceden kaydedilmiş protokolünü yürütün. Protokolün yürütülmesi sırasında, Güncel Yakalama, Pozlama Süresi ve genel Protokol adım için gerçek zamanlı durum güncellemelerini sağlayan bir durum penceresi gözlemlemek.
- Kullanarak bir film formatında içine tek tek görüntüleri birleştirinRotasyon yazılım. Parlaklık / kontrast, şeffaflığı ayarlamak için, ve floresan sinyali için ekran rengini ayarlamak için Ekran Kontrolleri kullanın.
- Sunum için * .AVI dosyası formatındaki resimlerin nihai diziyi aktarmak.
1. ve 2 nci Yuvarlak Kemoterapi 4. İdaresi
- MARS tarafından ip tümör tespiti takiben, standart iki boyutlu konumlandırma kullanarak faiz (ROI) ilk tümör yükü bölgeyi belirler. Bu ilk YG belirlendikten sonra, 12 mg / kg paklitaksel ip 4 doz her üç günde bir uygulanması, Bölüm 5'te aşağıda tarif edildiği gibi görüntüleme sistemi içinde yerleştirilmiş bir saydam bir hayvan tepsi üzerinde gerçekleştirilir. Paklitaksel vasıta olarak Cremaphor ile hazır-go formülasyonda Hospira Inc.'den elde edilir. Daha önce, bu tedavi rejimi, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında ksenograft modeli karşı kayda değer bir anti-tümör aktivitesine sahip olduğu gösterilmiştir ve tespit t tamamen ortadan kaldırılması indüklerumor yükü 20. Tedavi 20 sona erdikten sonra Fakat, hastalığın doğasına, ip Tümörlerin birkaç gün tekrarlar.
- Standart iki boyutlu konumlandırma kullanarak her 3 günde bir görüntüleme ile tedaviye yanıtın izlenmesi.
- Paklitaksel dördüncü dozdan sonra, (başlangıç ROI% 50 kadar bir artış tam yanıt (İB az 2000), kısmi yanıt (adım 4.1, stabil hastalık elde edilen ilk ROI% 35'e kadar azalma sahip olarak farelerin sınıflandırmak ) veya gözlenen floresan sinyali esasına dayanan bir tedavi (temel YG fazla% 50 artış) ile ilerlemesi.
- Tam yanıt fareler için, her 3 günde bir görüntüleme ile nüks izlemek. Nüks (Adım 4.1 ROI başlangıç ROI =) gözlenir sonra 4.1'de açıklandığı gibi Paklitaksele ikinci turda yeniden başlatmak.
- Kısmi hastalığı, stabil hastalık veya tedavi ile ilerleme olanlar ile farelerde, 3 gün 4. dozdan sonra Paklitaksele ikinci turda yeniden başlatmakPaklitaksele. Benzer şekilde, görüntü bu üç günde.
Standart İki boyutlu Konumlandırma Kullanılması Tedavi 5. İzleme Tepki
- Fareler anestezi 2 L / dakikalık bir akış hızında tıbbi hava ve% 2 izofluran ile bir karışım kullanılarak, görüntülenecek.
- Görüntüleme odasının (Res. 3) içinde şeffaf hayvan tepsiye tek tek nosecones yılında anestezi farelerin başını yerleştirin.
- Giriş floresan için önceden belirlenmiş maruz kalma parametreleri (10 sn pozlama, 2 x 2 binning, FOV 120 mm, eski 2.8 f-stop:, em 550 nm: 600 nm), 2 x 2 binning ve X-ray (20 sn pozlama, 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0.4 mm Al filtresi) f-stop.
- Dizisi hem görüntü yakalamak için Açığa tıklayın.
- Görsel denetim ve faiz analiz bölge için Bruker MI yazılımında görüntüleri açın.
6. Görüntü Bindirme ve Analizi
Bo için geçerli bir karşılaştırma sağlamakTüm plan ve arka plan görüntüleri benzer süre ders görüntü dizisi sürecinin inci görsel ve kantitatif analizi.
- Yazılım ön planda görüntü (yani floresan) ve arka plan görüntüleme hem açın ve üst (Res. 4A) de Pencere menüsünden kiremit işlevi seçin.
- Ön görüntüyü işlemek için; üst bar (Res. 4A, kırmızı ok) Görüntü Ekranı sekmesini açın ve sırasıyla 260 ve 5,000 için min / max değerlerini ayarlamak (Res. 4A, mavi ok)
Not: Resim Görüntüleme aralık görüntüleri yakalanan floresan sinyal yoğunluğu bağlı olarak çalışmadan çalışmaya farklıdır. Görüntüler tümör kitleleri göstermek, henüz hayvanın otofloresansı arkaplan göstermeyecektir bir min / max ile tezat olmalıdır. - Soldaki Navigasyon Paneli (Res. 4B, kırmızı ok) Sonraki açık Auto-ROI Tab ve menüden Yeni ROI Set seçin (Şekil. 4C, kırmızı birrrow). 630 gri tonlama düzeyde Eşik algoritmasını kullanmak için ayarları yapın ve en kaydedilir tüm potansiyel ROI (Res. 4C) sağlamak için boyutu Max kısıtlayın kaldırın.
Not: Eşik ayarları görüntülerde yakalanan floresan sinyal yoğunluğu bağlı olarak çalışmadan çalışmaya farklılık gösterebilir. Görüntüler henüz tümör kitlelerinin sinyali quantitate hayvanın otofloresansı arka fonda sinyali ölçmek değil eşiklenir. - Görüntü Display Window içinde Maskesi işlevini seçin. Şimdi eşit değerleri veya 630 gri tonlama düzeyleri eşik değerini aşan sahip piksel karşılık sadece alan görüntülenir.
- Kantitatif sonuçlar üst menü çubuğu ve seçme ekran sekmesi (Şekil. 4D, kırmızı oklar) Analiz sekmesini seçin görüntülemek için.
- Görüntü menüsünde Seri Numarası, Sum, ortalama, ve Alan onay kutularını seçin ve Tamam 'ı tıklatın.
- Değerler eski olabilir bu yüzden görüntü kaydetmebirlikte taşıdık kez tüm floresan görüntüler işlenir.
- Sonra, X-ray görüntü vurgulayın ve tekrar üst menü çubuğundan Image Display açın. Fare iskeletin iyi görsel temsilini vermek için dakika, max ve gama değerlerini ayarlayın.
Not: niceleme zaman dizisinden her X-ışını görüntü işlenebilir X-ışını görüntü üzerinde gerçekleştirilir yana (örneğin min, maks ve gama değerleri) veri kümesinin en iyi ve en ideal bir numunesi elde etmek için. - Yine X-ray görüntü ile Overlay onay kutusunu seçin ve menüden (Şekil. 4E) açılan gelen floresan görüntü dosyası adı seçin vurgulanır.
- Yerleştirilmiştir çıkışı ayıklamak için, soldaki Gezinti menüsü (Şekil. 4B, mavi ok) Açıklamalar sekmesini seçin. Floresan yoğunluğu verileri hızlı bir şekilde im tespit edilebilir, böylece herhangi bir ek veri veya metin eklemek ve nihayet şiddeti ölçek çubuğu eklemek için uygun sekmeleri seçinyaş.
- Açıklamalar vurguyu ekran için tüm Açıklamalar sayfasında nesneler ve üst Düzen menüsünden seçin kopyalama ve uygun dosyasına Bindirme görüntü verilerini yapıştırmak (örneğin Word, PowerPoint, ve / veya Photoshop) tamamlandıktan sonra.
- Tekrar adımları 6.1- sırayla floresans ve X-ışını görüntü çiftleri için tekrarlanır 6.11. Onları kapatmadan önce güvenli tüm görüntülere emin olun.
- Son kantitatif için aynı anda tüm floresan görüntüleri açın ve üstündeki Pencere menüsünden Tile seçin.
- Sonraki verilerini görüntülemek için İhracat Tüm Açık Belgeler seçeneğini seçin.
Not: Excel programının yokluğunda, sekmesini kaldırın. MI bir sekme ayrılmış metin daha fazla analiz için uygun bir bilgisayara aktarılabilir (yani .txt) dosyası oluşturur.
Representative Results
Non-invaziv canlı görüntüleme süresi sayesinde aynı farelerden ip tümör ilerlemesinin izlenmesine olanak sağlar. Açıklanan protokol kullanılarak MCherry etiketli F2 yumurtalık kanseri hücrelerinin intra-uterin enjeksiyon günde 32 gün 5 ve karsinomatoz görünür IP tümörleri oluşturur (Şek. 5). Şekil 6 fareler telef edildikten sonra gözlemlenen karsinomatozise elde edilen görüntülerin bir korelasyon olduğunu göstermektedir .
MARS kullanarak görüntüleme görüntü sadece tek bir düzlemde elde edilir, aksi takdirde özlenecek ip tümörlerin algılanmasını sağlar. 7 (üst panel) Şekil açısına bağlı olarak bile önemli tümör yükü ile kontrol farelerde tümör boyutu hafife alınabileceğini göstermektedir görüntü alınmıştır. Hayvanlar ya tam cevap olarak kategorize edildiğinde tümör kitlesi cevapsız veya hafife olmadığından emin olmak için yetenek 1. yuvarlak kemoterapi bitiminde daha da önemlidirer, kısmi cevap, ya da olmayan cevap (Res. 7 orta panel). Benzer şekilde, idame tedavisi sırasında düzgün progresyonsuz bir aralık (Res. 7 orta panel) tanımlayan, nüks için gün tayin etmek çok küçük tekrarlayan tümörlerin tespit etmek büyük önem taşımaktadır.
Tümör yükünün kantitatif değerlendirilmesi hayvan rotasyonu yoluyla optimize edilmiştir. Derinlik uyarma en aza indirmek ve emisyon ışık tümör hücrelerinin sayısı ve dolayısıyla tümör yükü göstergesi olan floresan, foton en doğru yakalama sağlayacak dolaşır olacaktır açıları hayvanın dönmesi. Bu nedenle, miktar tayini rotasyon dizisi içinde konumuna bağlı olarak hayvanın belirli tümörler için optimize edilmiştir.
Dönme veri setleri görüntü sunarken, bu visu için izin verirken, etkili tüm tümör kitleleri görüntüler min / max görüntü kontrast aralığını görüntüleri atamak için önemlidir Bireysel tümör kitlelerinin al tarif. Bu çalışma için, ideal bir kontrast aralığı 50 sayıları minimum ve 1200 sayıları maksimum olduğu bulunmuştur. Bu değerler, diğer çalışmalar için bir rehber olarak görülebilir, ancak, optimum kontrast aralıkları tümör yükü düzeyi, hücrelerde floresan peptid ifade düzeyleri, görüntüleme sistemi konfigürasyonu ve yakalama ayarlarına bağlı olarak çalışmadan çalışmaya farklı olacaktır.
Şekil 1: F2 yumurtalık kanseri hücreleri stabil MCherry floresan ifade eder. (A) Faz görüntü; (B) floresan görüntü; A ve B (C) katlamalı hücrelerin% 100 flüoresan raportör ifade unutmayın.
s.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 2: yumurtalık kanseri hücrelerinin intra-uterin enjeksiyonu. (A), anestezi sürekli bir burun hunisi yoluyla tatbik edilir; Cilt bulmak ve uterin boynuz kelepçe kesilir (BE); (F), kanser hücrelerinin rahim lümeni içine yavaş yavaş enjekte edildi.
Şekil 3: sıcaklık kontrollü ve kapalı devre görüntüleme odasının içinde şeffaf hayvan tepsisini havalandırmalı (A) 2D görüntüleme; (B, C) tepsi anestezi sunmak ve beş farelere kadar tutabilir burun konileri ile donatılmıştır.
<strong> Şekil 4: analiz yazılımı alınan Temsilcisi pencere panelleri veri analizinde yardımcı olmak. Açıklama için metne bakınız lütfen.
Şekil 5: MCherry floresan tespiti boyuna görüntüleme sırası X-ray ile co-lokalize. Ip tümörü olan üç fare ip tümör ilerlemesini değerlendirmek için zaman içinde takip edilmektedir. Tümör ilerlemesi değişebilir unutmayın. Şekil farklı tümör ilerlemesi oranları ve dolayısıyla zaman içinde tümör yükünü değişen 3 farelerin temsilcisi resimdir.
Şekil 6: ip tümör yükü (üst panel) ve floresan / X-ışını bindirme ima arasındaki korelasyonge (alt panel). Yaklaşık 32 gün 2D-görüntüleme yapıldı ve fareler elde edilen görüntünün ile gerçek tümör yükünü ilişkilendirmek için kurban edilir, F2-MCherry yumurtalık kanseri hücrelerinin enjeksiyonu sonrası. Kırmızı oklar tümör yükü işaret.
Şekil 7: Çok açılı görüntüleme ve tümörlerin tespit Kontrolü (üst panel) Paklitaksel'e tedavi (orta panel) ve tekrarlayan fareler (alt panel) izin Rotasyon veri setleri. Bu MARS sistemi kullanılarak döndürülür Şekil panelin başına tek bir fare görüntüsünü gösterir. Daha belirgin bir tümör yükü ile kontrol farelerde, tümör boyutu görüntü alınmıştır açısına bağlı olarak göz ardı edilebilir unutmayın.
Discussion
Biz hastalarda gözlenen klinik profilini taklit eden bir ip insan yumurtalık kanseri hayvan modeli oluşturmak için bir protokol açıklar. Buna ek olarak, 2 boyutlu görüntüleme duyarlılığı sınırlama olarak ele alan bir hayvan dönüş cihazının kullanılmasını tarif eder. Birlikte ele alındığında, bu teknikler Kemoterapiye tekrarlayan yumurtalık kanseri hedefleyebilir yeni bileşikler keşfetmek için platform olarak hizmet edebilir. Buna ek olarak, model kanser nüksü ve progresyon biyolojisini anlamak için kullanılabilir.
Nedeniyle retroperitoneal konumu, erken evre ip yumurtalık kanseri ksenograftları fiziksel fareyi inceleyerek tespit etmek neredeyse imkansız. Çoğu durumda, hastalık hissedilebilecek bir kez, bir tümör zaten önemli bir oranda ve bu nedenle tedavi etkinliğinin değerlendirilmesini sınırlar. Floresan etiketli hücrelerin kullanımı gerçek zamanlı ve buna bağlı olarak t başlamak için uygun zamanı tanımlayan IP tümör kurulmasını değerlendirmek için olanak verenreatment. Benzer bir şekilde, floresan-etiketli ksenogrefleri tedaviye yanıt izlenmesini mümkün kılar. Bu işaret-out gerektiğini ancak bu ip daha derine 1 cm bakılmaksızın muhabiri sistemin tipik bir şekilde saptanabilir değildir tümörleri.
Insan yumurtalık kanseri kök hücre 14,15,17,22 kullanılması hastada klinik profilini taklit ksenograftları oluşturur. Birincil bir hastalık olarak, bu model Paklitaksel'e cevap verir, fakat tedavinin kesilmesi sonunda Kemoterapiye tekrarlayan hastalığına yol açar. Protokol bölümünde belirtilen yoğunlukta rahim boynuzları aracılığıyla hücrelerini Tanıtımı genellikle bu nedenle birkaç peritoneal implantları, mimikler ve erken evre hastalık ile 10 gün içinde yumurtalık tümörlerinde sonuçlanır. Floresan işaretli hücrelerin kullanımı, gerçek zamanlı olarak ve dolayısıyla tedaviye başlamak için en uygun zamanı belirleme ip tümörün kurulmasını değerlendirmek için bize izin verir. Benzer bir şekilde, floresan-etiketli ksenogrefleri izleme o sağlartedaviye F yanıtı. Kanser hücre çizgilerinin diğer tür yumurtalık, kullanılan ya da başka şekilde, bu profili gözlenememiştir olanaklıdır. SKOV3 örneğin, kullanıldığı zaman, bu, ilk ip tümörler önceden 23 dirençli olduğu bildirilmiştir. Örneğin floresan, IP gibi bir raportör ile etiketlenir Ancak buna rağmen, hastalık gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.
Diğer floresan haberci kullanıldığı takdirde, bu, bir kontrol (tümör), bir hayvan ile ilk görüntüleme gerçekleştirmek için önemlidir. Bu görüntüleme protokolün optimizasyonu oranını sinyal en iyi arka plan elde etmek için izin verir. GFP Satın alma ayarlarını kullanarak görüntülü zaman bizim deneyim, çıplak fareler genellikle yüksek bir arka plan var.
Bu hücreler, uterus tümör kurulmasını önlemek için tek bir süspansiyon içinde intra-uterin, enjeksiyon önemlidir. Ayrıca, kanser hücresinin naklini kolaylaştırır rahim epitel tabakası, çizilmesini önlemek için de önemlidirrahim s, böylece bir rahim içi tümör yerine IP hastalığı üretilir. Buna ek olarak, veri analizi sırasında, o bu görüntülerin yoğunluğu doğrusal ve görüntülerin karşılaştırılmasını sağlar insures 1. gama değeri ayarlamak için önemlidir.
MARS görüntülerin elde edilmesi sırasında, katlanabilir roket ucu konisi olan tüplere aktarılmıştır ucu roket ucu konisi girinti içinde olduğundan emin olmak için önemlidir. Roket ucu konisi fare için bir irtibat noktası olarak hizmet vermektedir ve bu nedenle hassas bir şekilde kalibre açıları elde etmek için gereklidir. Uzun görüntüleme protokolleri (yani daha uzun 1 saat), dehidratasyon önlemek için steril serum fizyolojik subkutan enjekte 100 ul. Hayvan vücut sıcaklığı, yaklaşık 37 ° C sistemi aracılığıyla akan sıcak hava ile muhafaza edilmelidir. MARS sisteminin bir sınırlaması, sadece bir hayvan, hayvan başına yaklaşık 1 saat bir toplam çalışma süresi olan bir zamanda görüntülü edilebilmesidir.
Sonuç olarak, biz est tarifyakından yumurtalık kanseri, hem primer hem de nüks taklit eden bir hayvan modelinin ablishment. Bu model, yeni teşhise yönelik veya terapötik yöntemlerinin etkinliğinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.
Disclosures
Bu yazı için yayın ücreti kısmen Bruker Corporation tarafından sponsor edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma Programı Cure Sands Aile Vakfı ve Discovery tarafından, NIH hibe RO1CA118678 ve RO1CA127913 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
