Abstract
الكلوي إصابة نقص الأوكسجين ضخه (IRI) هو سبب شائع للإصابة الكلى الحاد (آكي) في المرضى وانسداد تدفق الدم الكلوي أمر لا مفر منه خلال زرع الكلى. نماذج تجريبية أن بدقة وبتكاثر ألخص الكلوي IRI تشكل عاملا حاسما في تشريح الفيزيولوجيا المرضية لآكي وتطوير عوامل علاجية جديدة. قدم هنا هو نموذج الفأر من IRI الكلوي الذي يؤدي في استنساخه آكي. ويتحقق ذلك من خلال نهج خط الوسط البطن لعملية جراحية مع شق واحد مما يتيح كل من استئصال الكلية اليمنى والذي يوفر الأنسجة السيطرة ولقط من عنيق الكلوي الأيسر للحث على نقص الأوكسجين من الكلية اليسرى. من خلال رصد دقيق للموقف المشبك ودرجة حرارة الجسم خلال فترة نقص الأوكسجين هذا النموذج يحقق إصابة الوظيفية والهيكلية استنساخه. الفئران ضحى 24 ساعة بعد الجراحة إثبات فقدان وظائف الكلى مع ارتفاع في مستوى الكرياتينين في مصل الدم أو البلازما وكذلك البنىتلف الكلى تورال مع نخر أنبوبي حاد واضح. يحسن وظائف الكلى وإصابات الأنسجة الحادة يحل خلال 7 أيام التالية IRI الكلوي مثل أن هذا النموذج يمكن أن تستخدم لدراسة التجديد الكلى. وقد استخدمت هذا النموذج من IRI الكلوي لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية والخلوية من آكي فضلا عن تحليل للتجديد الكلوي اللاحقة.
Introduction
نقص الأوكسجين إصابة ضخه (IRI) هو وضع شيوعا من إصابة لأجهزة متعددة بما في ذلك الكلى والقلب والدماغ. الكلوي IRI قد يؤدي إلى إصابة الكلى الحاد (آكي) في المرضى ولا علاج محدد هو متاح. آكي نتيجة IRI لديه المرضية المعقدة التي تنطوي على كل من الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية 1. نموذج تجريبي من الكلى IRI يوفر القدرة على تشريح الخلايا الرئيسية والوسطاء المتورطين في التسبب في آكي فضلا عن تجديد الكلوي اللاحقة التي تستتبعه خلال الأيام اللاحقة. وعلاوة على ذلك من آثار العوامل العلاجية الرواية على عمليات المرض يمكن تقييمها.
الهدف العام للنموذج التجريبي للالكلوي IRI الموصوفة هنا هو للحث على حد سواء وظيفية وهيكلية إصابة حادة في الكلى. وقد استخدمت بعض المحققين النموذج الذي ينطوي على تحريض IRI الثنائية 2. على الرغم من أن نموذج IRI الكلوي الثنائية الاستخدام، ورن من جانب واحدآل IRI نموذج لديه ميزة لاستئصال الكلية اليمنى التي يجري الاضطلاع بها في وقت الجراحة. يخدم الأنسجة استئصال الكلية اليمنى قيمة عن الأنسجة التحكم في الدراسات التي تنطوي على خطوة المعالجة إما أن الحث أو يقمع التعبير عن الجينات أو البروتينات. على سبيل المثال، وقد استخدمنا هذا النموذج لتقييم آثار شروط مسبقة من الهيم arginate (HA) قبل 24 ساعة من الحقن الكلوي IRI 3. وأكد تحريض الناجح لسيتوبروتيكتيفي انزيم الهيم أوكسيجيناز-1-(HO-1) بواسطة HA قبل المعهد الجمهوري الدولي في حق السيطرة استئصال الكلية الأنسجة 4. انخفاض HA الكلوي في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين IRI في جزء عبر آلية تعتمد HO-1. وبالمثل، وقد استخدمنا هذا النموذج في الدراسات نضوب البلاعم لدراسة دور الضامة في الكلى IRI 5. ويمكن استخدام تحليل المناعى للأنسجة استئصال الكلية اليمنى لتأكيد فعالية منهجية الاجتثاث. وبالتالي، يمكن الأنسجة استئصال الكلية اليمنى استخدامها لكلا تأكيد وتحديد مستوى طnduction أو تثبيط جزيء من الفائدة في كل حيوانات التجارب الفردية. وهذا النموذج تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستخدمون المخدرات أو غيرها من المركبات لتعديل التعبير عن الجينات أو البروتينات الخ قبل تحريض الكلوي IRI.
وقد استخدمت دراسات أخرى شقوق الجهة للوصول إلى الكليتين. نموذج الموصوفة هنا يستخدم عملية جراحية في البطن خط الوسط واحد لأداء كل من استئصال الكلية اليمنى وإحداث نقص الأوكسجين ضخه من الكلية اليسرى. ويوفر هذا النهج الجراحية التصور ممتازة من الملعب الجراحية بما في ذلك السويقات الكلوي ويتغير لونها التي تتبع الكلوي عنيق لقط. تجربتنا مع نشر نموذج 4-6 يشير إلى أن الفئران يتعافى سريعا من الجراحة مع قرب معدل البقاء على قيد الحياة بنسبة 100٪.
أخيرا، وتحليل الحركية للنموذج على مدى فترة من 7 أيام إلى أن هذا النموذج يسلك استعادة كل من وظيفة الكلى ووحدة أنبوبي، معانتشار الخلايا أنبوبي كبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي تفرضها الحيوانات (الإجراءات العلمية) لسنة 1986 وأجريت باستخدام الإجراءات العقيمة (تعقيمها) الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية. في حين أن نموذج الفئران من الكلى IRI المعروضة هنا كان يؤديها على الذكور عمره 8 أسابيع BALB / ج الماوس فإنه لا يمكن أن يؤديها بتكاثر على مجموعة متنوعة من سلالات الفئران من كلا الجنسين وعادة ما تتراوح أعمارهم بين 7 - 15 أسابيع، مع سن الأمثل الوجود 8 أسابيع. تم الحصول على البيانات الواردة في المقطع نتائج ممثلة من كل من BALB / ج الفئران وFVB. ويستخدم تطبيق المالحة استعد للحفاظ على الأمعاء ومنطقة الجراحية رطبة ولكن يجب أن يتم رصدها بعناية والاحتفاظ بها إلى أدنى حد ممكن مثل التطبيق المفرط للسوائل يمكن أن يؤدي إلى خفض مصطنعة من المصل أو البلازما مستويات الكرياتينين، والذي هو مهم قراءات تجريبية.
1. إعداد الحيوانية وفتح البطن
<رأ>2. قسم الحالب واستئصال الكلية اليمنى
- دفع برفق الأمعاء نحو الجانب الأيسر من تجويف البطن باستخدام قطعة قطن معقمة تعقيمها مبلل بمحلول ملحي لفضح الكلى والحالب الحق. تغطية الأمعاء مع الستائر مبلل لمنع جفاف.
- رفع الحالب الحق مع ملقط الزاوية. Ligate الحالب باستخدام حق مرتين 6/0 سيلخياطة مضفر ك. لإجراء التجارب على المدى الطويل، واستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص لجميع العمليات الجراحية في البطن.
- تقسيم الحالب بين الغرز. بينما تقاطع الحالبي المثاني يجب منع البول من تسرب في الصفاق من المثانة هو ligated الحالب كضمانة ضد أي تسرب بعد العملية خلال تجارب طويلة الأجل.
- للسماح سهولة الوصول عند إجراء استئصال الكلية اليمنى، ودفع برفق حتى الكبد وإلى اليمين باستخدام قطعة من القطن مبللة وعقد في مكان باستخدام شاش مبلل لفضح الشريان الكلوي الأيمن والوريد.
- بصراحة تشريح النسيج الضام والدهون على طول الجانب الإنسي من الكلية اليمنى بقدر الشريان الكلوي الأيمن والوريد.
- إنشاء قناة تحت الشريان والوريد الكلوي عن طريق تحريك بعناية ملقط الزاوية تحت الأوعية الدموية. توجيه ملقط تحت مع النصائح مغلقة وبلطف إزالة مع نصائح مفتوحة من أجل تسهيل تشكيل القناة.
- كرر الخطوة 2.6 حتى نصائح من ملقط تكون مرئية من خلال الأنسجة الضامة فقط فوق الشريان الكلوي والوريد. مرة واحدة واضحة فرك بلطف نصائح من ملقط ضد نصائح من مجموعة أخرى من ملقط الزاوية لكسر بلطف النسيج الضام.
- مع الشريان الكلوي والوريد يمكن الوصول إليها بشكل واضح أنها يمكن الآن المغطي. الشريحة بعناية ملقط الزاوية تحت الشريان الكلوي والوريد مع نصائح مغلقة. مرة واحدة في مكان فتح نصائح من ملقط وتوجيه مقطع قضيب تخثر الدم بين نصائح وبحزم تطبيق مقطع تخثر الدم على الشريان الكلوي والوريد على مقربة من الكلى. بدلا من الشريان والوريد الكلوي يمكن ligated باستخدام 6/0 خياطة الحرير مضفر.
- تقسيم الشريان الكلوي المغطي والوريد على مقربة من الكلى، والتي يمكن أن تحذف الآن مع أي النسيج الضام تمسكا المتبقية.
- إزالة أي الشاش تستخدم لعقد الكبد والأمعاء مع استبدال قطعة قطن.
> 3. نقص الأوكسجين الكلى اليسار وإعادة إشباع الخلايا
- دفع برفق الأمعاء نحو الجانب الأيمن من التجويف البطني مع مسحات القطن لفضح الكلية اليسرى والحالب، وتغطي مع الستائر مبلل. إذا لزم الأمر يمكن نحيد البنكرياس بشاش مبلل للسماح سهولة الوصول.
- استخدام تشريح حادة لكسر بلطف الأنسجة الضامة الأمامية والخلفية إلى الشريان الكلوي الأيسر والوريد، ثم إنشاء قناة تحت السفن بطريقة مماثلة لتلك التي وصفها في شعبة الحالب واستئصال الكلية اليمنى الخطوة 2.4.
- لحث على نقص الأوكسجين من الكلية اليسرى عن طريق تطبيق مقطع serrafine الصغيرة على الشريان الكلوي والوريد. ناجحة نقص الأوكسجين يمكن التأكد بصريا من قبل سواد موحدة التدريجي في الكلى. الأوعية الدموية بالإضافة إلى الشريان الكلوي الأيسر والوريد يمكن أن يقدم أحيانا على الكلى. إذا كان موجودا، وسوف تحتاج أيضا هذه الأوعية الدموية إضافية ليتم المغطي باستخدام مقاطع serrafine الصغيرة من أجل بنجاحلحث على نقص الأوكسجين في الكلى بأكمله.
- استبدال الأمعاء وبعناية ضمان أنه لا توجد التقلبات المفاجئة التي قد تؤدي إلى نتائج المساومة المعوية ونقص الأوكسجين. مؤقتا إغلاق الصفاق مع خياطة واحدة.
- نقص الأوكسجين التالية الحث على الفور وضع الماوس على بطانية homeothermic مع الثرمستور المستقيم تعلق على وحدة التحكم التي من شأنها الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية لمدة المطلوب من نقص الأوكسجين. لتحديد الطول المناسب من نقص الأوكسجين اللازمة للحث على الدرجة المطلوبة من الإصابة الكلوية والفشل الكلوي فمن المستحسن أن يتم تنفيذ المعايرة لكل سلالة والمشغل الجراحية.
- قبل نهاية فترة الدماغية قريبا إعادة فتح الغشاء البريتوني ووضع بعناية الأمعاء للسماح بالوصول إلى المشبك وعرض الكلى. الإدراج من ضام، كما هو موضح في الفيديو، وليس من الضروري وأجريت فقط لأغراض العرض.
- إزالة البنودأمبير بعد فترة من نقص الأوكسجين أبرمت. مباشرة بعد إزالة الكلى سوف تتغير بسرعة اللون من المارون الظلام إلى الوردي الداكن صحية تشير ضخه ناجحة.
- ضمان مرة أخرى أن الأمعاء لا الملتوية قبل إغلاق الصفاق مع غرزة بطانية باستخدام 6/0 مضفر الحرير خياطة. ثم إغلاق الجلد باستخدام مقاطع الجلد المعدني.
- لتقليل خطر العدوى بعد العمليات الجراحية، وتطبيق مطهر مثل محلول اليود / الكحول لمنطقة العمليات الجراحية.
4. الإنعاش والعناية بعد الجراحة
- التخدير عكس جزئيا مع هيدروكلوريد atipamezole (2 ملغ / كلغ) تحت الجلد وإدارة السوائل مع الحقن تحت الجلد من حرارة 1 مل المالحة لمنع الجفاف بعد الجراحة.
- رصد الفئران بعناية حتى أنها قد استعاد وعيه، وتظهر في حالة تأهب قادرون على تصحيح نفسها.
- تسمح أبقى الفئران لاسترداد في مربع ساخنة في 29 درجة مئوية، في الموضعated في بيئة هادئة، لمدة 24 ساعة. سوف الفئران لديها ضعف القدرة على التنظيم الحراري بسبب التخدير، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن يتم إيواؤهم في درجة حرارة مرتفعة لتمكين الانتعاش فعالة. ويمكن أيضا توفير الغذاء مبلل لتشجيع تناول السوائل والتغذية.
- لتوفير تجارب الانتعاش على المدى الطويل المسكنات الجارية وإزالة مقاطع الجلد 7 أيام بعد الجراحة.
5. تقييم الوظيفية والهيكلية إصابة الكلى والتجديد
- ويمكن جمع الدم من الوريد الذيل خلال التجارب أو عن طريق ثقب في القلب في وقت القتل الرحيم في نهاية التجربة. قياس وظيفة الكلى من الكرياتينين في مصل الدم، وذلك باستخدام طريقة كرياتيناز مقرها، واليوريا والنيتروجين في الدم (BUN) على الطرد المركزي محلل البيوكيميائية كما هو موضح سابقا 7. يحتاج وظيفة الكلى من الفئران صحية طبيعية يتم تحديدها قبل تأسيس نموذج للفشل الكلوي وهذا يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ dependiنانوغرام على طريقة التحليل المستخدمة مثل رد الفعل جافي وطرق كرياتيناز أساس لقياس الكرياتينين تعطي نتائج مختلفة.
- دراسة هيكل الكلوي عن طريق التشريح المرضي على البارافين جزءا لا يتجزأ من الكلى أقسام الأنسجة ملطخة Haematoxylin ويوزين (H & E) أو حمض شيف الدوري (PAS). الاستيلاء على ما بين 5-10 الصور في التكبير 200X داخل الشريط الخارجي للالنخاع الخارجي (OSOM) لكل الماوس. تقييم مستوى الإصابة في OSOM كما جرح في هذه المنطقة هذا النموذج لأنه عرضة لنقص الأكسجة.
- استخدام أي من أنظمة التهديف اثنين المفصلة أدناه لقياس نخر أنبوبي حاد (ATN) أو التجديد. ويتضح التشكل ممثل التصنيفات المستخدمة في هذه الأنظمة في الشكل 1.
- استخدام نظام ثنائي بسيط ليسجل ATN. على أساس من النزاهة الخلوية وعلامة التشكل والاعتماد الأنابيب إما قابلة للحياة (مورفولوجيا الخلايا سليمة) أو نخرية (الأسواق العالمية ضغطها خلية للخطرgrity، مورفولوجيا الخلايا الشاذة أو فقدان الخلايا).
- التعبير عن عدد من الأنابيب نخرية كنسبة مئوية من إجمالي عدد الأنابيب (نخرية الأنابيب٪).
- تصنيف التجديد باستخدام نظام آخر يعتمد على سلامة الخلية، مورفولوجيا وعدد النوى. علامة والاعتماد الأنابيب كما صحية، نخرية أو جرحوا أو استرداد وفقا للمعايير الواردة في الخطوات التالية.
- كما هو الحال مع نظام التسجيل ATN (المفصل في الخطوة 5.4) الأنابيب علامة مع الخلايا الطبيعية سليمة صحية، في حين الأنابيب التي تبين سلامة الخلايا للخطر، ينبغي أن سجل مورفولوجيا الخلايا الشاذة أو فقدان الخلية العلني كما نخرية.
- تصنيف الأنابيب كما أصيب إذا كان لديهم ضعيفة السيتوبلازم التي تحتوي على عدد قليل من النوى. في المقابل، تعين الأنابيب التي تحتوي على أكثر النوى مع أكثر مورفولوجيا الخلايا العادية كما تتعافى.
- التعبير عن كل تصنيف نبيب كنسبة مئوية من إجمالي عدد نبيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إصابة أنبوبي والانتعاش يمكن تقييمها بواسطة H & E PAS أو تلطيخ أقسام الأنسجة التالية الكلوي IRI. تصنف الأنابيب التي تقع داخل OSOM كما صحية، والجرحى، نخرية أو استرداد وفقا لمورفولوجيا الخلايا والنزاهة وعدد النوى (الشكل 1). إصابة الوظيفية والهيكلية في هذا النموذج يعتمد على مدة نقص الأوكسجين. وهناك زيادة تدريجية في شدة ضعف الكلى، والمقررة من قبل الكرياتينين البلازما وااا، كما هو واضح مدة نقص الأوكسجين يتم زيادة بزيادات 2min (الشكل 2). مدى الإصابة الكلوية الهيكلية، يستدل من النتيجة ATN، يتبع اتجاها مماثلا مع ATN أشد المصاحبة نقص الأوكسجين أكثر فترات طويلة (الشكل 3). بعد المعايرة الأولية لفترات متفاوتة من نقص الأوكسجين، وينبغي أن هذا النموذج من تحقيق الكلوي IRI بالقرب نسبة النجاح 100٪، مع جميع الفئران النامية إصابة حد سواء وظيفية وهيكلية التالية surgerذ. هذا النموذج من الكلى IRI تمكن أيضا على مستوى جيد من السيطرة على درجة الإصابة مع يقتصر الاختلاف الملاحظ بين الحيوانات (الشكلين 2 و 3). استخدام فترات مختلفة من نقص الأوكسجين تمكن التدخلات العلاجية التي يتعين بحثها لقدرتها على تعديل مستويات مختلفة من شدة الإصابة. على سبيل المثال على أساس طول نقص الأوكسجين يمكن ان تصنف الإصابة الناتج كما خفيفة (20 دقيقة)، معتدلة (22 دقيقة) أو عالية (24 دقيقة). هذه القيم هي للذكور BALB / ج الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع وتدرج والتوجيه فقط. يجب أن المحققين تهيئة الظروف التجريبية الخاصة بهم وهذه سوف تختلف وفقا لسلالة الفأر، والعمر، والجنس، ومقايسة البيوكيميائية المستخدمة لتقييم وظائف الكلى.
وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لدراسة التجديد التالية الكلوي IRI مع كل وظيفة الكلى وهيكل يتعافى خلال الأيام التي تلت ذلك. انخفاض تدريجي في مستويات الكرياتينين البلازما وااا هي OBServed، مع الكرياتينين البلازما يعود إلى مستويات القاعدية بعد يوم 7 (الشكل 4). تقييم لH & E أقسام الأنسجة الملون يشير إلى أن تصنف زيادة عدد الأنابيب كما صحية أو يتعافى في يوم 7 مقابل 4 يوم مشيرا إلى أن تجديد الأنسجة يحدث (الشكل 5). إدارة 5 برومو 2'-deoxyuridine (BrdU) قبل أن يضحي يسهل المناعية للأنسجة الكلى لBrdU والكمي لاحقة من انتشار الخلايا الأنبوبية. ويلاحظ درامية التعبير BrdU النووية 4 أيام التالية الكلوي IRI مشيرا إلى أن الأنابيب التي تمر تكاثر الخلايا ملحوظ من أجل استعادة سلامة أنبوب صغير وظيفة (الشكل 6). الجمع بين وظيفة الكلى التقييم، وسجل للتحسين الهيكلية وBrdU المناعية تمكن هذا النموذج لاستخدامها لدراسة التجديد التالية الكلوي IRI. وهذا يسمح للآثار طويلة الأجل للتدخلات العلاجية ليكون فيvestigated.
وأخيرا، فإن فائدة هذا النموذج يعتمد على تحريض نقص الأوكسجين العالمية إلى الكلى وهذا كله قد تتعرض للخطر بسبب وجود الأوعية الدموية التي تغذي الكلى بالإضافة إلى الشريان الكلوي الأيسر الرئيسي. إذا لم يتم فرضت هذه السفن إضافية ثم لن يتعرض جزء من الكلى إلى الإصابة الدماغية (الشكل 7).
الشكل 1 يحرز الإصابة أنبوبي الهيكلية والتجديد - مورفولوجيا ممثل صحية، ويتعافى، وأصيب الأنابيب نخرية أقسام الأنسجة من الكلى إزالة 4 أيام التالية الكلوي IRI ملطخة PAS للتقييم. تصنف الأنابيب التي تقع داخل OSOM كما صحية، والجرحى، نخرية أو استرداد وفقا لأبرز مورفولوجيا الخلايا والنزاهة وعدد النوى مع نماذج تمثيلية. الأنابيب صحية سليمة مع التشكل الخلوي العادي. الأنابيب نخرية يحمل أحادي الطبقة مع خطر فقدان الخلية واضح وفقدان مورفولوجيا الخلايا. الأنابيب أصيب يحمل أحادي الطبقة الخلوية ضعيفة، وتحتوي على عدد أقل من النوى. في المقابل، الأنابيب يتعافى يحمل مورفولوجيا الخلوية العادية أكثر وعدد مماثل من نوى إلى الأنابيب صحية. التكبير: 400X الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 الإصابات - الكلوي نقص الأوكسجين يضعف وظائف الكلى ذكر BALB / ج الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع خضع لاستئصال الكلية اليمنى و.وقد فرضت ترك عنيق الكلوي لمدة 20، 22 أو 24 دقيقة (ن = 4 في كل مجموعة). تم التضحية الفئران في 24 ساعة التالية الكلوي IRI. الكرياتينين البلازما واليوريا والنيتروجين في الدم تظهر اتجاها متزايدا من شدة وطول نقص الأوكسجين زيادة. خط متقطع يمثل مستويات الكرياتينين البلازما واليوريا والنيتروجين في الدم وجدت في السيطرة على الفئران العادية. البيانات المقدمة كما يعني ± SEM وتحليلها من قبل في اتجاه واحد أنوفا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الرقم 3 إصابات - نقص الأوكسجين الكلوي يدفع كبيرة نخر أنبوبي حاد خضع ذكر BALB / ج الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع استئصال الكلية اليمنى وكان عنيق الكلوي الأيسر البنود.[أمبد] لمدة 20، 22 أو 24 دقيقة (ن = 4 في كل مجموعة). تم التضحية الفئران في 24 ساعة التالية الكلوي IRI. photomicrographs ممثل (التكبير: 200X) من OSOM من أقسام الكلى H & E الملون الرقابة والكلى بجروح توضيح ATN. التسجيل الرسمي ATN (كنسبة نسبة الأنابيب نخرية) تؤكد زيادة مستوى الإصابة مع زيادة مدة من نقص الأوكسجين. البيانات المقدمة كما يعني ± SEM وتحليلها من قبل في اتجاه واحد أنوفا (**** = P ≤ 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يستعيد وظيفة الكلى التالية نقص الأوكسجين الكلوي ذكر FVB الفئران AG - الرقم 4 التجديد.خضع 10 أسبوعا في استئصال الكلية اليمنى قبل 25 دقيقة من نقص الأوكسجين إلى الكلية اليسرى - الطبعة 8. تم التضحية الفئران 1 يوم (ن = 10)، 4 أيام (ن = 10) أو 7 أيام (ن = 6) التالية الكلوي IRI. كل من الكرياتينين واليوريا بلازما الدم ينخفض بشكل مطرد النيتروجين على مدار 7 أيام، مع الكرياتينين البلازما يعود إلى مستويات القاعدية، توضح حدوث انتعاش في وظيفة الكلى. البيانات المقدمة كما يعني ± SEM وتحليلها من قبل في اتجاه واحد أنوفا (*** = P ≤ 0.001، * = P ≤ 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يظهر الكلوي الأنسجة بوادر الانتعاش التالية رينا - الرقم 5 التجديد. خضع 10 أسبوعا في استئصال الكلية اليمنى قبل 25 دقيقة من نقص الأوكسجين إلى الكلية اليسرى - لتر نقص الأوكسجين الفئران FVB ذكر الذين تتراوح أعمارهم بين 8. تم التضحية الفئران 4 أيام (ن = 10) أو 7 أيام (ن = 6) التالية الكلوي IRI. وترد: (200X التكبير) من OSOM التالية تحريض نقص الأوكسجين photomicrographs ممثل. تم تقييم التهديف الرسمي لعدد من صحية، استعادة، أو جرحوا أو الأنابيب نخرية داخل OSOM في PAS ملطخة أقسام البارافين. في اليوم التالي 4 الكلوي IRI نسبة كبيرة من الأنابيب داخل OSOM تزال تظهر بجروح. ولكن من خلال 7 أيام هناك زيادة كبيرة في نسبة الأنابيب التي تصنف على أنها صحية أو استرداد يدل على تجديد الكلوي. البيانات المقدمة كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الرقم 6 التجديد - المسرحية انتشار أنبوبي هو واضح 4 أيام التالية نقص الأوكسجين الكلوي الفئران FVB ذكر الذين تتراوح أعمارهم بين 8 - 10 أسابيع خضع لاستئصال الكلية اليمنى قبل 25 دقيقة من نقص الأوكسجين إلى الكلية اليسرى. كانت تدار BrdU (50 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل 24 ساعة للتضحية. تم التضحية الفئران 4 أيام (ن = 10) أو 7 أيام (ن = 6) التالية الكلوي IRI. photomicrographs ممثل (التكبير: 200X) من OSOM من الفئران التضحية في يوم 4 و 7 يوم بعد تحريض نقص الأوكسجين ترد. تم تقييم تكاثر الخلايا أنبوبي بواسطة تلطيخ المناعى للBrdU على البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الكلى. وكان كميا تكاثر الخلايا الأنبوبية عن طريق حساب عدد من نوى BrdU إيجابي في OSOM مع زيادة تكاثر الخلاياواضحا في اليوم 4. تقديم البيانات يعني ± SEM كما وتحليلها من قبل الطلاب اختبار t (*** = P ≤ 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. اليسار الكلى الدماغية مع الأوعية الدموية الكلوية إضافية غير المغطي. عدم انسداد الأوعية الدموية إضافية توريد الكلى يؤدي إلى نقص الأوكسجين غير متناسقة. (أ) يشار إلى عدم وجود نقص الأوكسجين الكلى العالمي من خلال تغيير لون غير متساو (السهم الأبيض) عندما مقطع serrafine الجزئي في الموقف. (B) بعد إزالة مقطع serrafine الصغرى، الشريان الكلوي والوريد الرئيسي مرئية (السهم الأبيض) جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية إضافية توريدالقطب الوسطى والدنيا من الكلى (السهم الأسود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IRI الكلوي هو أحد أهم أسباب آكي مع عدم وجود علاج محدد المتاحة. وكانت الدراسة التجريبية الكلوي IRI بالمعلومات للغاية مع العمل السابق مما يدل على دور الضامة، والخلايا الجذعية، الخلايا الليمفاوية وخلايا T-التنظيمية وكذلك الخلايا وسطاء في تحريض كل من الإصابة الحادة ومرحلة الشفاء الأخرى 5،8 - 16. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام التجريبية الكلوي IRI لتقييم تأثير مختلف العوامل العلاجية 4،17-19.
يستخدم نموذج الكلوي IRI مفصلة هنا نهج خط الوسط البطن لإجراء استئصال الكلية اليمنى وإحداث نقص الأوكسجين في الكلية اليسرى باستخدام المشابك. كما يتضح من نتائج ممثل، وتعديل مدة نقص الأوكسجين يمكن التحكم في شدة الاصابة. وبالتالي هذا النموذج يمكن تعديلها للحث خفيفة، معتدلة أو على مستوى عال من إصابة الكلى كما هو مطلوب من السؤال التجريبية المطروحة. ومع ذلك، وجود قيود من هذا النموذج هو أنهليست مناسبة للتحريض إصابة الكلى الحاد جدا ونقص الأوكسجين الكلى لفترة طويلة. قد يؤدي الناتجة شديدة الاختلال الوظيفي الكلوي الحاد إلى وفيات كبيرة.
وهناك العديد من جوانب هذا النموذج التي تعتبر حاسمة من أجل تحقيق الإصابة الكلوية يمكن التنبؤ بها وقابلة للتكرار. واحد مصدرا رئيسيا للتقلب مع هذا النموذج يمكن أن تنشأ من درجة حرارة الجسم خلال فترة 20 الدماغية. ولذا فمن الضروري أن درجة حرارة الجسم والحفاظ على مستوى ثابت ومراقبتها طوال فترة الدماغية. في هذا البروتوكول تم استخدام وحدة تحكم في درجة الحرارة مع تحقيقات وبطانية homoeothermic لصناعة السيارات في تنظيم درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. تأثير درجة حرارة الجسم على قابلية الكلى إلى الإصابة الدماغية يوصف أيضا. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن درجة حرارة الجسم يؤثر على شدة الكلوي IRI 20 والتباين في درجة حرارة الجسم من الفئران هو الخلط المحتملةالعوامل التي قد تؤثر على تفسير النتائج. هناك اعتبار آخر مهم هو أن الفئران قد يحمل الاختلاف التشريحي مع الأوعية الدموية التي تغذي إضافية الكلية اليسرى. فمن الأهمية بمكان أن يتم تحديد هذه الأوعية الدموية والمغطي إضافية عند أداء استئصال الكلية اليمنى وإحداث نقص الأوكسجين العالمي في الكلية اليسرى. وعدم القيام بذلك يؤدي إلى نقص الأوكسجين غير متناسقة في جميع أنحاء الكلى. وبالمثل، فإن تغير اللون من اليسار الكلى لقط التالية من عنيق الكلوي الأيسر يجب أن تدرس بعناية، وغياب لون يتغير العالمية توحي وجود الشريان الكلوي الإضافية التي لم يتم التعرف في البداية.
وعلى النقيض من النماذج التي تستخدم نقص الأوكسجين الكلى الثنائية، وهذا النموذج تكون ذات فائدة للباحثين الذين يستخدمون الإدارة وقائية من العقاقير الدوائية أو غيرها من العوامل لتعديل التعبير عن الجينات والبروتينات وما قبل الإصابة الكلوية. تلاعبحزب التحرير الأنسجة استئصال الكلية يمكن استخدامها لتأكيد كل من وقياس مستوى التحريض أو تثبيط جزيء من الفائدة في كل حيوانات التجارب الفردية. وسوف يكون هذا النموذج أيضا من الفائدة للباحثين الذين يدرسون التجديد الكلى كما ويتبع مرحلة الإصابة الحادة عن طريق الانتشار أنبوبي بارزة.
بعض نماذج تجريبية من التهاب الكلى تقتصر باسم مرض كبير لا يمكن إلا أن يتسبب في سلالات معينة من الفئران. في المقابل، فإن نموذج الكلوي IRI الموصوفة هنا هي متعددة ويمكن تطبيقها على كل من الذكور والإناث 4 5 الفئران، وسلالات مختلفة من الفئران، وكذلك الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
