Abstract
פגיעת reperfusion איסכמיה כליות (IRI) היא סיבה שכיחה של ניזק כלייתי חריף (AKI) בחולים וחסימה של זרימת דם כליות הוא בלתי נמנע במהלך השתלת כליה. מודלים ניסיוניים באופן מדויק וreproducibly לסכם IRI כליות הם קריטיים בלנתח את הפתופיזיולוגיה של AKI והפיתוח של סוכנים טיפוליים חדשניים. מוצג כאן הוא מודל של עכברים של IRI כליות שגורם לאקי לשחזור. זו מושגת על ידי גישת laparotomy קו האמצע לניתוח עם חתך אחד ומאפשר גם כריתת כליה תקין המספקת רקמת שליטה והידוק של גבעול הכליה השמאלי כדי לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית. על ידי ניטור קפדני של עמדת המהדק ואת טמפרטורת גוף בתקופת איסכמיה מודל זה משיג פגיעה תפקודית ומבנית לשחזור. עכברים הקריבו 24 שעות לאחר ניתוח להפגין אובדן תפקוד כליות עם גובה של הסרום או ברמת קריאטינין בפלזמה, כמו גם strucנזק לכליות טוראל עם נמק צינורי חריף מאליו. משפר את תפקוד כליות והפגיעה ברקמות האקוטית פותרת במהלך 7 ימים הבאים IRI כליות כך שמודל זה יכול לשמש כדי ללמוד התחדשות כליות. מודל זה של IRI הכליות נוצל כדי ללמוד את הפתופיזיולוגיה המולקולרית ותאית של AKI, כמו גם ניתוח של התחדשות הכליה שלאחר מכן.
Introduction
פגיעת reperfusion איסכמיה (IRI) היא מצב שכיח לפציעות לאיברים רבים, כולל כליות, לב והמוח. כליות IRI עלול להוביל לפגיעה בכליות חריפה (AKI) בחולים ואין טיפול ספציפי זמין. יש AKI כתוצאה מIRI פתוגנזה מסובכת מעורבת הן תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות 1. מודל ניסיוני של IRI הכליות מציע את הפוטנציאל לנתח את התאים ומתווכים מעורבים בפתוגנזה של AKI כמו גם התחדשות הכליות לאחר שמתפתחת במשך ימים שלאחר מכן מפתח. יתר על כן את ההשפעות של סוכנים טיפוליים חדשניים על תהליכי מחלה ניתן להעריך.
המטרה הכללית של המודל הניסיוני של IRI כליות מתוארת כאן הוא כדי לגרום לפגיעה בכליות גם תפקודית ומבנית חריפה. חוקרים אחדים מנוצלים מודל שכרוך בגיוס של IRI דו צדדי 2. למרות שמודל IRI כליות דו צדדי הוא שימוש, רן חד צדדייש מודל אל IRI היתרון של כריתת כליה תקין המתבצעת בזמן הניתוח. רקמת כריתת הכליה הימנית משמשת רקמת שליטה יקר כמו במחקרים שכללו שלב מקדים שגם גורם או מדכא את הביטוי של גן או חלבון. לדוגמא, יש לנו להשתמש במודל זה כדי להעריך את ההשפעות נפשית מראש של arginate heme (HA) הזרקת 24 שעות לפני IRI כליות 3. האינדוקציה המוצלחת של אנזים heme-oxygenase-1 cytoprotective (HO-1) על ידי HA לפני IRI אושרה ברקמת שליטת כריתת הכליה הימנית 4. HA מופחת IRI כליה בעכברים בגיל בחלק באמצעות מנגנון תלוי HO-1. בדומה לכך, יש לנו להשתמש במודל במחקרי דלדול מקרופאג כדי לבחון את התפקיד של מקרופאגים בIRI כליות 5. ניתוח immunohistochemical של רקמת כריתת הכליה תקין יכול לשמש כדי לאשר את היעילות של המתודולוגיה אבלציה. רקמת כריתת הכליה תקין ולכן יכולה לשמש לשניהם לאשר ולכמת את הרמה של induction או עיכוב של המולקולה של ריבית בכל בעלי חיים ניסיוניים בודדים. מודל זה יהיה עניין לחוקרים המשתמשים בתרופות או חומרים אחרים כדי לווסת את הביטוי של גנים או חלבונים וכו 'לפני הגיוס של IRI כליות.
מחקרים אחרים השתמשו חתכים אגף לגשת לכליות. המודל שתואר כאן משתמש בניתוח בטן קו האמצע אחת כדי לבצע את שני כריתת הכליה תקין ולגרום reperfusion איסכמיה של הכליה השמאלית. גישה ניתוחית זו מספקת הדמיה מצוינת של שדה הניתוח כוללים pedicles הכליות ושינויים בצבע שבאים אחרי הידוק pedicle כליות. הניסיון פורסם עם המודל 4-6 מצביע על כך שהעכברים להתאושש במהירות מהניתוח עם שיעור הישרדות ליד 100%.
לבסוף, ניתוח הקינטית של המודל על פני תקופה של 7 ימים עולה כי מודל זה מציג שחזור של שניהם בתפקוד הכלייתי ויושרה צינורי, עםהתפשטות תאים צינוריים משמעותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה:. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שהוטלו על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986 נהלים בוצעו באמצעות מכשירים סטריליים (autoclaved) כירורגית וחומרים מתכלים. בעוד המודל העכברי של IRI הכליות מוצג כאן בוצע על זכר 8 שבועות בן עכבר BALB / C זה יכול להתבצע reproducibly על מגוון רחב של זני Murine של שני מינים בגילים בדרך כלל בין 7-15 שבועות, עם בן גיל האופטימלי 8 שבועות. הנתונים שהוצגו בסעיף תוצאות הנציג הושגו משני BALB / ג ועכברי FVB. היישום של מי מלח מחומם משמש כדי לשמור על המעיים ואזור ניתוח לחים אבל זה צריך להיות במעקב צמוד ומינימאלי כבקשה המוגזמת של נוזלים יכול להוביל לartifactual הפחתה של הסרום או הפלזמה רמות קריאטינין, שהוא חשוב קריאת נתוני ניסוי.
1. הכנת בעלי החיים וLaparotomy
<ol>2. חטיבת השופכן הימני וNephrectomy
- דחף בעדינות את המעיים לכיוון הצד השמאלי של חלל הבטן באמצעות autoclaved ספוגיות כותנה מעוקרת טבולה במלח כדי לחשוף את הכליה ושופכן הימנית. מכסה את המעיים עם וילונות לחים כדי למנוע התייבשות.
- הרם את השופכן תקין עם מלקחיים זווית. ולקשור את השופכן תקין פעמיים באמצעות 6/0 silתפר k-קלוע. לניסויים ארוך טווח, השתמשו תפרים נספגים לכל ניתוחי הבטן.
- מחלקים את השופכן בין התפרים. בעוד צומת vesico-ureteric צריכה למנוע משתן דולף לתוך הצפק משלפוחית השתן השופכן גבעול כאמצעי הגנה מפני כל דליפה לאחר הניתוח במהלך ניסויים לטווח ארוך.
- כדי לאפשר גישה קלה יותר בעת ביצוע כריתת הכליה הימנית, דחף בעדינות את הכבד וימינה באמצעות מקלון צמר גפן טבולה ולהחזיק במקום בעזרת גזה לחה כדי לחשוף את עורק הכליה הימני ווריד.
- בוטות לנתח את רקמת חיבור ושומן לאורך ההיבט המדיאלי של הכליה הימנית ככל עורק הכליה הימני ווריד.
- ליצור ערוץ מתחת לעורק הכליה וריד על ידי הזזה בזהירות את המלקחיים הזווית מתחת לכלי הדם. מדריך המלקחיים מתחת עם הטיפים סגורים ולהסיר בעדינות עם הקצוות הפתוחים כדי להקל על היווצרות של הערוץ.
- חזור על שלב 2.6 עד קצות המלקחיים גלויים דרך רקמות חיבור בדיוק מעל העורק ווריד הכליה. ברגע שנראה לעין לשפשף בעדינות את קצות המלקחיים נגד העצות של קבוצה נוספת של מלקחיים זווית לשבור את רקמת חיבור בעדינות.
- עם עורק הכליה וריד בבירור נגיש הם יכולים להיות סתם את החברה. מחליקים בזהירות מלקחיים זווית מתחת לעורק הכליה ווריד עם הטיפים סגורים. פעם במקום לפתוח את קצות המלקחיים ולהנחות את המוליך קליפ עוצר דמום בין הטיפים ותקיפות להחיל קליפ עוצר דמום אל עורק הכליה וורידים קרוב לכליה. לחלופין העורק ווריד הכליה ניתן ligated באמצעות תפר 6/0 קלוע משי.
- מחלקים את העורק החסום כליות ווריד קרוב לכליות, אשר כעת ניתן להסיר עם כל רקמת חיבור חסיד שנותרה.
- הסר את כל גזה משמשת להחזיק את הכבד ולהחליף את המעיים עם צמר גפן.
> 3. איסכמיה כליה שמאלית וreperfusion
- דחף בעדינות את המעיים לכיוון צד ימין של חלל הבטן עם צמר גפן על מנת לחשוף את הכליה ושופכן עזבה ולכסות עם וילונות לחים. במידת צורך יכול להיות מוסח הלבלב עם גזה לחה כדי לאפשר גישה קלה יותר.
- השתמש לנתיחה בוטה לשבור בעדינות רקמות חיבור קדמית ואחוריות לעורק הכליה השמאלי ווריד, ולאחר מכן ליצור ערוץ מתחת כלי באופן דומה לזה שתואר באגף הימני ושופכן Nephrectomy צעד 2.4.
- לגרום לאיסכמיה של הכליה השמאלית ידי החלת קליפ serrafine מיקרו על העורק ווריד הכליה. איסכמיה מוצלחת ניתן לאשר באופן חזותי על ידי מחשיך אחיד הדרגתי של הכליות. כלי דם בנוסף לעורק הכליה השמאלי והווריד עשויים לעתים לספק את הכליות. אם הוא קיים, כלי דם נוספים אלה יהיו גם צריכים להיות occluded באמצעות קליפים serrafine מיקרו על מנת בהצלחהלגרום לאיסכמיה של כל הכליה.
- החלף את המעיים ובזהירות להבטיח כי אין פיתולים חדים שעלולות להוביל לתוצאות מתפשרות איסכמיה של המעיים. באופן זמני לסגור את הצפק עם תפר אחד.
- בעקבות האינדוקציה איסכמיה מקום באופן מיידי את העכבר על שמיכת homeothermic עם תרמיסטור רקטלית צורף ליחידת בקרה שתשמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס למשך המבוקש לאיסכמיה. כדי להגדיר את האורך המתאים של איסכמיה דרושה כדי לגרום למידה הרצויה של פגיעה בכליות ואי ספיקת כליות מומלצת שטיטרציה להתבצע עבור כל זן ומפעיל כירורגית.
- זמן קצר לפני תום תקופת איסכמי מחדש לפתוח את הצפק ובזהירות למקם את המעיים כדי לאפשר גישה למהדק ולהציג את הכליות. ההחדרה של מפשק, כפי שניתן לראות בסרטון, אין צורך ובוצעה אך ורק למטרות פרזנטציה.
- הסר את CLמגבר לאחר תקופה של איסכמיה הגיע למסקנה. מייד לאחר הסרת הכליה במהירות תשנה את הצבע מחום כהה לורודה כהה בריא מצביע reperfusion המוצלח.
- שוב לוודא שהמעיים אינם מעוות לפני סגירת הצפק עם שמיכת תפר באמצעות 6/0 תפר משי קלוע. ואז לסגור את העור באמצעות קליפים עור מתכתיים.
- כדי למזער את הסיכון לזיהום שלאחר ניתוח, להחיל חיטוי כגון תמיסת יוד / אלכוהול לאזור הניתוח.
4. התאוששות שלאחר ניתוח וטיפול
- תת עורי הרדמה חלקית הפוכה עם hydrochloride atipamezole (2 מ"ג / קילוגרם) ולנהל נוזלים עם הזרקה תת עורית של 1 מיליליטר חימם מלח כדי למנוע התייבשות לאחר ניתוח.
- זהירות לפקח עכברים עד שהם חזרו להכרתו, מופיע התראה והם מסוגלים לתקן את עצמם.
- מאפשרים עכברים להתאושש בקופסא מחוממת המשיכו ב29 C °, located בסביבה שקטה, ל24 שעות. יהיו לי עכברי יכולת לקויה thermoregulate בשל ההרדמה ולכן חיוני כי הם שוכנו בטמפרטורה גבוהה, כדי לאפשר התאוששות יעילה. יכול להיות גם סיפק מזון טבול לעודד נוזלים וצריכת תזונה.
- עבור ניסויי התאוששות לטווח ארוך מספקים משככי כאבים מתמשכים ולהסיר סרטוני עור 7 ימים לאחר ניתוח.
5. הערכת פגיעה בכליות פונקציונלית מבנית והתחדשות
- דם ניתן לגבות מוריד הזנב במהלך ניסויים או על ידי לנקב לב בעת המתת חסד בסוף הניסוי. למדוד את תפקוד כליות על ידי קריאטינין בסרום, תוך שימוש בשיטת creatinase מבוסס, וחנקן אוריאה בדם (BUN) על מנתח צנטריפוגלי יוכימיים כפי שתואר לעיל 7. תפקוד הכליות של עכברים בריאים נורמלים צריך להיקבע לפני הקמת מודל של אי ספיקת כליות כמו זה יכול להשתנות במידה ניכרת depending על שיטת הניתוח המשמשת לדוגמא את התגובה יפה ושיטות creatinase מבוססות למדידת קריאטינין לתת תוצאות שונות.
- לבחון את מבנה כליה על ידי histopathology בסעיפי רקמות פרפין מוטבע כליות מוכתמות בHaematoxylin ו eosin (H & E) או תקופתי חומצה שיף (PAS). ללכוד בין 5-10 תמונות בהגדלה של 200x בתוך הפס החיצוני של מדולה החיצונית (OSOM) לכל עכבר. להעריך את רמת הפגיעה בOSOM כאזור זה נפגע במודל זה משום שהוא פגיע מאוד להיפוקסיה.
- השתמש באחת משתי מערכות הניקוד מפורטות להלן כדי למדוד נמק חריף צינוריים (ATN) או התחדשות. מורפולוגיה נציג של הסיווגים בשימוש במערכות אלה מודגמת באיור 1.
- השתמש במערכת בינארית פשוטה להבקיע ATN. על הבסיס של יושר סלולארי וסימן מורפולוגיה ולספור tubules כמו גם (מורפולוגיה שלמות תא) קיימא או נמקים (inte תא נפגעיםgrity, מורפולוגיה נורמלית תא או אובדן של תאים).
- לבטא את מספר צינוריות נמקים כאחוז מהמספר הכולל של צינוריות (tubules נימקי%).
- לסווג התחדשות באמצעות מערכת אחרת המבוססת על שלמות התא, מורפולוגיה ומספר גרעינים. tubules מארק ולספור בריאים, נמקים, פצוע או מתאושש בהתאם לקריטריונים המפורטים בשלבים הבאים.
- כמו במערכת ATN הניקוד (המפורטת בצעד 5.4) tubules סימן עם תאים נורמלים ללא פגע בריאים כתוך tubules מראה שלמות תא נפגעה, מורפולוגיה של תאים חריג או אובדן תא גלוי צריכה להיות הבקיע כנימקים.
- לסווג את הצינוריות כנפצעו אם יש להם ציטופלסמה דליל המכילה כמה גרעינים. בניגוד לכך, לייעד צינוריות המכילות יותר גרעינים עם מורפולוגיה של תאים נורמלים יותר כמחלים.
- להביע כל סיווג אבובית כאחוז מהמספר הכולל אבובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פציעה והתאוששות צינורי עשויות להיות מוערכת על ידי H & E או צביעת PAS של חלקי רקמות הבאים IRI כליות. קשיות ממוקמות בתוך OSOM מסווגים כבריאים, נפגע, נמקים או מחלים על פי מורפולוגיה של תאים, יושרה ומספר גרעינים (איור 1). הפגיעה התפקודית ומבנית במודל זה היא תלויה משך איסכמיה. עלייה הדרגתית בחומרת פגיעה בתפקוד הכלייתי, שהוערכה על ידי קריאטינין פלזמה ו BUN, ניכרה כמשך הזמן של איסכמיה הוא גדל במרווחי 2min (איור 2). פציעה כליות מבנית, המשתמעת מציון ATN המידה, כדלקמן מגמה דומה עם ATN החמור יותר מלווה איסכמיה ממושכת יותר (איור 3). בעקבות טיטרציה ראשונית לטווחים שונים של איסכמיה, מודל זה של IRI כליות צריך להשיג שיעור הצלחה קרוב 100%, עם כל העכברים לפתח פציעה גם פונקציונלית ומבנית הבאים Surgery. מודל זה של IRI הכליות מאפשר גם רמת קנס של שליטה על מידת פגיעה בוריאציה מוגבלת נצפתה בין בעלי החיים (איורים 2 ו -3). השימוש במשכים זמן שונה של איסכמיה מאפשר התערבויות טיפוליות כדי להיבחן ביכולתם לווסת את הרמות של חומרת פציעה שונות. לדוגמא על בסיס האורך של איסכמיה פציעת כתוצאה מכך יכולה להיות מסווגת כקלה (20 דקות), בינוני (22 דקות) או (דקות 24) גבוהות. ערכים אלה הם לעכברי BALB / ג גברים בגילי 8 שבועות ונכללים כהכוונה בלבד. חוקרים צריכים להקים תנאי הניסוי שלהם כמו אלה משתנים בהתאם לזן עכבר, גיל, מין וassay ביוכימיות המשמש להערכת תפקוד כליות.
מודל זה שמש בהצלחה ללמוד התחדשות הבאה IRI כליות עם שני תפקוד ומבנה כליות מתאוששים בימים שלאחר מכן. ירידה הדרגתית בקריאטינין בפלזמה ורמות BUN הן תצפיותerved, עם קריאטינין בפלזמה חוזר לרמות בסיס יום 7 (איור 4). הערכה של סעיפי רקמות מוכתמות H & E מציינת כי מספר גדל של tubules מסווגים כבריאים או מחלים ביום 7 בהשוואה ליום 4 המציין כי התחדשות רקמות מתרחשת (איור 5). הממשל של 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) שקדמו להקרבה מאפשר immunostaining של רקמת הכליה לBrdU והכימות הבא של התפשטות תאים צינוריים. ביטוי BrdU הגרעיני דרמטי הוא ציין 4 ימים הבאים IRI הכליות מצביעים על כך שהצינוריות עוברות התפשטות תאים מסומנת על מנת לשקם את יושרת אבובית ותפקוד (איור 6). השילוב של הערכת תפקוד, ניקוד כליות לשיפור מבני וimmunostaining BrdU מאפשר מודל זה כדי לשמש כדי לחקור התחדשות הבאה IRI כליות. זה מאפשר להשפעות ארוכת הטווח של התערבויות טיפוליות להיות בvestigated.
לבסוף, את התועלת של מודל זה תלויה באינדוקציה של איסכמיה הגלובלית לכל בכליות וזה עלול להיות בסכנה על ידי הנוכחות של כלי דם המזינים את הכליות בנוסף לעורק הכליה השמאלי הראשי. אם כלי נוספים אלה לא הידקו אז חלק מהכליות לא יהיה נתון לפגיעה איסכמית (איור 7).
איור 1 ניקוד של פגיעה בצינורי מבנית והתחדשות -.. מורפולוגיה נציג בריא, מתאושש, נפגע וtubules נימקי חלקי רקמות מכליות הוסר 4 ימים הבאים IRI כליות מגואלות PAS להערכה. קשיות ממוקמות בתוך OSOM מסווגים כבריאים, נפגע, נמקים או מתאוששים פימורפולוגיה של תאים, יושרה ומספר גרעינים עם דוגמאות מייצגות מודגשת. tubules בריא הם שלם עם מורפולוגיה תאית נורמלית. tubules נימקי תערוכת monolayer התפשר עם אובדן תא מאליו והפסד של מורפולוגיה של תאים. tubules נפצע תערוכת monolayer סלולארי דליל ומכיל פחות גרעינים. לעומת זאת, tubules מחלים להפגין מורפולוגיה נורמלית יותר סלולרית ומספר דומה של גרעינים לtubules בריא. הגדלה:. 400x אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 נפגעי -. איסכמיה כליות פוגעת בתפקוד כליות עכברי BALB / ג זכר בגילי 8 שבועות עברו כריתת כליה ימנית ו.pedicle כליה השמאלית מהודקת ל20, 22 או 24 דקות (n = 4 לכל קבוצה). עכברים הוקרבו ב24 שעות הבאות IRI כליות. קריאטינין פלזמה וחנקן אוריאה בדם מראים מגמה גוברת של חומרה כמו האורך של איסכמיה המוגברת. הקו המקווקו מייצג את הרמות של קריאטינין בפלזמה וחנקן אוריאה בדם שנמצאו בעכברי בקרה נורמלים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM ונותחו על ידי בכיוון אחד ANOVA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3 פגיעה - איסכמיה כליות גורמת לנימק צינורי חריפה משמעותי עכברי BALB / ג זכר בגילי 8 שבועות עברו כריתת כליה ימנית וגבעול הכליה השמאלי היה CL.amped ל20, 22 או 24 דקות (n = 4 לכל קבוצה). עכברים הוקרבו ב24 שעות הבאות IRI כליות. photomicrographs נציג (הגדלה: 200x) של OSOM מסעיפי כליות H & E מוכתמות של שליטה וכליות נפגעו להמחיש ATN. הניקוד הרשמי של ATN (המבוטא שיעור tubules נמקים) מאשר את הרמה המוגברת של פגיעה עם משך גובר של איסכמיה. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM ונותחו על ידי בכיוון אחד ANOVA (**** = P ≤ 0.0001). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 4 התחדשות - תפקוד כליות מתאושש בעקבות איסכמיה כליות AG עכברי FVB זכר.ed 8-10 שבועות עברו כריתת כליה ימנית לפני 25 דקות של איסכמיה לכליה השמאלית. עכברים הוקרבו יום 1 (n = 10), 4 ימים (n = 10) או 7 ימים (n = 6) הבא IRI כליות. שני קריאטינין בפלזמה וחנקן אוריאה בדם יורדים בהתמדה במשך 7 ימים, עם קריאטינין בפלזמה חוזר לרמות בסיס, הממחיש את התאוששות בתפקוד הכלייתי. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM ונותחו על ידי בכיוון אחד ANOVA (*** = P ≤ 0.001, * = P ≤ 0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5 התחדשות -. רקמת הכליה מראה סימנים של התאוששות בעקבות רנה 8 איסכמיה l עכברי FVB זכר גיל -. 10 שבועות עברו כריתת כליה ימנית לפני 25 דקות של איסכמיה לכליה השמאלית. העכברים הוקרבו 4 ימים (n = 10) או 7 ימים (n = 6) הבא IRI הכליות. photomicrographs נציג (הגדלה: 200x) של OSOM בעקבות האינדוקציה של איסכמיה מוצג. ניקוד רשמי של מספר בריא, מתאושש, נפגע או tubules נמקים בתוך OSOM הוערך בסעיפי פרפין PAS מוכתמים. ביום 4 הבאים IRI כליות חלק גדול מtubules בתוך OSOM עדיין מופיע נפצע. עם זאת ב 7 ימים יש עלייה ניכרת בחלקם של צינוריות המסווגים כבריאים או מחלים מעידים על התחדשות כליות. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 6 התחדשות - ריבוי צינורי דרמטי הוא 4 ימים מאליי הבאים איסכמיה כליות עכברי FVB זכר בגילי 8 -. 10 שבועות עברו כריתת כליה ימנית לפני 25 דקות של איסכמיה לכליה השמאלית. BrdU (50 מ"ג / קילוגרם) היה מנוהל על ידי זריקת intraperitoneal 24 שעות שקדמה להקרבה. העכברים הוקרבו 4 ימים (n = 10) או 7 ימים (n = 6) הבא IRI הכליות. photomicrographs נציג (הגדלה: 200x) של OSOM מעכברים הקריב ביום 4 וביום 7 בעקבות האינדוקציה של איסכמיה מוצגים. התפשטות תאים צינוריים הוערכה על ידי מכתים immunohistochemical לBrdU על סעיפי כליות פרפין מוטבעים. התפשטות תאים צינוריים הייתה לכמת ידי ספירת מספר הגרעינים חיוביים BrdU בOSOM עם התפשטות תאים מוגברותניכר ביום 4. נתונים שהוצגו כממוצע ± SEM ונותחו על ידי סטודנטים מבחן t (*** = P ≤ 0.001). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7. שמאל כליות איסכמי עם כלי דם כליות אינם occluded נוספים. אי לחסום כלי דם נוספים באספקת הכליות מובילים לאיסכמיה עולה בקנה אחד. (א) היעדר איסכמיה כליה עולמית שצוין על ידי שינוי צבע לא אחיד (חץ לבן), כאשר סרטון serrafine מיקרו הוא בעמדה. (ב) בעקבות הסרת סרטון serrafine מיקרו, עורק הכליה הראשי והווריד גלויים (חץ לבן) יחד עם כלי דם נוספים באספקתהמוט האמצעי ותחתון של הכליה (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IRI כליות הוא גורם חשוב של AKI ללא טיפול ספציפי זמין. מחקר ניסיוני של IRI הכליות היה אינפורמטיבי מאוד עם העבודה קודמת הוכיחה את התפקיד של מקרופאגים, תאים הדנדריטים, לימפוציטים, תאים אחרים תאי T רגולטורים, כמו גם ומגשרים באינדוקציה של שניהם פגיעה חריפה וריפוי שלב 5,8 - 16. בנוסף, IRI כליות הניסוי נעשה שימוש כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים טיפוליים שונים 4,17-19.
המודל של IRI כליות המפורטים כאן משתמש בגישת laparotomy קו האמצע לבצע כריתת כליה תקין ולגרום לאיסכמיה בכליה השמאלית באמצעות מהדק. כפי שעולה מתוצאות הנציג, שינוי משך איסכמיה יכולה לשלוט על חומרת פגיעה. לכן מודל זה יכול להיות מותאם כדי לגרום לקל, בינוני או רמה גבוהה של פגיעה בכליות כנדרש בשאלה הניסיונית שהוצגה. עם זאת, הגבלה של המודל הזה היא שהואאינו מתאים לאינדוקציה של פגיעה בכליות חמורה מאוד על ידי איסכמיה כליות ממושכת. ההפרעות בתפקוד הכליות כתוצאה חמורות חריפות עלולות להוביל לתמותה משמעותית.
ישנם כמה היבטים של מודל זה שהם קריטיים על מנת להשיג פגיעה בכליה צפויה ושחזור. מקור עיקרי אחת של השתנות עם מודל זה יכול לנבוע מטמפרטורת הגוף בתקופת איסכמי 20. לכן זה חיוני שטמפרטורת גוף נשמרת ברמה קבועה ומעקב לאורך תקופה איסכמי. בפרוטוקול זה יחידת בקרה עם בדיקות טמפרטורה ושמיכת homoeothermic שימשה לווסת אוטומטית את טמפרטורת גוף על 37 ° C. ההשפעה של טמפרטורת גוף ברגישות של הכליות לפגיעה איסכמית מתוארת היטב. העבודות קודמות הראו כי טמפרטורת גוף משפיעה על חומרת IRI כליות 20 ווריאציה בטמפרטורת הגוף של העכברים היא בלבול פוטנציאליגורם שעשוי להשפיע על הפרשנות של התוצאות. שיקול חשוב נוסף הוא שעכברים עשויים להפגין וריאציה אנטומית עם כלי דם נוספים המספקים את הכליה השמאלית. זה קריטי, כי כלי דם נוספים כגון מזוהים ויחסמו בעת ביצוע כריתת הכליה תקין וגרימת איסכמיה הגלובלית בכליה השמאלית. הימנעות מלעשות זאת תגרום לאיסכמיה עקבית לאורך כל הכליה. באופן דומה, שינוי הצבע של ההידוק הבא הכליה השמאלית של גבעול הכליה השמאלי יש לבחון בזהירות בהיעדר שינויי צבע עולמי מרמזת על הנוכחות של עורק כליה נוסף שלא זוהה בתחילה.
בניגוד לדגמים שעושים שימוש באיסכמיה כליות דו צדדית, מודל זה יהיה עניין לחוקרים המשתמשים בממשל מניעתי של תרופות סמים או סוכנים אחרים כדי לווסת את הביטוי של גנים, חלבונים ועוד לפני פציעת כליות. האסדהרקמת כריתת כלית ht יכולה לשמש לשניהם לאשר ולכמת את רמת אינדוקציה או העיכוב של המולקולה של ריבית בכל בעלי חיים ניסיוניים בודדים. מודל זה גם יהיה עניין לחוקרים לומדים התחדשות כליות כשלב פגיעה החריף ואחריו התפשטות צינורי בולטת.
בחלק מהדגמים הניסיוניים של דלקת כליות מוגבלים כמחלה משמעותית יכולה להיגרם רק בזנים מסוימים של עכברים. לעומת זאת, המודל של IRI כליות מתואר כאן הוא תכליתי ויכולים להיות מיושם גם זכר 5 ו 4 נקבות עכברים, זנים שונים של עכברים, כמו גם עכברים בגיל 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
