Abstract
腎臓虚血再灌流障害（IRI）は、患者の急性腎臓損傷（AKI）の一般的な原因であり、腎臓の血流の閉塞は、腎移植の際に避けられない。正確かつ再現性腎IRIを再現実験モデルは、AKIの病態生理及び新規治療薬の開発の分析において重要である。ここで紹介するには、再現可能な、AKI、その結果、腎IRIのマウスモデルである。これは、左腎臓の虚血を誘発する左腎椎弓のコントロール組織とクランプを提供して右腎摘出術の両方を許可する1切開で手術のための正中開腹アプローチによって達成される。虚血期間中のクランプ位置及び体温を注意深く監視することによって、このモデルは、再現性の機能的および構造的損傷を達成する。マウスは、血清または血漿クレアチニン値の上昇だけでなくて、腎機能の喪失を実証手術後24時間を犠牲に構造明らか急性尿細管壊死とtural腎臓損傷。腎機能は改善し、急性組織損傷は、このモデルは、腎臓再生を研究するために使用することができるように、腎臓IRI次の7日間の過程の間に解決されます。腎臓IRIのこのモデルは、分子·細胞AKIの病態だけでなく、その後の腎再生の分析を研究するために利用されている。
Introduction
虚血再灌流障害（IRI）は、腎臓、心臓や脳を含む複数臓器傷害の一般的なモードです。腎臓IRIが患者の急性腎障害（AKI）につながる可能性や特定の治療法はありません。 IRIの結果、AKIは自然免疫と獲得免疫応答の1の両方を含む複雑な病因を持っています。腎臓IRIの実験モデルは、AKIの病因と同様に、その後の日にわたって続いて起こるその後の腎再生に関与する重要な細胞やメディエーターを解剖する可能性を提供しています。さらに、疾患プロセスの際に新規な治療剤の効果を評価することができる。
腎臓IRIの実験モデルの全体的な目標は、ここで説明し、急性機能的および構造的腎障害を誘発することがある。一部の研究者は、両側IRI 2の誘導を伴うモデルを利用している。両側腎IRIモデルは、使い一方的RENですが、らIRIモデルは、手術時に実施されて右腎摘出術の利点を有する。右腎摘出組織は、そのいずれか又は誘導する遺伝子またはタンパク質の発現を抑制する前処理工程を含む研究における貴重な対照組織として機能する。例えば、我々はヘムアルギン酸（HA）24時間の腎臓IRI 3前の注射の前処理効果を評価するためにこのモデルを使用している。 IRIの前にHAによって細胞保護酵素ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）の成功した誘導は、右腎摘出コントロール組織4で確認された。 HAは、HO-1依存性機構を介して部分的には、老齢マウスでは腎臓IRIを減少させた。同様に、我々は、腎臓IRI 5におけるマクロファージの役割を調べるためにマクロファージ枯渇研究においてモデルを使用している。右腎摘出組織の免疫組織化学的分析は、アブレーションの方法の有効性を確認するために使用することができる。右腎摘出組織は、そのための確認の両方に使用し、私のレベルを定量化することができますnductionまたは個々の実験動物における目的の分子の阻害。このモデルは、前の腎臓IRIの誘導遺伝子またはタンパク質などの発現を調節する薬物または他の化合物を使用している研究者にとって興味深いであろう。
他の研究は、腎臓へのアクセスにフランク切開を使用している。ここで説明するモデルは、右腎摘出術の両方を実行し、左腎臓の虚血再灌流を誘導するために、単一の正中腹部の手術を使用しています。この外科的アプローチは、腎茎クランプに続く腎茎や色の変更など、術野の優れた可視化を提供します。モデル4-6と当方の経験では、マウスはすぐにほぼ100％の生存率は手術から回復ことを示しています。
最後に、7日間にわたってモデルの動力学的分析は、このモデルは腎機能および管状の整合性の両方の回復を呈することを示す、と重要な管状の細胞増殖。
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Protocol
注：動物実験は動物（科学的処置）法1986によって課せられたガイドラインおよび規制に準拠して実施された手続きは、滅菌（オートクレーブ処理）手術器具や消耗品を使用して行われた。最適な年齢た状態で、15週 - 腎臓IRIのマウスモデルがここに提示されている間は、8週齢の雄、それが再現可能通常は7歳までの男女どちらかのマウス系統のさまざまな実行することができますBALB / cマウスで実施した8週間。代表的な結果の項に示されたデータは、BALB / cマウスおよびFVBマウスの両方から得た。温めた生理食塩水の適用は、湿った腸および手術領域を保持するために使用されるが、流体の過剰なアプリケーションが重要である血清または血漿クレアチニン濃度の低下アーチファクトを引き起こし得るように注意深く監視され、最小に保たれるべきである実験読み出し。
1。動物の準備および開腹
<OL>2。尿管本部、右腎摘出
- 静かに右の腎臓と尿管を露出させ、生理食塩水で湿らせたオートクレーブした滅菌綿棒を使用して腹腔の左側に向かって腸を押してください。乾燥を防ぐために湿らせたドレープと腸をカバーしています。
- 角度のついたピンセットで右尿管を持ち上げます。 6/0 SILを使用して二度、右尿管を結紮K-編組縫合。長期的な実験のために、すべての腹部手術のための吸収性縫合糸を使用しています。
- 縫合糸の間に尿管を分割。膀胱尿管接合部が膀胱から腹膜に漏れる尿を防ぐ必要がありながら、尿管は、長期実験中、手術後の漏洩に対する保護手段として連結する。
- 右腎摘出術を行う際に簡単にアクセスを許可するように、ゆっくりと湿らせた綿棒を使用して、右の肝臓を押して右腎動脈と静脈を露出させ湿らせたガーゼを使用して所定の位置に保持する。
- ぶっきらぼうな限り右腎動脈と静脈、右腎の内側面に沿って結合組織と脂肪を解剖。
- 慎重に血管の下に角度のついた鉗子をスライドさせることで腎動脈と静脈の下にチャネルを作成します。ヒントを閉じて静かにチャネルの形成を容易にするために開いたヒントを削除して下に鉗子を導く。
- 鉗子の先端がちょうど腎動脈と静脈上記の結合組織を通して見えるまで、ステップ2.6を繰り返します。一回目に見える優しく優しく結合組織を破壊するために角度のついた鉗子の別のセットの先端に対する鉗子の先端をこする。
- 腎動脈と静脈を明確にアクセスできると、彼らは今閉塞することができます。慎重にヒントを閉じた状態で、腎動脈と静脈の下に角度のついた鉗子をスライドさせます。一度場所で鉗子の先端を開き、先端間の止血クリップアプリケータを導き、しっかりと腎動脈と腎臓に近い静脈に止血クリップを適用します。あるいは腎動脈と静脈は、6/0シルク編組縫合糸を用いて結紮することができる。
- 今残っている接着性の結合組織を除去することができ、腎臓の近くに閉塞した腎動脈と静脈を分割します。
- 肝臓を保持し、綿棒で腸を置き換えるために使用される任意のガーゼを取り除きます。
- そっと左腎臓と尿管を露出し、湿らせたドレープでカバーするために綿棒と腹腔の右側に向かって腸を押してください。必要であれば、膵臓はより容易なアクセスを可能にするために湿らせたガーゼで偏向させることができる。
- 優しく結合組織が前方および後方左腎動脈と静脈をした後、尿管本部、右腎摘出ステップ2.4と同様の方法で船の下にチャンネルを作成破る鈍い切開を使用しています。
- 腎動脈と静脈にマイクロserrafineクリップを適用することで、左腎臓の虚血を誘発する。成功した虚血は、視覚的に腎臓が徐々に均一な暗色化することによって確認することができる。左腎動脈および静脈に加えて、血管が時折腎臓を供給することができる。存在する場合、これらの追加の血管にも成功するために、マイクロserrafineクリップを使用して閉塞する必要があります全体腎臓の虚血を誘発する。
- 腸を交換して、慎重に腸の虚血の妥協の結果につながる可能性が急激ねじれがないことを確認してください。一時的に、単一の縫合糸で腹膜を閉じます。
- 虚血誘導の後にはすぐに虚血に必要な期間を37℃で体温を維持する制御装置に接続され、直腸サーミスタ恒温ブランケット上にマウスを置きます。腎障害や腎不全の所望の程度を誘導するために必要な虚血の適切な長さを定義するには、滴定を各菌株と術者のために実行することをお勧めします。
- まもなく虚血期間の終了前に腹膜を再度開き、慎重にクランプへのアクセスを可能にし、腎臓を表示するには、腸を配置。開創器の挿入は、ビデオに示すように、必要ではなく、単に表象的な目的のために実施した。
- CLを削除虚血期間の後アンペアは締結しています。すぐに除去した後に、腎臓は急速に成功した再灌流を示す健全な濃いピンクに濃い栗色から色が変わります。
- 再び腸前6/0編組絹縫合糸を使用したブランケットステッチで腹膜を閉じるにねじれていないことを確認してください。その後、金属の皮膚クリップを用いて皮膚を閉じます。
- 術後感染のリスクを最小限に抑えるために、このような外科領域へのヨウ素/アルコール溶液などの消毒を適用します。
4。術後の回復とケア
- アチパメゾール塩酸塩（2 mg / kg）の皮下投与と部分的に逆麻酔し、1mlの皮下注射で流体を投与手術後の脱水を防ぐために生理食塩水を加温した。
- 彼らは意識を回復するまで、慎重にマウスを監視、警告が表示され、自分自身を正しくすることができます。
- 29℃、LOCに保ったマウスは、加熱ボックスに回復することができ24時間、静かな環境でated。マウスは、麻酔に温度調節する能力の障害を持っているし、それは彼らが効果的な復旧を可能にするために高温で収納されていることが非常に重要です。湿らせた食品はまた、流体と栄養摂取を促進するために提供することができる。
- 長期的な回収実験は、継続的な鎮痛薬を提供し、手術後7日間、皮膚のクリップを削除するため。
5。機能的および構造的腎損傷と再生の評価
- 血液は、実験終了時に安楽死の時点で実験中または心臓穿刺により尾静脈から採取してもよい。先に説明したように7生化学遠心分析に基づく方法クレアチナーゼ、および血中尿素窒素（BUN）を用いて、血清クレアチニンによって腎機能を測定する。正常な健康なマウスの腎機能がこのような腎不全のモデルを確立する前に決定する必要があることdependi著しく変化することができるヤッフェ反応およびクレアチニンを測定するためのクレアチナーゼ基づく方法例えば使用した分析方法のNGは異なる結果を与える。
- ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）または過ヨウ素酸シッフ（PAS）で染色したパラフィン包埋腎臓組織切片上の組織病理で腎の構造を調べます。各マウスについて外部髄質（OSOM）の外側のストライプ内200Xの倍率で10枚の画像 - 5の間にキャプチャします。この領域は、このモデルで負傷したように、それが低酸素症に非常に脆弱であるため、OSOMにおける損傷のレベルを評価する。
- 急性尿細管壊死（ATN）または再生を測定するために、以下に詳述2スコアリングシステムのいずれかを使用します。これらのシステムで使用される分類の代表的な形態は、 図1に示されている。
- ATNを獲得する単純なバイナリシステムを使用してください。細胞の完全性と形態マークを基に、生（無傷の細胞形態学）または壊死（妥協細胞統合のいずれかとして細管を数えるgrity、異常な細胞形態や細胞の喪失）。
- 細管の合計数（壊死性細管の％）の割合として、壊死細管の数を表現しています。
- 細胞の完全性、形態および核数に基づいて、別のシステムを使用して再生を分類します。マークとカウント細管など、健康的な壊死性、負傷したか、次の手順に記載されている基準に従って回収することを含む。
- （ステップ5.4で詳述）ATNスコアリングシステムと同様に危険にさらさ細胞の完全性を示す尿細管ながら健康な無傷の正常細胞とマーク細管は、異常な細胞形態や明白な細胞の損失は、壊死したとして採点されるべきである。
- 負傷したように、彼らはいくつかの核を含む薄くなった細胞質を持っている場合細管を分類する。これとは対照的に、回復し、より正常な細胞形態を有するより多くの核を含む細管を指定します。
- 総細管数の割合として各細管分類を表現しています。
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Representative Results
細管障害および回復は、腎臓IRI後の組織切片のH＆E又はPAS染色により評価することができる。 OSOM内にある細管は、細胞の形態、整合性と核の数（ 図1）によると、健康的な怪我、壊死または回復に分類される。このモデルでは機能的および構造的損傷は虚血の持続期間に依存している。虚血の持続時間が（ 図2）の 2分ずつ増加されるように、血漿クレアチニンおよびBUNによって評価腎機能障害の重症度の進行性の増加は、明らかである。 ATNスコアから推定された構造的な腎障害の程度は、より長時間の虚血に伴うより厳しいATN（ 図3）と同様の傾向をたどる。虚血の変化する持続時間の最初の滴定の後、腎臓IRIのこのモデルは、surger以下の機能的および構造的損傷の両方を開発した全てのマウスで、ほぼ100％の成功率を達成するべきであるY。腎臓IRIのこのモデルはまた、動物（ 図2、図3）の間で観察され、限られ変動が損傷の程度を細かく制御できるようになります。虚血の異なる期間の使用は傷害の重症度の異なるレベルを調節する能力を調べるために治療的介入を可能にします。例えば、虚血の長さに基づいて得られた損傷は（22分）または高（24分）（20分）、軽度、中等度として分類することができる。オスのBALB / cマウスを、8週齢の唯一の指針として含まれているため、これらの値は次のとおりです。これらのマウス系統、年齢、性別、腎機能を評価するために使用する生化学的アッセイによって異なるように研究者らは、独自の実験条件を確立すべきである。
このモデルは成功しその後日間で回復し、腎機能と構造の両方で腎臓IRIを次の再生を研究するために使用されています。血漿クレアチニン及びBUNのレベルが徐々に減少はOBSである7日目までに基礎レベルに戻った血漿クレアチニン（ 図4）と、erved。 H＆E染色した組織切片の評価は、細管の数の増加は、健康な又は組織再生（ 図5）が行われていることを示す4日目と比較して7日目に回収するとして分類されることを示している。屠殺前に5 - ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の投与は、BrdUおよび管状細胞増殖のその後の定量化のための腎組織の免疫染色を容易にする。劇的な核のBrdU発現は、細管は尿細管の完全性および機能（ 図6）を復元するためにマークされた細胞増殖を受けていることを示す腎臓IRI次の4日間観察される。腎機能評価の組み合わせは、構造的な改善およびBrdU免疫染色のスコアは、腎臓IRI次の再生を研究するために使用されるこのモデルを可能にします。これは、治療介入の長期的影響は、であることを可能にするvestigated。
最後に、このモデルの有用性は、全体の腎臓へのグローバルな虚血の誘発に依存し、これは中心の左腎動脈に加えて、腎臓を供給する血管の存在によって危険にさらされてもよい。これらの追加の容器がクランプされていない場合には、腎臓の一部が虚血性損傷（ 図7）にさらされることはありません。
図1の構造細管障害と再生のスコア- 。健康で、回復し、負傷し、壊死性細管の代表的な形態は 、腎臓からの組織切片を、腎IRI次の4日間を削除は、評価のためのPASで染色する。 OSOM内にある細管はによると、健康的な怪我、壊死または回復に分類されている代表的な例で、細胞の形態、整合性と核の数を強調した。健康的な細管は、正常な細胞形態を有する完全な状態である。尿細管壊死性が明らか細胞喪失および細胞形態学の損失と妥協単層を示す。負傷した細管は、薄くなった携帯単層を示し、少数の核を含んでいる。これとは対照的に、回復細管は健康的な細管により正常な細胞形態および核同様の数を示す。倍率：400X この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2傷害-腎虚血は腎機能を損なう雄性BALB / cマウス8週齢、右腎摘出を受け、左腎茎は20、22または24分（群当たりn = 4）のために固定した。マウスは腎臓IRI次の24時間後に屠殺した。虚血の長さが増加するにつれて、血漿クレアチニンおよび血中尿素窒素は、重症度の増加傾向を示している。点線は、正常対照マウスに見出さ血漿クレアチニンおよび血液尿素窒素のレベルを表す。平均±SEMとして提示し、一元配置分散分析によって解析されたデータは、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3損傷- 。腎虚血は、意味のある急性尿細管壊死を誘導 8週齢の雄性BALB / cマウスは、右腎摘出術を施行し、左腎弓根はCLだった。20,22又は24分間怒っ（群あたりn = 4）。マウスは腎臓IRI次の24時間後に屠殺した。代表的な顕微鏡写真：制御と負傷者腎臓のH＆E染色された腎臓切片からOSOMの（倍率200倍）はATNを示しています。 （壊死性細管の割合として表される）ATNの正式な得点は、虚血の増加期間と傷害のレベルの増加が確認される。データは平均±SEMとして提示し、一元配置分散分析（**** = P≤0.0001）で分析した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4再生- 。腎機能が腎虚血次の回復オスFVBマウスAG。ED 8から10週間は左腎臓の前に虚血の25分に右腎摘出を受けた。マウスを、4日間（n = 10）に、又は7日間（n = 6） の腎臓IRI以下、1日た（n = 10）を屠殺した。血漿クレアチニンおよび血中尿素窒素の両方が着実に血漿クレアチニンは腎機能の回復を示す、基礎レベルに戻って、7日間にわたって低下する。データは平均±SEMとして提示し、一元配置分散分析（*** = P≤0.001、* = P≤0.05）で分析した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5の再生-腎組織はレナ後の回復の兆しを示しています 。L虚血男性FVBマウス歳8から10週間は左腎臓の前に虚血の25分に右腎摘出を受けた。マウスを、4日間（n = 10）に、又は7日に屠殺した（n = 6）腎臓IRI下記た。代表的な顕微鏡写真（倍率：200倍）OSOMの虚血の誘導後に表示されます。 OSOM内、健康、回復、怪我または壊死細管の数の正式な得点は、PAS染色パラフィン切片で評価した。 4日目に腎IRI次OSOM内管の大部分は、まだ負傷者が表示されます。しかし7日目までに、健康や腎臓の再生の指標の回復に分類され、尿細管の割合のかなりの増加がある。平均±SEMとして提示されるデータは、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6再生- 。劇的な管状の増殖が腎臓虚血次の4日間は明らかであるオスFVBマウス8歳の- 。10週間前、左の腎臓に虚血の25分に右腎摘出を受けた。 BrdUを（50ミリグラム/ kg）を犠牲にする24時間前に、腹腔内注射によって投与した。マウスを、4日間（n = 10）に、又は7日に屠殺した（n = 6）腎臓IRI下記た。代表的な顕微鏡写真（倍率：200倍）したマウス由来のOSOMのは、虚血の誘導後4日目と7日目に屠殺が表示されます。管状の細胞増殖は、パラフィン包埋腎切片上でのBrdUのための免疫組織化学的染色によって評価した。尿細管細胞の増殖は、細胞増殖の増加とOSOMにおけるBrdU陽性核の数を数えることによって定量した4日目に明らかなデータは、平均値±SEMを発表し、学生のt検定 （*** = P≤0.001）で分析した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図7。非閉塞追加腎血管に血性腎臓を残しました。腎臓を供給、追加の血管を閉塞しないと、一貫性のない虚血につながる。マイクロserrafineクリップが所定の位置にあるときに（A）グローバル腎臓虚血の不存在は、不均一な色の変化（白矢印）で示されている。 （B）マイクロserrafineクリップを除去した後、主腎動脈と静脈を供給、追加の血管と一緒に（白矢印）が表示され腎臓（黒矢印）の中·下極。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
腎臓IRIが使用可能な特定の治療とAKIの重要な原因である。腎臓IRIの実験的研究は、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、制御性T細胞だけでなく、他の細胞および急性損傷と位相5,8癒しの両方の誘導におけるメディエーターの役割を示す以前の研究で非常に有益でした- 16。また、実験的腎IRIは、様々な治療薬4,17-19の効果を評価するために使用されている。
ここで詳述腎臓IRIのモデルは、右腎摘出術を行い、クランプを使用して、左の腎臓に虚血を誘発するために正中開腹アプローチを使用しています。代表的な結果によって示されるように、虚血の持続時間を変更すると、損傷の重症度を制御することができる。したがって、このモデルが提起実験かごの必要に応じて、軽度、中等度または腎臓損傷の高いレベルを誘導するために調整することができる。しかし、このモデルの限界はあるit長期の腎臓虚血による非常に厳しい腎障害の誘導には適していません。その結果、重度の急性腎不全は、重大な死亡につながる可能性があります。
予測可能かつ再現性の腎傷害を達成するために重要であるこのモデルのいくつかの側面がある。このモデルでは変動性の一つの主要な供給源は、虚血期間20の間、体温から発信することができます。これは、体温を一定に維持し、虚血期間を通じて監視されることが不可欠である。このプロトコルでは、温度プローブおよび恒温ブランケットを有する制御ユニットは、37℃で自動調節する体温に使用した虚血傷害に対する腎臓の感受性に体温の影響はよく記載されている。以前の研究は、体温が腎臓IRI 20の重篤度に影響することが示されており、マウスの体温の変動は、潜在的な交絡ある結果の解釈に影響を与える可能性が要因。別の重要な考慮事項は、マウスが左腎臓を供給する付加的な血管の解剖学的変化を示す可能性があることである。それは、このような追加の血管が特定され、右腎摘出術を行い、左腎臓のグローバル虚血を誘発する際に閉塞することが重要です。これを怠ると、腎臓全体に一貫性のない虚血になります。グローバル色の変化がないことが最初に確認されていなかった追加の腎動脈の存在を示唆しているのと同様に、左腎椎弓の左腎臓次のクランプの色の変化を慎重に精査する必要があります。
両側性腎臓虚血を利用するモデルとは対照的に、このモデルは、遺伝子の発現を調節する医薬品又は他の薬剤の予防的投与を使用している研究者が興味を持つであろう、タンパク質等の前腎損傷する。リグhtの腎摘出組織は確認の両方に使用され、誘導または個々の各実験動物において目的の分子の阻害のレベルを定量化することができる。急性損傷相が顕著管状の増殖が続いているように、このモデルでは、腎臓の再生を研究する研究者を対象としています。
重大な疾患にのみ、マウスの特定の株に誘導することができるように腎臓の炎症のいくつかの実験モデルが制限されています。対照的に、腎臓IRIのモデルは、ここで説明は、用途が広く、雄および雌5匹のマウス4、マウスの異なる株、ならびに老齢マウス4の両方に適用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
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