Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

La isquemia reperfusión renal: un modelo de ratón de la lesión y regeneración

Published: June 7, 2014 doi: 10.3791/51816

Abstract

Renal lesión por isquemia de reperfusión (IRI) es una causa frecuente de lesión renal aguda (LRA) en pacientes y oclusión del flujo sanguíneo renal es inevitable durante el trasplante renal. Los modelos experimentales que precisa y reproducible recapitulan IRI renal son cruciales en la disección de la fisiopatología de la lesión renal aguda y el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. Se presenta aquí un modelo de ratón de IRI renal que resulta en reproducible AKI. Esto se consigue mediante un enfoque de la laparotomía de la línea media para la cirugía con una incisión que permite tanto una nefrectomía derecha que proporciona tejido de control y de sujeción del pedículo renal izquierda para inducir isquemia del riñón izquierdo. Por un control cuidadoso de la posición de sujeción y la temperatura corporal durante el período de isquemia este modelo alcanza una lesión funcional y estructural reproducible. Ratones sacrificados 24 horas después de la cirugía demostrar la pérdida de la función renal con la elevación del nivel de creatinina en suero o plasma, así como estructurasdaño renal estructural con necrosis tubular aguda evidente. La función renal mejora y la lesión tisular aguda se resuelve en el transcurso de 7 días después de IRI renales tales que este modelo puede ser usado para estudiar la regeneración renal. Este modelo de IRI renal se ha utilizado para estudiar la fisiopatología molecular y celular de AKI así como el análisis de la regeneración renal posterior.

Introduction

La isquemia lesión por reperfusión (IRI) es un modo común de lesión para múltiples órganos, incluyendo el riñón, corazón y cerebro. Renal IRI puede conducir a una lesión renal aguda (LRA) en pacientes y no hay tratamiento específico disponible. AKI como resultado de IRI tiene una patogénesis complicado que implica tanto la respuesta inmune innata y adaptativa 1. Un modelo experimental de IRI renal ofrece el potencial para diseccionar las células clave y mediadores implicados en la patogénesis de la lesión renal aguda, así como la regeneración renal posterior que se produce en los días subsecuentes. Además, los efectos de los agentes terapéuticos novedosos sobre los procesos de enfermedad pueden ser evaluados.

El objetivo general del modelo experimental de IRI renal se describe aquí es para inducir tanto la lesión aguda del riñón funcional y estructural. Algunos investigadores han utilizado un modelo que implica la inducción de IRI bilaterales 2. Aunque el modelo bilateral IRI renal es de uso, el ren unilateralmodelo al IRI tiene la ventaja de una nefrectomía derecha está llevando a cabo en el momento de la cirugía. El tejido nefrectomía derecha sirve como valiosa tejido de control en los estudios que implica una etapa de tratamiento previo que induzca o suprime la expresión de un gen o proteína. Por ejemplo, hemos utilizado este modelo para evaluar los efectos de preacondicionamiento de arginato hemo (HA) de inyección de 24 horas antes de IRI renal 3. La inducción exitosa de la enzima citoprotector hemo-oxigenasa-1 (HO-1) por HA antes de IRI se confirmó en el tejido de control nefrectomía derecha 4. HA reduce IRI renal en ratones viejos, en parte, a través de un mecanismo de HO-1 dependiente. Del mismo modo, se ha utilizado el modelo en estudios de agotamiento de los macrófagos para examinar el papel de los macrófagos en el IRI renal 5. El análisis inmunohistoquímico del tejido nefrectomía derecha se puede utilizar para confirmar la eficacia de la metodología de la ablación. Por consiguiente, el tejido de nefrectomía derecha se puede utilizar para confirmar y cuantificar el nivel de induction o inhibición de la molécula de interés en cada animal de experimentación individuo. Este modelo será de interés para los investigadores que están utilizando medicamentos u otros compuestos que modulan la expresión de genes o proteínas, etc antes de la inducción de la IRI renal.

Otros estudios han utilizado incisiones flanco para acceder a los riñones. El modelo descrito aquí utiliza una sola cirugía abdominal en la línea media para llevar a cabo tanto la nefrectomía derecha e inducir isquemia reperfusión del riñón izquierdo. Este abordaje quirúrgico proporciona una excelente visualización del campo quirúrgico que incluye los pedículos renales y cambios de color que siguen de sujeción pedículo renal. Nuestra experiencia publicada con el modelo 4-6 indica que los ratones que se recuperan rápidamente de la cirugía con una tasa de supervivencia de casi el 100%.

Por último, el análisis cinético del modelo durante un período de 7 días indica que este modelo presenta la restauración de tanto la función renal y la integridad tubular, conla proliferación de las células tubulares significativa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA:. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos y regulaciones impuestas por la Ley de 1986 Animales (Procedimientos Científicos) Los procedimientos se llevaron a cabo utilizando (en autoclave) instrumentos y consumibles quirúrgicos estériles. Mientras que el modelo murino de IRI renal presenta aquí se realizó en un ratón Balb / c que puede aplicarse de forma reproducible en una variedad de cepas murinas de cualquier género típicamente entre 7 8 semanas de edad, macho - 15 semanas, siendo el óptimo edad 8 semanas. Los datos presentados en la sección de resultados representativos se obtuvo de tanto ratones Balb / c y ratones FVB. La aplicación de la solución salina calentada se utiliza para mantener los intestinos y el área quirúrgica húmedo, pero que se debe monitorizar cuidadosamente y se mantiene a un mínimo como la aplicación excesiva de líquidos puede conducir a una reducción de los artefactos del suero o plasma los niveles de creatinina, que es un importante lectura experimental.

1. Preparación de los animales y laparotomía

<ol>
  • Se anestesia el ratón con clorhidrato de ketamina (70 mg / kg) y clorhidrato de medetomidina (1 mg / kg) por vía intraperitoneal y confirmar la profundidad de la anestesia por la pérdida de los reflejos por ejemplo pizca dedo del pie. La duración del plano anestésico resultante es de 4 horas. Esto es suficiente para llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico y no se requiere anestesia suplementaria.
  • Quite el pelo que rodea el área de la incisión, asegúrese que el área esté libre de cabello suelto, y desinfectar la piel del abdomen con una solución de clorhexidina diluida.
  • Coloca el ratón sobre un cojín quirúrgico climatizada en posición supina y fijar los miembros superiores e inferiores a la plataforma con cinta adhesiva de baja adherencia. Asegúrese de que las extremidades superiores se mantienen en una posición normal para evitar la compresión de pulmón. Durante todo el procedimiento monitorizar el ratón para quemaduras térmicas. Si es posible, se recomienda utilizar una fuente de calor no eléctrica.
  • Administrar el hidrocloruro de buprenorfina analgésica (0,06 mg / kg)subcutánea y aplicar lubricante ocular para los ojos para evitar que se seque la córnea. Los analgésicos se administran antes de la cirugía con el fin de ayudar a la recuperación post-quirúrgica.
  • Uso de una hoja de bisturí de separación tijeras tejido o hacer una incisión de laparotomía media y sin rodeos separa la piel del peritoneo. Esto permite que la piel y el peritoneo a ser suturadas por separado durante el cierre de la herida. Una incisión de la línea alba avascular se hace que da acceso a la cavidad peritoneal.
  • Para crear una vista clara del área quirúrgica insertar un retractor y cuelgue el ratón.
  • 2. División del uréter y nefrectomía derecha

    1. Empuje suavemente los intestinos hacia el lado izquierdo de la cavidad abdominal con hisopos de algodón esterilizados en autoclave humedecidos con solución salina para exponer el riñón derecho y el uréter. Cubra los intestinos con cortinas humedecidas para evitar la desecación.
    2. Levante el uréter derecho con una pinza en ángulo. Se une el uréter derecho dos veces con 6/0 silsutura trenzada a k. Para los experimentos a largo plazo, utilizar suturas absorbibles para todas las cirugías abdominales.
    3. Divida el uréter entre las suturas. Mientras que la unión vesicoureteral debe evitar que la orina se escape en el peritoneo de la vejiga al uréter se une como una salvaguarda contra cualquier fuga después de la operación durante los experimentos a largo plazo.
    4. Para permitir un acceso más fácil al realizar la nefrectomía derecha, empuje suavemente hacia arriba hígado y hacia la derecha con un bastoncillo de algodón humedecido y mantener en su lugar con una gasa humedecida para exponer la arteria renal derecha y la vena.
    5. Francamente diseccionar el tejido conjuntivo y la grasa a lo largo de la cara medial del riñón derecho hasta la arteria renal derecha y la vena.
    6. Crear un canal debajo de la arteria renal y la vena deslizando cuidadosamente las pinzas en ángulo por debajo de los vasos sanguíneos. Guía de los fórceps por debajo con las puntas cerradas y retire suavemente con la punta abierta con el fin de facilitar la formación de la canal.
    7. Repita el paso 2.6 hasta que las puntas de la pinza son visibles a través de los tejidos conectivos justo por encima de la arteria y la vena renal. Una vez visibles frotar suavemente las puntas de la pinza contra la punta de otro conjunto de pinzas en ángulo para romper suavemente el tejido conectivo.
    8. Con la arteria renal y la vena claramente accesible que ahora pueden ser ocluidos. Deslice con cuidado forceps en ángulo por debajo de la arteria y vena renal con las puntas cerradas. Una vez en su lugar abrir las puntas de la pinza y guiar el aplicador del clip hemostático entre las puntas y firmemente aplicar un clip hemostático en la arteria y vena renal cerca de los riñones. Alternativamente, la arteria renal y la vena se pueden ligar utilizando sutura 6/0 de seda trenzada.
    9. Divida la arteria renal obstruida y la vena cerca del riñón, que ahora puede ser removido con cualquier tejido conectivo adherente restante.
    10. Retire cualquier gasa se utiliza para mantener el hígado y reemplazar los intestinos con hisopos de algodón.

    1. Empuje suavemente los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal con hisopos de algodón para exponer el riñón izquierdo y el uréter y cubrir con paños humedecidos. Si es necesario que el páncreas pueden ser desviados con una gasa humedecida para facilitar la tarea.
    2. Utilice una disección roma para romper suavemente los tejidos conectivos anterior y posterior a la arteria renal izquierda y la vena, y luego crear un canal por debajo de los buques en una manera similar a la descrita en la División del uréter y nefrectomía derecha el paso 2.4.
    3. Inducir la isquemia del riñón izquierdo mediante la aplicación de un clip de micro serrafine sobre la arteria y la vena renal. Isquemia exitosa puede ser confirmada visualmente por un oscurecimiento uniforme gradual del riñón. Los vasos sanguíneos en Además de la arteria renal izquierda y la vena ocasionalmente pueden suministrar el riñón. Si está presente, también tendrán que ser ocluida usando micro clips serrafine con el fin de éxito estos vasos sanguíneos adicionalesinducir isquemia de todo el riñón.
    4. Vuelva a colocar los intestinos y cuidadosamente asegurar que no hay giros bruscos que pueden conducir a resultados comprometedores isquemia intestinal. Temporalmente cerrar el peritoneo con una sola sutura.
    5. Después de la inducción de isquemia colocar inmediatamente el ratón sobre una manta homeotérmica con un termistor rectal conectada a una unidad de control que mantenga la temperatura corporal a 37 º C durante la duración requerida de la isquemia. Para definir la longitud adecuada de la isquemia necesario para inducir el grado deseado de lesión renal e insuficiencia renal se recomienda que se realice una valoración para cada cepa y el operador quirúrgico.
    6. Poco antes del final del período isquémico de re-abrir el peritoneo y cuidadosamente la posición de los intestinos para permitir el acceso a la abrazadera y ver el riñón. La inserción del retractor, como se muestra en el video, no es necesario y se lleva a cabo únicamente para fines de presentación.
    7. Retire el clamp después del período de isquemia ha concluido. Inmediatamente después de la extirpación del riñón va a cambiar con rapidez de color de un marrón oscuro a un color rosa oscuro sana indicando reperfusión exitosa.
    8. Una vez más asegurarse de que los intestinos no están trenzados antes de cerrar el peritoneo con una puntada manta usando 6/0 sutura de seda trenzada. A continuación, cierre la piel con clips metálicos de la piel.
    9. Para minimizar el riesgo de infección post-operatoria, aplicar un antiséptico tal como una solución de yodo / alcohol para el área quirúrgica.

    4. Recuperación y cuidado post-operatorio

    1. Anestesia parcialmente inversa con clorhidrato de atipamezol (2 mg / kg) por vía subcutánea y administrar líquidos con una inyección subcutánea de 1 ml de solución salina calentado para prevenir la deshidratación después de la cirugía.
    2. Controle cuidadosamente los ratones hasta que se hayan recuperado la conciencia, aparecerá la alerta y son capaces de enderezarse.
    3. Permitir que los ratones para recuperar en una caja climatizada mantuvieron a 29 ° C, locATED en un entorno tranquilo, durante 24 horas. Los ratones tienen un deterioro de la capacidad para regular la temperatura debido a la anestesia, por lo que es crucial que se alojan a una temperatura elevada para permitir la recuperación efectiva. Comida humedecida también se puede proporcionar para fomentar fluido y la ingesta de nutrición.
    4. Para los experimentos de recuperación a largo plazo proporcionan analgésicos en curso y eliminar clips de la piel 7 días después de la cirugía.

    5. Evaluación Funcional y Estructural Lesión del riñón y Regeneración

    1. La sangre se puede recoger de la vena de la cola durante los experimentos o por punción cardiaca en el momento de la eutanasia al final del experimento. Medir la función renal mediante la creatinina sérica, usando un método basado creatinasa, y el nitrógeno de urea en sangre (BUN) en un analizador centrífugo bioquímica como se ha descrito previamente 7. La función renal de los ratones sanos normales debe ser determinado antes de establecer un modelo de insuficiencia renal, ya que puede variar notablemente depending en el método de análisis utilizado por ejemplo, la reacción de Jaffe y métodos creatinasa basado para medir la creatinina dar resultados diferentes.
    2. Examinar la estructura renal por histopatología en secciones de tejidos embebidos en parafina de riñón teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) o ácido periódico de Schiff (PAS). Captura de entre 5 - 10 Imágenes aumento de 200x dentro de la franja exterior de la médula exterior (OSOM) para cada ratón. Evaluar el nivel de la lesión en el OSOM ya que esta región se lesiona en este modelo, ya que es altamente vulnerable a la hipoxia.
    3. Utilice uno de los dos sistemas de puntuación que se detallan a continuación para medir la necrosis tubular aguda (NTA) o regeneración. Morfología Representante de las clasificaciones utilizadas en estos sistemas se ilustra en la Figura 1.
    4. Utilice un sistema binario sencillo para anotar ATN. Sobre la base de la integridad celular y la marca de la morfología y contar túbulos como sea viable (morfología intacta de células) o necrótico (integración célula comprometidagridad, morfología celular anormal o pérdida de células).
      1. Expresar el número de túbulos necróticas como un porcentaje del número total de túbulos (túbulos necrótico%).
    5. Clasifique la regeneración utilizando otro sistema basado en la integridad celular, la morfología y el número de núcleos. Marcar y contar túbulos tan saludable, necrótico, lesionados o recuperándose de acuerdo con los criterios enumerados en los siguientes pasos.
      1. Al igual que con el sistema de puntuación ATN (se detalla en el paso 5.4) Marcar túbulos con células normales intactas como sanos, mientras que túbulos que muestran integridad de la célula comprometida, morfología celular anormal o pérdida de células abierta deben ser marcados como necrótico.
      2. Clasifique túbulos como heridos si tienen un citoplasma adelgazada contiene pocos núcleos. Por el contrario, designar túbulos que contienen más núcleos con más morfología celular normal como en recuperación.
      3. Expresa cada clasificación túbulo como un porcentaje del número total de túbulos.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Lesión tubular y la recuperación pueden ser evaluados por H & E o tinción PAS de las secciones de tejidos siguientes IRI renal. Túbulos situados dentro de la OSOM se clasifican como sano, lesionado, necrótico o recuperación de acuerdo con la morfología celular, la integridad y el número de núcleos (Figura 1). La lesión estructural y funcional en este modelo depende de la duración de la isquemia. Un aumento progresivo de la gravedad de la disfunción renal, evaluada por la creatinina plasmática y BUN, es evidente como la duración de la isquemia aumenta por incrementos 2min (Figura 2). La extensión de la lesión renal estructural, deducida de la puntuación ATN, sigue una tendencia similar con más severa ATN acompaña de isquemia más prolongado (Figura 3). Tras una valoración inicial de duración variable de isquemia, este modelo de IRI renal debe lograr una tasa de éxito cercana al 100%, con todos los ratones en desarrollo de lesiones a la vez funcional y estructural siguiente surgerY. Este modelo de IRI renal también permite un buen nivel de control sobre el grado de lesión con variación limitada observada entre animales (Figuras 2 y 3). El uso de diferentes duraciones de la isquemia permite intervenciones terapéuticas para ser examinado por su capacidad para modular diferentes niveles de gravedad de la lesión. Por ejemplo, sobre la base de la longitud de la isquemia de la lesión resultante puede ser clasificado como leve (20 min), moderada (22 min) o alta (24 min). Estos valores son para los ratones machos Balb / c de 8 semanas y se incluyen como única guía. Los investigadores deben establecer sus propias condiciones experimentales ya que estos serán diferentes según la cepa de ratón, la edad, el sexo y el ensayo bioquímico utilizado para evaluar la función renal.

    Este modelo ha sido utilizado con éxito para estudiar la regeneración siguiente IRI renal con la función y la estructura renal recuperación durante los días siguientes. Una disminución gradual de la creatinina en plasma y los niveles de BUN son observed, con creatinina plasmática de regresar a los niveles basales en el día 7 (Figura 4). Una evaluación de H & E secciones de tejido teñidas indica que un mayor número de túbulos se clasifican como sano o recuperar al día 7 en comparación con el día 4 que indica que la regeneración del tejido se lleva a cabo (Figura 5). La administración de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) antes del sacrificio facilita la inmunotinción de tejido renal para BrdU y posterior cuantificación de la proliferación de las células tubulares. Dramático expresión nuclear de BrdU se observa 4 días después de IRI renal lo que indica que los túbulos son sometidos a la proliferación de células marcadas con el fin de restaurar la integridad y la función del túbulo (Figura 6). La combinación de la función renal evaluación, la puntuación para la mejora estructural y la BrdU inmunotinción permite a este modelo que se utilizará para estudiar la regeneración después de IRI renal. Esto permite que los efectos a largo plazo de las intervenciones terapéuticas para estar eninvestigaron.

    Por último, la utilidad de este modelo es dependiente de la inducción de isquemia global para todo el riñón y esto puede ponerse en peligro por la presencia de vasos sanguíneos que irrigan el riñón, además de la arteria principal izquierda renal. Si estos vasos adicionales no se sujetan a continuación, parte del riñón no se somete a la lesión isquémica (Figura 7).

    Figura 1
    Figura 1 La puntuación de lesión tubular estructural y regeneración -. Morfología. Representante de salud, recuperación, heridos y túbulos necróticas secciones de tejido de un riñón extirpado 4 días después de IRI renal se tiñen con PAS para la evaluación. Túbulos ubicados dentro del OSOM están clasificados como sanos, lesionados, necrótico o recuperándose de acuerdo conla morfología celular, la integridad y el número de núcleos con ejemplos representativos resaltados. Túbulos saludables son intacta con una morfología celular normal. Túbulos necróticas exhiben una monocapa comprometida con la pérdida de células evidente y pérdida de morfología celular. Túbulos lesionados exhiben una monocapa celular adelgazada y contienen un menor número de núcleos. Por el contrario, la recuperación de los túbulos presentan una morfología celular normal más y un número similar de núcleos de túbulos saludables. Ampliación:. 400x Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2 Lesiones -. Renal isquemia deteriora la función renal macho Balb / c ratones de 8 semanas se sometió a una nefrectomía derecha y el.pedículo renal izquierda se sujetó para 20, 22 o 24 min (n = 4 por grupo). Los ratones fueron sacrificados a las 24 horas después de IRI renal. La creatinina plasmática y nitrógeno de urea en sangre muestran una tendencia al aumento de la severidad como la duración de la isquemia aumentado. La línea de trazos representa los niveles de creatinina en plasma y el nitrógeno de urea en sangre encontrados en los ratones de control normales. Los datos se presentan como media ± SEM y analizados por ANOVA de una vía. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    . Figura 3 Lesión - isquemia renal induce necrosis tubular aguda significativa ratones macho Balb / c de 8 semanas se sometió a una nefrectomía derecha y el pedículo renal izquierda fue cl.amplificada para 20, 22 o 24 min (n = 4 por grupo). Los ratones fueron sacrificados a las 24 horas después de IRI renal. Microfotografías representativas (Ampliación: 200x) de la OSOM de secciones de riñón H & E manchadas de control y los riñones heridos ilustran ATN. Formal de puntuación de la ATN (expresado como la proporción de los túbulos necróticas) confirma el aumento del nivel de la lesión con el aumento de la duración de la isquemia. Los datos presentan como media ± SEM y analizados por ANOVA de una vía (**** = P ≤ 0,0001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    . Figura 4 Regeneración - La función renal se recupera después de una isquemia renal Male ag ratones FVB.Norma 8 - 10 semanas se sometió a una nefrectomía derecha antes de 25 min de isquemia en el riñón izquierdo. Los ratones fueron sacrificados 1 día (n = 10), 4 días (n = 10) o 7 días (n = 6) siguiente IRI renal. Tanto la creatinina plasmática y nitrógeno de urea en sangre reducirse de manera constante en el transcurso de 7 días, con la creatinina plasmática de regresar a los niveles basales, que ilustra una recuperación de la función renal. Los datos presentan como media ± SEM y analizados por ANOVA de una vía (*** = P ≤ 0,001, * = P ≤ 0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    La figura 5
    Figura 5 Regeneración -. Renal tejido muestra signos de recuperación después de rena . l isquemia ratones FVB masculinos a partir de 8 - 10 semanas se sometió a una nefrectomía derecha antes de 25 min de isquemia en el riñón izquierdo. Los ratones se sacrificaron 4 días (n = 10) o 7 días (n = 6) siguiente IRI renal. Se muestran: (200 aumentos) de la OSOM siguientes de la inducción de isquemia microfotografías representativas. De puntuación formal del número de sano, recuperación, heridos o túbulos necróticas dentro del OSOM se evaluó en PAS manchadas secciones de parafina. Al día siguiente 4 IRI renal una gran proporción de los túbulos en el OSOM todavía parece lesionado. Sin embargo por 7 días hay un aumento considerable de la proporción de túbulos que se clasifican como sano o recuperar indicativa de la regeneración renal. Los datos se presentan como media ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    iempre "> La figura 6
    . Figura 6 Regeneración - proliferación tubular dramático es evidente 4 días siguientes isquemia renal ratones FVB masculinos a partir de 8 -. 10 semanas se sometió a una nefrectomía derecha antes de 25 min de isquemia en el riñón izquierdo. BrdU (50 mg / kg) se administró por inyección intraperitoneal 24 horas antes de su sacrificio. Los ratones se sacrificaron 4 días (n = 10) o 7 días (n = 6) siguiente IRI renal. Microfotografías representativas (Ampliación: 200x) de la OSOM de ratones sacrificados en el día 4 y el día 7 después de la inducción de isquemia se muestran. Proliferación de las células tubulares se evaluó por tinción inmunohistoquímica para BrdU en embebidos en parafina secciones de riñón. La proliferación de células tubulares se cuantificó contando el número de núcleos BrdU positivos en el OSOM con el aumento de la proliferación celularevidente en el día 4. Datos presentados como media ± SEM y analizados por los estudiantes t-test (*** = P ≤ 0,001). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    La figura 7
    Figura 7. Izquierda riñón isquémico con los vasos sanguíneos renales adicionales no ocluida. Si no ocluir los vasos sanguíneos adicionales suministrar el riñón conduce a la isquemia inconsistente. (A) La ausencia de isquemia renal global está indicada por un cambio de color desigual (flecha blanca) cuando el clip de micro serrafine está en posición. (B) Después de la eliminación de la pinza de micro serrafine, la arteria y la vena renal principal son visibles (flecha blanca) junto con el vaso sanguíneo adicional suministroel polo medio e inferior del riñón (flecha negro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Renal IRI es una causa importante de lesión renal aguda con tratamiento específico disponible. El estudio experimental de IRI renal ha sido muy informativo con trabajos anteriores que demuestran el papel de los macrófagos, células dendríticas, linfocitos, células T reguladoras, así como otras células y mediadores en la inducción tanto de la lesión aguda y fase de curación 5,8 - 16. Además, el IRI renal experimental se ha utilizado para evaluar el efecto de diversos agentes terapéuticos 4,17-19.

    El modelo de IRI renal detallado aquí utiliza un enfoque de la laparotomía de la línea media para llevar a cabo una nefrectomía derecha e inducir isquemia en el riñón izquierdo usando abrazaderas. Como se ilustra por los resultados representativos, la modificación de la duración de la isquemia puede controlar la gravedad de la lesión. Por lo tanto este modelo se puede ajustar para inducir leve, moderada o un alto nivel de la lesión renal como es requerido por la cuestión planteada experimental. Sin embargo, una limitación de este modelo es queno es adecuado para la inducción de la lesión renal muy grave por la isquemia renal prolongada. La disfunción renal aguda severa resultante puede dar lugar a una mortalidad significativa.

    Hay varios aspectos de este modelo que son cruciales para lograr la lesión renal predecible y reproducible. Una fuente importante de variabilidad con este modelo se puede proceder de la temperatura corporal durante el período isquémico 20. Por lo tanto, es esencial que la temperatura corporal se mantiene a un nivel constante y controla durante todo el período isquémico. En este protocolo de una unidad de control con sensores de temperatura y manta homeotermos fue utilizado para auto-regular la temperatura corporal a 37 º C. La influencia de la temperatura del cuerpo de la susceptibilidad de los riñones a la lesión isquémica está bien descrita. El trabajo previo ha demostrado que la temperatura del cuerpo afecta a la gravedad de la insuficiencia renal IRI 20 y la variación en la temperatura corporal de los ratones es un potencial de confusiónfactor que puede afectar a la interpretación de los resultados. Otra consideración importante es que los ratones pueden exhibir variación anatómica con los vasos sanguíneos adicionales que irrigan el riñón izquierdo. Es fundamental que estos vasos sanguíneos adicionales se identifican y ocluidas cuando se realiza la nefrectomía derecha y la inducción de isquemia global en el riñón izquierdo. De no hacerlo, dará lugar a la isquemia inconsistente a través del riñón. Del mismo modo, el cambio de color de la siguiente riñón de sujeción izquierda del pedículo renal izquierda debe ser cuidadosamente examinada como la ausencia de un cambio de color globales sugiere la presencia de una arteria renal adicional que inicialmente no había sido identificado.

    En contraste con los modelos que utilizan la isquemia renal bilateral, este modelo será de interés para los investigadores que están utilizando la administración profiláctica de fármacos u otros agentes para modular la expresión de genes, proteínas, etc antes de la lesión renal. El equipo de perforacióntejido nefrectomía HT se puede utilizar para confirmar y cuantificar el nivel de inducción o inhibición de la molécula de interés en cada animal de experimentación individuo. Este modelo también será de interés para los investigadores que estudian la regeneración renal como la fase de lesión aguda es seguida por la proliferación tubular prominente.

    Algunos modelos experimentales de inflamación renal se limitan como enfermedad significativa sólo puede ser inducida en ciertas cepas de ratones. En contraste, el modelo de IRI renal aquí descrito es versátil y se puede aplicar tanto para los hombres y 5 mujeres 4 ratones, diferentes cepas de ratones, así como ratones de edad 4.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Tissue scissors Fine Science Tools 14072 - 10
    Micro-Adson forceps (Rat toothed) Fine Science Tools 11019 - 12
    S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled Fine Science Tools 00649-11
    Colibri retractor Fine Science Tools 17000 - 04
    Micro clip applicator Fine Science Tools 18057-14
    Micro serrafines  Fine Science Tools 18055-04
    Olsen-Hegar needle holder Fine Science Tools 12002 - 12
    Hemoclip Plus Ligating Clips Small Weck 533837
    Autoclip Wound Clip System, 9mm Harvard Apparatus PY2 52-3748
    Silk Black Braided Suture, Size 6-0 Harvard Apparatus 723288
    Standard Heat Matt
    Homeothermic Blanket & Control Unit Harvard Apparatus
    Lacri-Lube Allergan
    Vetasept Chlorhexidine   AnimalCare
    Vetalar : Ketamine hydrochloride 100 mg/ml solution
    Domitor : medetomidine hydrochloride  1 mg/ml
    Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride  0.3 mg/ml
    Antisedan : Atipamezole hydrochoride 5 mg/ml

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
    2. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
    3. Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
    4. Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
    5. Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
    6. Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
    7. Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
    8. Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
    9. Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
    10. Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
    11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
    12. Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
    13. Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
    14. Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
    15. Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
    16. Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
    17. Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
    18. Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
    19. Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
    20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).

    Tags

    Medicina Número 88 murino la lesión renal aguda isquemia reperfusión nefrectomía Regeneración laparotomía
    La isquemia reperfusión renal: un modelo de ratón de la lesión y regeneración
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hesketh, E. E., Czopek, A., Clay,More

    Hesketh, E. E., Czopek, A., Clay, M., Borthwick, G., Ferenbach, D., Kluth, D., Hughes, J. Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration. J. Vis. Exp. (88), e51816, doi:10.3791/51816 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter