Abstract
Renale ischemie reperfusie schade (IRI) is een veel voorkomende oorzaak van acute nierschade (AKI) bij patiënten en occlusie van nierbloedstroming onvermijdelijk tijdens niertransplantatie. Experimentele modellen die nauwkeurig en reproduceerbaar recapituleren renale IRI zijn cruciaal in het ontleden van de pathofysiologie van AKI en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen. Hier gepresenteerd is een muismodel van renale IRI die resulteert in reproduceerbare AKI. Dit wordt bereikt door een middellijn laparotomie benadering voor de operatie met een incisie waardoor zowel een rechter nefrectomie die controleweefsel en klemmen van de linker renale pedikel ischemie van de linker nier te induceren verschaft. Door zorgvuldige controle van de klem positie en de lichaamstemperatuur gedurende de periode van ischemie dit model behaalt reproduceerbare functionele en structurele schade. Muizen opgeofferd 24 uur na een operatie aan te tonen verlies van de nierfunctie met verhoging van het serum of plasma creatinine niveau als structurele nierschade met acute tubulaire necrose evident. De nierfunctie verbetert en acute weefselschade lost tijdens 7 dagen na renale IRI zodat dit model kan worden gebruikt om renale regeneratie te bestuderen. Dit model van renale IRI is gebruikt om de moleculaire en cellulaire pathofysiologie van AKI en een analyse van de latere nier-regeneratie te bestuderen.
Introduction
Ischemie-reperfusie schade (IRI) is een veel voorkomende vorm van letsel voor meerdere organen, waaronder de nieren, het hart en de hersenen. Nier IRI kan leiden tot acute nierschade (AKI) bij patiënten en geen specifieke behandeling beschikbaar is. AKI als gevolg van IRI heeft een ingewikkelde pathogenese waarbij zowel het aangeboren en adaptieve immuunrespons 1. Een experimenteel model van renale IRI biedt de mogelijkheid om de belangrijkste cellen en mediatoren betrokken bij de pathogenese van AKI en de daaropvolgende regeneratie nier die volgt de daaropvolgende dagen ontleden. Verder is de effecten van nieuwe therapeutische middelen bij ziekteprocessen kan worden beoordeeld.
De algemene doelstelling van het experimentele model van renale IRI beschreven is hier om zowel acute functionele en structurele nierschade veroorzaken. Sommige onderzoekers hebben een model dat de inductie van bilaterale IRI 2 omvat gebruikt. Hoewel de bilaterale renale IRI model is van het gebruik, de eenzijdige renAl IRI model heeft het voordeel van een recht nefrectomie wordt aangebracht op het moment van de operatie. De rechter nefrectomie weefsel dient als waardevol controle weefsel in studies met een voorbehandeling stap die ofwel induceert of onderdrukt de expressie van een gen of eiwit. Zo hebben we dit model gebruikt om de voorconditionering effecten van heem arginaat (HA) injectie 24 uur vóór renale IRI 3 beoordelen. De succesvolle inductie van de cytoprotectieve enzym heem-oxygenase-1 (HO-1) door HA voordat IRI werd bevestigd in de rechter nefrectomie controleweefsel 4. HA verminderde renale IRI in oude muizen gedeeltelijk via een HO-1 afhankelijk mechanisme. Zo hebben wij het model dat in macrofaag depletie studies om de rol van macrofagen bij nier IRI 5 onderzoeken. Immunohistochemische analyse van de rechter nefrectomie weefsel kan worden gebruikt om de doeltreffendheid van de ablatie methode bevestigen. De rechter nefrectomie weefsel kan derhalve worden gebruikt om zowel bevestigen en kwantificeren van de mate van induction of remming van het molecuul van belang in elk afzonderlijk proefdier. Dit model zal van belang zijn voor onderzoekers die het gebruik van drugs of andere verbindingen om de expressie van genen of eiwitten enz. voorafgaand aan de inductie van het renale IRI moduleren.
Andere studies hebben flank incisies gebruikt om de nieren. De hier beschreven model gebruikt een middenlijn abdominale chirurgie zowel rechts nefrectomie uitgevoerd en induceren ischemie reperfusie van de linker nier. Deze chirurgische aanpak zorgt voor een uitstekende visualisatie van het chirurgische veld met inbegrip van de renale steeltjes en kleurveranderingen die renale pedikel klemming volgen. Onze gepubliceerde ervaringen met het model 4-6 geeft aan dat muizen snel te herstellen van de operatie met een bijna 100% overlevingskans.
Tenslotte kinetische analyse van het model over een periode van 7 dagen aangeeft dat dit model vertoont herstel van zowel nierfunctie en tubulaire integeresignificante tubulaire cel proliferatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING:. Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften opgelegd door de Dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act 1986 Procedures werden uitgevoerd met behulp van steriele (autoclaaf) chirurgische instrumenten en verbruiksgoederen. Terwijl het muizenmodel van renale IRI gepresenteerde hier werd uitgevoerd op een 8 weken oude mannelijke Balb / c muis kan reproduceerbaar worden uitgevoerd op een verscheidenheid van muizen stammen van beide geslachten meestal tussen 7 jaar - 15 weken, waarbij de optimale leeftijd wezen 8 weken. De in de resultaten representatief gedeelte gegevens werden verkregen van zowel Balb / c en FVB muizen. De toepassing van verwarmde zoutoplossing wordt gebruikt om de darmen en operatiegebied vochtig maar moet zorgvuldig worden gecontroleerd en een minimum als de overmatige toepassing van vloeistoffen gehouden kan leiden tot een artefactuele verlaging van het serum of plasma creatinine niveaus, hetgeen een belangrijke experimentele uitlezing.
1. Animal Voorbereiding en Laparotomie
<ol>2. Ureter Division en rechts Nephrectomy
- Duw de darmen naar de linkerkant van de buikholte met autoclaaf gesteriliseerde wattenstaafjes bevochtigd met zoutoplossing om de rechter nier en ureter bloot. Bedek de darmen met vochtig gordijnen om uitdroging te voorkomen.
- Til de rechter ureter met schuine pincet. Ligeren de juiste ureter tweemaal gebruik 6/0 silk-gevlochten hechtdraad. Voor de lange termijn experimenten, gebruik absorbeerbare hechtingen voor alle abdominale chirurgie.
- Verdeel de urineleider tussen de hechtingen. Terwijl de vesico-ureterale junctie urine moet voorkomen dat lekken in het buikvlies van de blaas de urineleider wordt afgebonden als bescherming tegen eventuele lekkage na operatie bij langdurige experimenten.
- Om gemakkelijker toegang te verlenen bij het uitvoeren van de juiste nefrectomie, duw de lever en naar rechts met een vochtig wattenstaafje en plaats te houden met behulp van vochtige gaas naar rechts nierslagader en ader bloot.
- Bot ontleden het bindweefsel en vet langs de mediale zijde van de rechter nier tot aan de rechter nierslagader en ader.
- Maak een kanaal onder de nierslagader en ader door het zorgvuldig te schuiven de schuine pincet onder de bloedvaten. Leid de forceps onder de uiteinden gesloten en verwijder voorzichtig de uiteinden open om de vorming van het kanaal te vergemakkelijken.
- Herhaal stap 2.6 tot de uiteinden van de tang zijn zichtbaar door het bindweefsel boven de renale slagader en ader. Eenmaal zichtbaar wrijf de uiteinden van de tang tegen de toppen van een andere set van schuine pincet om voorzichtig breken het bindweefsel.
- Met de nierslagader en ader duidelijk toegankelijke ze kunnen nu worden afgesloten. Schuif schuine pincet onder de nierslagader en ader met de tips gesloten. Eenmaal op zijn plaats opent de uiteinden van de tang en begeleiden de hemostatische klem applicator tussen de tips en stevig een hemostatische klem toe te passen op de nierslagader en de ader dicht bij de nieren. Als alternatief kan de nierslagader en ader kan worden afgebonden met behulp van 6/0 zijden gevlochten hechtdraad.
- Verdeel het afgesloten renale slagader en ader nabij de nieren, die nu kan worden verwijderd met de resterende hechtende bindweefsel.
- Verwijder eventuele gaas gebruikt om de lever te houden en vervang de darmen met wattenstaafjes.
- Duw de darmen naar de rechterkant van de buikholte met wattenstaafjes om de linker nier en urineleider bloot te leggen en afdekken met vochtige doeken. Indien nodig kan de alvleesklier kan worden afgebogen met vochtig gaas om gemakkelijker toegang te verlenen.
- Gebruik stompe dissectie voorzichtig breken bindweefsel anterior en posterior links renale slagader en ader, en vervolgens een kanaal onder de schepen in een soortgelijke wijze als in ureter sector en rechter nefrectomie beschreven stap 2.4.
- Induceren ischemie van de linker nier door een micro serrafine clip op de nierslagader en ader. Succesvolle ischemie kan visueel worden bevestigd door een geleidelijke gelijkmatige verdonkering van de nier. Bloedvaten naast de linker renale slagader en ader soms leveren de nier. Indien aanwezig, zal deze extra bloedvaten ook moeten worden afgesloten met behulp van micro serrafine clips om succesvolinduceren ischemie van de gehele nier.
- Vervang de darmen en zorgvuldig te verzekeren dat er geen abrupte wendingen die kan leiden tot intestinale ischemie compromitterende resultaten. Tijdelijk te sluiten het buikvlies met een enkele hechting.
- Na ischemie inductie onmiddellijk het muis in een homeothermic deken met een rectale thermistor aangesloten op een regeleenheid die de lichaamstemperatuur zal handhaven op 37 ° C voor de vereiste duur van ischemie. Om de geschikte lengte van ischemie noodzakelijk definiëren om de gewenste mate van nierbeschadiging en nierfalen induceren wordt aanbevolen dat een titratie van elke stam en chirurgische operator worden uitgevoerd.
- Kort voor het einde van de ischemische periode heropenen het peritoneum en zorgvuldig plaats de darmen toegang tot de klem toestaan en bekijk de nieren. Insertie van het oprolmechanisme, zoals in de video is niet nodig en is alleen uitgevoerd voor de presentatie.
- Verwijder de clamp na de periode van ischemie heeft gesloten. Onmiddellijk na het verwijderen van de nier snel kleur zal veranderen van een donker kastanjebruin op een gezonde donkerroze aangeeft succesvolle reperfusie.
- Wederom garanderen dat de darmen niet gedraaid voor het afsluiten van het peritoneum met een festonsteek met 6/0 gevlochten zijden hechtdraad. Sluit vervolgens de huid met behulp van metalen huid clips.
- Om het risico van postoperatieve infectie minimaliseren, breng een antiseptische zoals jodium / alcohol oplossing van het operatiegebied.
4. Post-operatieve herstel en verzorging
- Gedeeltelijk omgekeerde anesthesie met atipamezolhydrochloride (2 mg / kg) subcutaan toedienen en vloeistoffen met een subcutane injectie van 1 ml zoutoplossing verwarmd om uitdroging na chirurgie te voorkomen.
- Monitoren muizen zorgvuldig tot zij het bewustzijn hebben hersteld, lijken alert en in staat zijn om zichzelf rechts.
- Toestaan muizen te herstellen in een verwarmde doos bij 29 ° C, loc bewaardated in een rustige omgeving, gedurende 24 uur. Muizen zal een verminderd vermogen om thermoregulate door de anesthesie en daarom noodzakelijk dat zij gehuisvest bij een verhoogde temperatuur effectieve herstel mogelijk. Bevochtigd voer kan worden verstrekt aan vocht en voeding inname bevorderen.
- Voor de lange termijn herstel experimenten doorlopend analgetica en verwijder de huid clips 7 dagen na de operatie.
5. Beoordeling van functionele en structurele Kidney Injury and Regeneration
- Bloed kan worden verzameld uit de staartader bij experimenten of cardiale punctie bij de euthanasie aan het eind van het experiment. Meet de nierfunctie door serumcreatinine, met behulp van een creatinase gebaseerde methode, en bloed ureum stikstof (BUN) op een biochemische centrifugale analyzer zoals eerder 7 beschreven. De nierfunctie van normale gezonde muizen moet worden vastgesteld vóór de oprichting van een model van nierfalen, want dit kan sterk variëren depending op de gebruikte analysemethode bijvoorbeeld de Jaffe reactie en creatinase gebaseerde methoden voor het meten van creatinine geven verschillende resultaten.
- Onderzoek nierstructuur door histopathologie op paraffine ingebedde nierweefsel secties gekleurd met Hematoxyline en eosine (H & E) of Periodic Acid Schiff (PAS). Leg tussen 5-10 beelden op 200x vergroting binnen de buitenste strook van de buitenste medulla (OSOM) voor elke muis. Een beoordeling van de schade in het OSOM aangezien deze regio is gewond geraakt bij dit model, want het is zeer kwetsbaar voor hypoxie.
- Gebruik een van de twee scoringssystemen hieronder beschreven om acute tubulaire necrose (ATN) of regeneratie meten. Representatieve morfologie van de classificaties die in deze systemen wordt geïllustreerd in Figuur 1.
- Gebruik een eenvoudige binaire systeem te scoren ATN. Op basis van de cellulaire integriteit en morfologie merk en tel buisjes als ofwel levensvatbare (intacte cel morfologie) of necrotische (gecompromitteerd cel integriteit, abnormale cel morfologie of verlies van cellen).
- Druk het aantal necrotische tubules als percentage van het totale aantal buisjes (necrotische tubuli%).
- Classificeren regeneratie met een ander systeem op basis van cel-integriteit, morfologie en kernen nummer. Mark en tel buisjes zo gezond, necrotische, gewonde of het herstel volgens de in de volgende stappen genoemde criteria.
- Net als bij de ATN scoresysteem (beschreven in stap 5.4) merk buisjes met intacte normale cellen zo gezond terwijl buisjes met een verminderde cel-integriteit, abnormale cel morfologie of openlijke cel verlies worden gescoord als necrotische.
- Classificeren buisjes als gewond als ze een verdunde cytoplasma met enkele kernen. Daarentegen wijst buisjes die meer kernen met meer normale celmorfologie en winnen.
- Uiten elk buisje kwalificatie als een percentage van het totale aantal tubulus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tubulaire schade en herstel kan worden beoordeeld door H & E of PAS kleuring van coupes volgende renale IRI. Buisjes binnen de OSOM worden geclassificeerd als gezond, verwond, necrotische of herstellen volgens celmorfologie, integriteit en kernen nummer (Figuur 1). De functionele en structurele schade in dit model is afhankelijk van de duur van de ischemie. Een geleidelijke verhoging van de ernst van de nierfunctiestoornis, beoordeeld door plasma creatinine en BUN, is duidelijk als de duur van de ischemie wordt verhoogd in stappen 2min (figuur 2). De mate van structurele nierschade, afgeleid uit de ATN score, volgt een soortgelijke trend met meer ernstige ATN begeleidende meer langdurige ischemie (figuur 3). Na een eerste titratie van verschillende duur van ischemie, dient dit model van renale IRI bereiken van een bijna 100% succes, met alle muizen de ontwikkeling van zowel functionele en structurele schade na een surgery. Dit model van renale IRI maakt het ook een fijne mate van controle over de mate van letsel met beperkte variatie waargenomen tussen dieren (figuren 2 en 3). Het gebruik van verschillende lengtes van ischemie van therapeutische interventies worden onderzocht op hun vermogen om verschillende verwondingsstrengheid moduleren. Bijvoorbeeld op basis van de lengte van de resulterende ischemie letsel kan worden beschouwd als licht (20 min), matige (22 min) of hoge (24 min). Deze waarden zijn voor mannelijke Balb / c muizen van 8 weken en zijn opgenomen als enige leidraad. Onderzoekers moeten hun eigen experimentele omstandigheden te vestigen als deze zullen verschillen naar gelang van de muis stam, leeftijd, geslacht en de biochemische test gebruikt om de nierfunctie te beoordelen.
Dit model is met succes gebruikt om regeneratie te bestuderen na renale IRI zowel renale functie en structuur terugwinnen gedurende de volgende dagen. Een geleidelijke afname van de plasma creatinine en BUN niveaus zijn observed met plasma creatinine terug naar basale niveaus tot dag 7 (Figuur 4). Een beoordeling van H & E gekleurde weefselsecties aan dat een groter aantal buisjes worden geclassificeerd als gezond of herstellen op dag 7 vergeleken met dag 4 knippert weefselregeneratie plaatsvindt (figuur 5). De toediening van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) vóór offeren vergemakkelijkt de immunokleuring van nierweefsel voor BrdU en latere kwantificering van tubulaire celproliferatie. Dramatische nucleaire BrdU expressie volgt renale IRI aangeeft dat de tubuli ondergaan gemarkeerd celproliferatie om tubulus integriteit en functie (figuur 6) opnieuw waargenomen 4 dagen. De combinatie van de nierfunctie assessment, noteren voor structurele verbetering en BrdU immunostaining maakt dit model moet worden gebruikt om de regeneratie na renale IRI bestuderen. Hierdoor kan de lange termijn effecten van therapeutische interventies investigated.
Tenslotte, het nut van dit model is afhankelijk van de inductie van globale ischemie de gehele nier en kan worden bedreigd door de aanwezigheid van bloedvaten die de nieren in aanvulling op de belangrijkste linker nierslagader. Indien deze bijkomende vaartuigen niet geklemd dan onderdeel van de nier niet onderworpen aan ischemie (Figuur 7).
Figuur 1 Scoren structurele tubulaire schade en regeneratie -.. Vertegenwoordiger morfologie van gezonde, het terugkrijgen, gewond en necrotische buisjes Weefselsecties van een nier verwijderd 4 dagen na de nier IRI worden gekleurd met PAS voor beoordeling. Buisjes gelegen binnen de OSOM worden geclassificeerd als gezond, gewond, necrotische of het herstel volgenscel morfologie, integriteit en kernen getal met representatieve voorbeelden gemarkeerd. Gezonde tubuli intact met een normale celmorfologie. Necrotische buisjes vertonen een gecompromitteerd monolaag met duidelijke cel verlies en verlies van cel morfologie. Gewonde buisjes vertonen een verdunde cellulaire monolaag en minder kernen bevatten. Daarentegen terugwinnen buisjes vertonen een normale cellulaire morfologie en een vergelijkbaar aantal kernen gezonde tubuli. Vergroting:. 400x Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Schade -. Renale ischemie vermindert nierfunctie Mannelijke Balb / c muizen van 8 weken onderging een rechter nefrectomie en.linker renale pedikel is geklemd voor 20, 22 of 24 min (n = 4 per groep). Muizen werden opgeofferd 24 uur na renale IRI. Plasma creatinine en ureum in het bloed vertonen een stijgende trend van de ernst als de duur van ischemie toegenomen. De stippellijn geeft de niveaus van plasma creatinine en ureum in het bloed gevonden in de normale controle muizen. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en one-way ANOVA geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 3 Schade - renale ischemie induceert significante acute tubulaire necrose Mannelijke Balb / c muizen 8 weken oud onderging een nefrectomie rechts en links renale pedikel was cl.amped voor 20, 22 of 24 min (n = 4 per groep). Muizen werden opgeofferd 24 uur na renale IRI. Vertegenwoordiger microfoto (Vergroting: 200x) van de OSOM van H & E gekleurde niersecties van controle en gewonden nieren illustreren ATN. Formele scoren van ATN (uitgedrukt als het aandeel van de necrotische buisjes) bevestigt het verhoogde niveau van de schade met de duur van de ischemie. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en one-way ANOVA (**** = P ≤ 0,0001) geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 4 Regeneration - De nierfunctie herstelt na renale ischemie Man FVB muizen ag.ed. 8 - 10 weken onderging recht nefrectomie vóór 25 minuten ischemie van de linker nier. Muizen werden opgeofferd 1 dag (n = 10), 4 dagen (n = 10) of 7 dagen (n = 6) na renale IRI. Zowel plasma creatinine en ureum in het bloed gestaag dalen in de loop van 7 dagen, met een plasma creatinine terugkeren naar basale niveaus, ter illustratie van een herstel van de nierfunctie. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en one-way ANOVA (*** = P ≤ 0.001, * = P ≤ 0,05) geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Regeneration -. Nierweefselmonsters toont tekenen van herstel na rena 8 l ischemie Man FVB muizen leeftijd -. 10 weken onderging een recht nefrectomie vóór 25 min van ischemie aan de linker nier. Muizen werden opgeofferd 4 dagen (n = 10) of 7 dagen (n = 6) na renale IRI. Representatieve microfoto (vergroting: 200x) van de OSOM na inductie van ischemie getoond. Formele scoren van het aantal gezonde, het terugkrijgen, gewond of necrotische buisjes binnen de OSOM werd beoordeeld in PAS gekleurd paraffinecoupes. Op dag 4 na renale IRI een groot deel van de buisjes in de OSOM nog verschijnen gewond. Maar met 7 dagen is er een aanzienlijke toename van het aandeel van de buisjes die zijn geclassificeerd als gezond of herstellende indicatief van renale regeneratie. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 6 Regeneratie - Dramatische buisvormige proliferatie is evident 4 dagen na renale ischemie Man FVB muizen 8 jaar -. 10 weken onderging een recht nefrectomie vóór 25 min van ischemie aan de linker nier. BrdU (50 mg / kg) werd toegediend door intraperitoneale injectie 24 uur voorafgaand aan offeren. Muizen werden opgeofferd 4 dagen (n = 10) of 7 dagen (n = 6) na renale IRI. Representatieve microfoto (vergroting: 200x) van de OSOM van muizen opgeofferd op dag 4 en dag 7 na de inductie van ischemie getoond. Buisvormige celproliferatie werd bepaald door immunohistochemische kleuring op BrdU op paraffine ingebedde niersecties. Buisvormige celproliferatie werd gekwantificeerd door het tellen van het aantal BrdU positieve kernen in de OSOM met verhoogde celproliferatieduidelijk op dag 4. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± SEM en door studenten t-test (*** = P ≤ 0,001) geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Linker ischemische nier met niet-afgesloten bijkomende renale bloedvaten. Niet meer bloedvaten die de nieren insluiten leidt tot inconsistente ischemie. (A) Het ontbreken van algemene nier ischemie wordt aangegeven door een ongelijke kleurverandering (witte pijl) wanneer het micro serrafine clip op zijn plaats. (B) Na het verwijderen van de micro serrafine clip, de belangrijkste nierslagader en ader zichtbaar zijn (witte pijl), samen met de extra bloedvatde middelste en onderste pool van de nier (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nier IRI is een belangrijke oorzaak van AKI met geen specifieke behandeling beschikbaar. De experimentele studie van renale IRI is zeer informatief met eerder werk demonstreren de rol van macrofagen, dendritische cellen, lymfocyten, regulatoire T-cellen en andere cellen en mediatoren in de inductie van zowel de acute schade en genezingsfase 5,8 geweest - 16. Daarnaast heeft renale IRI gebruikt om het effect van verschillende therapeutische middelen 4,17-19 beoordelen.
Het model van renale IRI hier beschreven maakt gebruik van een middellijn laparotomie benadering van een rechts nefrectomie presteren en veroorzaken ischemie in de linker nier met behulp van klemmen. Zoals geïllustreerd door de representatieve resultaten, wijziging van de duur van ischemie kunnen de ernst van de verwonding controleren. Daarom kan dit model worden aangepast voor het induceren mild, matig of hoog nierschade zoals in de experimentele gestelde vraag. Echter, een beperking van dit model is dat hetis niet geschikt voor de inductie van zeer ernstige nierschade bij langdurige renale ischemie. De resulterende ernstige acute nierstoornissen kan leiden tot aanzienlijke sterfte.
Er zijn verschillende aspecten van dit model die cruciaal zijn om voorspelbare en reproduceerbare nierbeschadiging bereiken. Een belangrijke bron van variabiliteit met dit model kunnen uit de lichaamstemperatuur gedurende de ischemische periode 20. Het is daarom essentieel dat de lichaamstemperatuur wordt gehandhaafd op een constant niveau en gevolgd gedurende de ischemische periode. In dit protocol een regeling met temperatuursondes en homoeothermic deken werd gebruikt om automatisch reguleren lichaamstemperatuur bij 37 ° C. De invloed van de lichaamstemperatuur van de gevoeligheid van de nieren ischemische schade is goed beschreven. Eerder werk heeft aangetoond dat lichaamstemperatuur beïnvloedt de ernst van renale IRI 20 en variatie in de lichaamstemperatuur van de muizen is een potentieel verstorendefactor die de interpretatie van de resultaten kunnen beïnvloeden. Een andere belangrijke overweging is dat muizen anatomische variatie kan vertonen met extra bloedvaten die de linker nier leveren. Het is essentieel dat dergelijke extra bloedvaten geïdentificeerd en afgesloten bij het uitvoeren van de juiste nefrectomie en het induceren globale ischemie in de linker nier. Doet u dit niet zal resulteren in inconsistente ischemie gedurende de nier. Evenzo moet de kleurverandering van de linker nier na klemming van de linker renale pedikel zorgvuldig worden onderzocht als de afwezigheid van een algemene kleurwijzigingen suggereert de aanwezigheid van een extra nierslagader die aanvankelijk niet waren geïdentificeerd.
In tegenstelling tot de modellen die bilaterale nier ischemie benutten, zal dit model interessant voor onderzoekers die gebruik maken van de profylactische toediening van farmaceutische drugs of andere middelen om de expressie van genen moduleren, eiwitten etc. voorafgaand aan nierschade. Het tuight nefrectomie weefsel kan worden gebruikt om zowel bevestigen en kwantificeren van de mate van inductie of inhibitie van het molecuul van belang in elk afzonderlijk proefdier. Dit model zal ook van belang zijn voor onderzoekers bestuderen nier regeneratie als de acute blessure fase wordt gevolgd door prominente buisvormige proliferatie.
Sommige modellen van renale inflammatie beperkt als significante ziekte alleen worden geïnduceerd in bepaalde stammen van muizen. In tegenstelling, het model van renale IRI beschreven is veelzijdig en kan worden toegepast op zowel mannelijke als vrouwelijke 5 4 muizen verschillende stammen van muizen en oudere muizen 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
