Abstract
肾移植术中肾缺血再灌注损伤(IRI)是急性肾损伤(AKI)患者和肾血流量的阻塞的常见原因是不可避免的。实验模型,准确和可重复地概括肾IRI在解剖AKI的病理生理和新的治疗药物的发展是至关重要的。这里介绍的是肾IRI小鼠模型,结果在重复性的AKI。这是通过对与一个切口允许两个右肾切除术,它提供控制组织和左肾蒂夹紧诱导左肾缺血的手术中线剖腹手术的方法来实现。通过在缺血期间仔细监测夹紧位置和体温的这种模式实现了可重复的功能和结构的损伤。小鼠处死24小时以下手术示范肾功能的丧失与血清或血浆肌酸酐水平的升高,以及结构郭晓丽肾损害与急性肾小管坏死明显。肾功能改善和肾IRI这样,该模型可用于研究肾再生7天期间的急性组织损伤消退。已动用肾IRI的这个模型,研究AKI的分子和细胞病理生理学,以及随后的肾再生的分析。
Introduction
缺血再灌注损伤(IRI)是受伤的多个器官,包括肾脏,心脏和大脑的共同模式。肾IRI可能导致急性肾损伤(AKI)患者,并没有具体的治疗方法。 AKI作为IRI的结果具有复杂的发病机理涉及两个先天和适应性免疫应答1。肾IRI的实验模型提供解剖的关键细胞,并参与了AKI的发病机制,以及随后的肾再生随之而来的是在随后的日子里调解员的潜力。此外后疾病进程的新的治疗剂的效果进行评估。
这里所描述的肾IRI的实验模型的总体目标是诱导急性功能和结构的肾损伤。一些研究者已经利用涉及双边IRI 2的诱导的模型。虽然双侧肾IRI模型的使用,单方面仁人IRI模型有一个右肾切除正在开展在手术时间的优势。右侧肾切除的组织可作为有价值的对照组织中的研究涉及要么诱导或抑制的基因或蛋白质的表达的预处理步骤。例如,我们用这个模型来评估血红素精氨酸的预处理效果(HA)注射肾IRI 3 24小时前交回。成功诱导细胞保护酶血红素加氧酶-1(HO-1)由医管局IRI之前在右肾切除对照组织4中得到证实。房委会通过的HO-1依赖的机制减少肾IRI在老年小鼠中的一部分。类似地,我们已经使用了模型中巨噬细胞的耗竭研究,探讨巨噬细胞在肾IRI 5的作用。右侧肾切除组织的免疫组织化学分析可用于确定消融方法的疗效。右侧肾切除的组织,因此可以用来同时确认和量化i的平nduction或抑制在每个个体实验动物感兴趣分子的。这个模型将是感兴趣的谁正在使用的药物或其他化合物来调节肾IRI的诱导前基因或蛋白质等的表达研究。
其他研究已经使用侧面切口访问肾脏。这里所描述的模型使用一个单一的中线腹部手术同时执行的右肾切除,诱导左肾缺血再灌注损伤。这种手术方式提供了出色的外科领域,包括肾蒂和颜色的变化遵循肾蒂夹紧的可视化。我们的出版经验与模型4-6表明,小鼠很快从手术中恢复了接近100%的存活率。
最后,该模型在一个为期7天的动力学分析表明,该模型具有两个恢复肾功能和肾小管完整性,用显著肾小管细胞增殖。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注:动物实验已根据由动物(科学规程)1986年法令所规定的准则和法规执行的程序使用无菌(高温高压)手术器械和耗材进行。 15周,最适年龄感 - 虽然肾IRI的小鼠模型这里介绍的是在8周龄雄性它可以在各种不论男女通常7岁之间的小鼠品系的可再现进行的BALB / c小鼠进行共8周。在代表性的结果部分给出的数据是来自BALB / c和FVB小鼠获得的。温热生理盐水的应用是用来保持肠内和手术区域湿润,但它应仔细监测并保持在最低水平作为流体的过度应用可导致伪迹降低血清或血浆肌酸酐水平,这是一个重要的实验读数。
1,动物的制备与剖腹手术
<醇>2,输尿管司和右肾切除
- 轻轻推入肠对使用蘸有生理盐水,暴露右肾及输尿管高压灭菌消毒棉签腹腔左侧。盖上湿润的布肠道,防止干燥。
- 抬起右输尿管与角度的钳。结扎右输尿管采用6/0 SIL两次K-编织缝合。对于长期的实验中,使用可吸收缝合线的所有腹部手术。
- 划分缝线之间的输尿管。虽然膀胱输尿管交界处,应防止尿液漏入腹膜从膀胱输尿管被结扎作为对在长期实验中泄漏任何手术后一种保障。
- 为了使用户更容易访问进行右肾切除时,用沾湿的棉签轻轻推肝脏向上和向右并固定到位用湿润的纱布,暴露右肾动脉和静脉。
- 说白了解剖结缔组织和脂肪沿右肾内侧方面尽可能的右肾动脉和静脉。
- 建立肾动脉和静脉通过仔细滑动倾斜的镊子血管下方下方的通道。引导钳子下方的提示关闭,并轻轻地去除与提示,以便于信道的形成开路。
- 重复步骤2.6直到钳提示是可见的只是通过肾动脉和静脉上方的结缔组织。一旦可见轻轻揉搓钳提示对另一套角度的钳的尖端轻轻地打破结缔组织。
- 与肾动脉和静脉明显地可访问他们现在可以遮挡。小心地将倾斜的镊子肾动脉下方,静脉与提示关闭。一旦到位开镊子的提示和引导技巧之间的止血夹子涂药,牢固应用止血夹到肾动脉和静脉靠近肾脏。另外肾动脉和静脉可以使用6/0丝线编织缝线结扎来。
- 划分闭塞肾动脉和静脉靠近肾脏,这现在可以与任何剩余的贴壁结缔组织中删除。
- 卸下用来保存肝脏和用棉签代替肠子任何纱布。
- 轻轻推肠子朝右侧腹腔棉签暴露左肾及输尿管,并盖上湿润的毛巾。如果有必要的胰腺可以与湿润纱布被偏转,以允许更容易获得。
- 使用钝性分离轻轻打破结缔组织前部和后部的左侧肾动脉和静脉,然后创建以类似的方式船只下方的通道,在输尿管司和右肾切除2.4描述的步骤。
- 通过应用微serrafine夹到肾动脉和静脉引起左肾缺血。成功的缺血可以通过肾脏逐渐变黑统一进行目视确认。血管除了左肾动脉和静脉偶尔可以提供肾脏。如果存在的话,这些额外的血管还需要使用微serrafine片段,以便成功地被遮挡导致整个肾脏的缺血。
- 更换肠子和再三保证,没有突然的曲折,可能会导致肠缺血妥协的结果。暂时与单个缝合关闭腹膜。
- 局部缺血诱导马上将鼠标放在一个恒温动物毯与连接到一个控制单元,其将维持体温在37℃缺血的所需持续时间的直肠热敏电阻。定义必要缺血的适当长度来诱导的肾损伤和肾功能衰竭的期望程度,建议将每个菌株和手术操作者进行滴定。
- 不久缺血期结束前重新打开腹膜,仔细定位肠子允许访问钳和查看肾脏。卷收器的插入,如视频所示,是没有必要的,是专为表象的目的而进行的。
- 取出CL缺血期后放的结论。立刻取出后,在肾脏会迅速从一个深栗色改变颜色,以一个健康的深粉红色,表示成功的再灌注。
- 再次确保肠子不关闭腹膜使用6/0编织丝线缝合一针毯之前,扭曲。然后关闭使用金属夹子皮肤的皮肤。
- 为了尽量减少术后感染的风险,应用防腐剂如碘/酒精溶液至手术区。
4,术后恢复和护理
- 部分反向麻醉阿替美唑盐酸盐(2毫克/千克)经皮下给药和流体用皮下注射1毫升温热生理盐水,以防止脱水以下手术。
- 仔细监测小鼠,直到他们恢复了意识,出现警报,并能正确自己。
- 允许小鼠在加热箱恢复保持在29℃,禄ATED在一个安静的环境,24小时。小鼠将不得不温度调节因麻醉的能力受损,因此,至关重要的是,它们被安置在升高的温度,以使有效的恢复。湿润的食物也可以提供,以鼓励液和营养摄入。
- 对于长期回收实验提供持续的止痛药和手术去除皮肤剪辑7天。
5,评估功能和结构肾损伤和再生
- 血可从尾静脉在实验过程中或通过心脏穿刺来收集在安乐死的时间在实验结束。通过血清肌酸酐测量肾功能,使用于生化分析仪离心一个基于肌酸方法,以及血液尿素氮(BUN),如先前描述的7。需要正常健康小鼠的肾功能建立肾功能衰竭的模型,因为这之前确定可以改变明显dependi纳克在使用如谢斐反应,并根据肌酸方法测量肌酐的分析方法给出不同的结果。
- 经病理组织学上的石蜡包埋肾组织切片用苏木精和曙红(H&E)或碘酸雪夫(PAS)检查肾功能结构。在200倍放大率的外髓(OSOM)对每只小鼠外条纹内10幅图像 - 拍摄之间5。评估在OSOM损伤的程度,因为这地区有伤在这个模型中,因为它是非常容易受到缺氧。
- 请使用下面详述两个评分系统来衡量急性肾小管坏死(ATN)或再生。在这些系统中使用的分类的代表的形态示于图1。
- 用一个简单的二进位制的得分ATN。对细胞的完整性和形态标记的基础和计数肾小管无论是作为可行的(完整的细胞形态)或坏死(细胞受损集成grity,细胞形态异常或细胞的损失)。
- 表达肾小管坏死的数量作为细管的总数(坏死的肾小管%)的百分比。
- 使用基于细胞的完整性,形态及核数另一个系统分类再生。马克和计数肾小管一样健康,坏死,受伤或按照以下步骤列出的标准中恢复过来。
- 由于与ATN评分系统(在步骤5.4详述)肾小管标志与完好正常细胞的健康,而小管出妥协细胞的完整性,细胞形态异常或明显的细胞损失应评价为坏死。
- 分类小管和受伤,如果他们有一个包含几个原子核的薄壁细胞质中。相比之下,指定含有较多的细胞核较正常的细胞形态为肾小管恢复。
- 表示每个小管分类为总肾小管数的百分比。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
肾小管损伤和恢复可以由H&E或评估的组织切片肾IRI PAS染色。位于OSOM内小管是根据细胞形态,完整性和核数( 图1)划分为健康,受伤,坏死或恢复。在此模型中的功能和结构的损伤是依赖于缺血的持续时间。逐步增加肾功能不全的严重程度,由血浆肌酐和尿素氮评估,是明显的,因为缺血的持续时间增加2分钟的增量( 图2)。结构肾损伤,从ATN得分推断的程度,如下更严重的ATN伴随更长时间的局部缺血( 图3)类似的趋势。以下不同缺血持续时间的初始滴定,肾IRI的这个模型应该达到接近100%的成功率,与开发功能和结构损伤的奔腾所有小鼠年。肾IRI的这个模型还能够造成伤害的程度的控制与动物( 图2和图3)之间观察到有限变化的精细程度。使用缺血不同时间的允许治疗性干预被检查其调节不同程度的损伤程度的能力。例如缺血的长度的基础上所产生的损伤可以被归类为轻度(20分钟),中等(22分钟)或高(24分钟)。这些值是8周龄和被列为唯一的指导雄性BALB / c小鼠。办案应该建立自己的实验条件,因为这些根据小鼠品系,年龄,性别和用于评估肾功能的生化测定法将有所不同。
该模型已被成功地用于研究再生肾IRI与两个肾功能和结构恢复在随后的日子。的逐渐下降,血浆肌酐和尿素氮水平OBServed,与血浆肌酐返回到基础水平在第7天( 图4)。的H&E染色组织切片的评估表明,肾小管数量的增加被归类为健康或恢复时相比,第4天第7天,表明组织再生正在发生( 图5)。 5 - 溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)标记当局处死前有利于肾组织作的BrdU的免疫染色和肾小管细胞增殖后续量化。戏剧性核的BrdU表达观察4天肾IRI表明小管正在经历标记细胞的增殖,以便恢复小管的完整性和功能( 图6)。肾功能评估,评分为结构的改进和BrdU免疫组化的结合,使此模型可用于研究再生肾IRI。这使治疗性干预的长期效果是在vestigated。
最后,该模型的效用取决于全局缺血的感应到整个肾脏,这可能由血管中除了主左肾动脉供给肾的存在而受到损害。如果这些额外的容器没有夹紧然后肾脏的部分不会受到缺血性损伤( 图7)。
图1的结构肾小管损伤和再生的评分-健康的代表形态,恢复,受伤和肾小管坏死的肾脏组织切片卸下的4天之后肾IRI沾满PAS进行评估。位于OSOM肾小管内按照分类为健康,受伤,坏死或恢复细胞形态,完整性和核数与有代表性的例子突出。健康小管是否完好与正常的细胞形态。肾小管坏死表现出妥协单层具有明显的细胞损失和细胞形态的损失。受伤的小管表现出变薄的细胞单层,并含有较少的原子核。与此相对,回收细管表现出更正常的细胞形态和核的类似编号,健康小管。放大倍数:400倍,请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2伤-肾缺血损害肾功能岁雄性BALB / c小鼠8周进行了右肾切除和。左肾蒂被钳位为20,22或24分钟(每组n = 4时)。处死24小时以下的肾IRI小鼠。血浆肌酐和尿素氮显示严重程度的增加趋势,缺血的长度增加。虚线表示血浆肌酐和尿素氮在正常对照组小鼠中发现的水平。以平均值±标准差,并通过单因素方差分析的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3伤-肾缺血引起显著急性肾小管坏死男8周龄的BALB / c小鼠进行了右肾切除,左侧肾蒂是CL。功放为20,22或24分钟(N = 4元组)。处死24小时以下的肾IRI小鼠。代表性显微照片:从控制和受伤的肾脏H&E染色肾脏切片的OSOM(放大倍数200倍),说明ATN。 ATN的正式得分(表示为肾小管坏死的比例)确认损伤与缺血的增加持续时间的增加的水平。数据以平均值±标准差,并通过单因素方差分析(**** = P≤0.0001)进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4:再生-肾功能恢复肾缺血男FVB小鼠AG。编8 - 10周进行了右肾切除之前,缺血25分钟,左肾。小鼠处死1天(N = 10),4天(N = 10)或7天(N = 6)肾IRI。血浆肌酐和尿素氮稳步下降超过7天的过程中,血浆肌酐恢复到基础水平,说明肾功能恢复。数据以平均值±标准差,并通过单因素方差分析(*** = P≤0.001,* = P≤0.05)进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5再生-肾脏组织显示出复苏 的下列瑞纳迹象岁升缺血男FVB小鼠8 - 10周进行了右肾切除前,缺血25分钟,左肾。小鼠处死4天(N = 10)或7天(N = 6)肾IRI。代表性的显微照片:在OSOM的局部缺血的诱导(放大倍数200倍)示出。健康的数量,恢复,受伤或OSOM内肾小管坏死的正式计分评估PAS染色石蜡切片。在肾IRI仍然会出现受伤的OSOM中相当大的比例小管4天。但是7天中有被归类为健康或恢复肾功能指标的再生肾小管的比例大大增加。以平均值±标准差的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6:再生-戏剧肾小管细胞增殖明显4天肾缺血 8岁雄性FVB小鼠- 10周进行了右肾切除前,缺血25分钟,左肾。的BrdU(50毫克/千克)给予腹腔注射24小时前牺牲。小鼠处死4天(N = 10)或7天(N = 6)肾IRI。代表性的显微照片:从小鼠OSOM的(放大倍数200倍)处死4天及以下缺血诱导7天显示被。肾小管上皮细胞增殖,免疫组化染色的BrdU对石蜡包埋的肾脏切片评估。肾小管上皮细胞增殖定量计数BrdU阳性细胞核中的OSOM数量增加的细胞增殖明显在第4天。数据以平均值±SEM和学生t检验 (*** = P≤0.001)进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7。左肾脏缺血与非闭塞额外肾血管。不堵塞额外供血血管的肾脏导致不一致的缺血。 ( 一 )缺乏全球性肾缺血是由一个不均匀的颜色变化(白箭头)表示当微serrafine夹在位置。 (B)在除去微serrafine剪辑,主肾动脉和静脉是可见的(白色箭头),连同附加的血管供给肾(黑色箭头)的中,下极。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
肾IRI是AKI的一个重要原因,没有提供具体的治疗。肾脏IRI的实验研究已经在以前的工作表明巨噬细胞,树突细胞,淋巴细胞,调节性T细胞以及其他细胞和两者的急性损伤和愈合阶段5,8中感应介质的作用非常翔实- 16。此外,实验肾脏IRI已被用于评估各种治疗剂4,17-19的效果。
肾IRI这里详述的模型使用一个中线剖腹手术的方法来进行右肾切除,并用夹子诱发缺血左肾。如由代表性的结果示出,修改局部缺血的持续时间可以控制损伤的严重程度。因此,该模型可根据实际需要调整所带来的实验问题,诱导轻度,中度或肾损伤的高水平。但是,这种模型的一个限制是它是不适合的诱导非常严重肾损伤而造成长时间的肾缺血。由此产生的严重的急性肾功能不全可能导致显著的死亡率。
有此模型的几个方面是至关重要的,以便实现可预测的和可重复的肾损伤。变异与这种模式的一个主要来源可以从体温在缺血期20起源。因此,它是必不可少的体温维持在一个恒定的水平,并在整个局部缺血期间监测。在这个协议中有温度探头和homoeothermic毯控制单元是用来自动调节体温在37°C体温对肾缺血性损伤的易感性的影响被很好地描述。以前的工作已经表明,体温影响肾脏IRI 20和变异的小鼠的体温是一个潜在的干扰的严重程度因素可能影响结果的解释。另一个重要的考虑是,老鼠可能表现出与该供应左肾额外的血管解剖变异。这种额外的血管识别和执行的权利肾切除和诱导全脑缺血左肾闭塞时,这一点至关重要。如果不这样做,将导致整个肾脏缺血不一致。同样,左肾蒂左肾以下夹紧的颜色变化,应仔细研究为没有全局颜色变化表明额外肾动脉那些没有最初被鉴定的存在。
与此相反,利用双侧肾缺血模型,这个模型将有兴趣到谁正在使用的药品或其他代理人的预防性给药来调节基因的表达研究,蛋白质等前肾损伤。该钻机HT肾切除的组织可用于既确认和定量诱导或抑制中的每个个体实验动物感兴趣的分子的水平。这种模式也将有兴趣的研究人员在研究肾脏再生的急性损伤阶段之后是管状突出增生。
肾炎的一些实验模型是有限的显著病只能在小鼠中诱导的某些菌株。与此相反,肾IRI的模型这里描述的是通用的,并且可以同时适用于男性5和雌性4只小鼠,小鼠的不同菌株以及老年小鼠4。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
Standard Heat Matt | |||
Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
Lacri-Lube | Allergan | ||
Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).