Abstract
在胎儿小肠大部分形态过程已经推断出从固定的组织薄片，提供了发展阶段变化的快照。由薄的连续切片的三维信息可以是具有挑战性的，因为完美重构连续切片和保持组织在连续切片的适当定向的难度来解释。由格罗斯等人最近的研究结果，2011年重点在了解肠1的开发绒毛形态三维信息的重要性。单独使用标记的肠细胞的三维重建表明大多数肠上皮细胞的接触既心尖和基底表面。此外，肌动蛋白细胞骨架在上皮的顶端表面的三维重建表明肠腔是连续的，并且次要流明是第一个工件ectioning。这两点，伴随着interkinetic核移植的肠上皮示范，明确了发展中肠上皮为假复层上皮，不分层，如以前认为1。观察到上皮三维的能力是开创性到证明了这一点，重新定义上皮形态在胎儿肠。用多光子成像技术和三维重建软件的演化，能够可视化完好，显影机构正在迅速提高。双光子激发可损害较小穿透更深的组织具有较高的分辨率。双光子成像和三维重建整个胎鼠肠中的沃顿等人 ，2012帮助定义绒毛生长2的格局。在这里，我们描述了整个器官培养系统，使离体的发展是文化系统的绒毛和扩展，使肠道是三维的开发过程中进行成像。
Protocol
注：所有小鼠，采用经美国密歇根医学院单位的大学实验动物医学根据大学委员会关于利用动物和护理的指导方针的协议处理人道。
1，全器官培养系统
- 传媒与文化板块的准备
- 在组织培养罩，从股市瓶取出5毫升BGJb媒体加入5 ml青霉素/链霉素的。准备媒体工作的股票在50毫升离心管中，加入1毫升5毫克/毫升抗坏血酸49毫升BGJb媒体（含青霉素/链霉素）。
- 加入1 ml下面各转孔的准备了6孔培养板。
注意：如果不使用所有的6转孔，将多余的转孔进入一个新的无菌6孔培养板，供以后使用。再加上工作BGJb媒体每三个10厘米无菌培养皿中3毫升。
- 解剖准备
- 浸泡解剖工具，70％ETHA北环线，一定要保持清洁工具在工作时。
- 设置了一个大冰桶的解剖区域，并放置在6孔培养板和10毫米培养皿中与BGJb介质上的冰。冰一样多，而解剖和准备肠道对文化工作成为可能。
- 麻醉的成年雌性小鼠与异氟烷（100微升）之前安乐死颈椎脱位胎儿肠道的收获室。
- 之后，从他们的母亲收获的胎儿，舞台仔细按照Theiler分期图表13每胎。不要依赖于天后性交，以确定每胎为最多24小时的发育阶段变化的时代中的一个垃圾例行观察。
- 胎儿肠道的解剖
- 之前去除肠子安乐死胎儿被斩首。
- 解剖在1×Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）各肠然后PLACE成10cm的培养皿与工作BGJb媒体。
- 小心地从胃健脾和胃和十二指肠上部的胰腺。
- 轻轻分开网膜照顾到离开附尽可能和分离的连接仅足够大网膜，以允许在肠道被拉直。
注：对于比E14.5老年人或那些被培养超过24小时，肠，轻轻分开肠道分成3个相等的段，以允许腔内容物的流动通过肠和从切割端排出。然而，对于培养开始之前，E13.5，等待培养直到24小时后分离出肠的3个区段，以使浆膜到正常生长在肠的长度之前。 - 用吸管口在肠道件转移到培养皿（1.1.2）的转孔。
- 根据需要，使它们径直穿过transwel轻轻地重新定位肠升。
注意：一旦肠道开始通过管道移动管腔内容，在肠道内的任何扭结会导致备份和损害肠道。
- 文化与治疗
- 从Transwell小下取出介质，加入700μl处理介质（工作介质添加了重组蛋白或药物抑制剂）的transwell小下。
- 加入300μl的处理介质滴加于肠内的顶部，并允许它浸泡通过transwell小。重新定位的肠子是必要的。
- 至少每日一次，或更频繁地更换处理介质取决于治疗试剂的半衰期。
- 治疗试剂的局部源制备蛋白浸泡琼脂糖珠
- 悬浮琼脂糖珠在自己的存储容器，并转移100微升的琼脂糖珠到1.5 ml离心管中。
- 填充管的其余容积用无菌1X博士osphate缓冲盐水（PBS）中并混合的珠子洗涤。将离心管中的齿条几分钟以使珠沉降至底部，然后从上珠粒顶端吸取掉PBS中。重新填充离心管中，用无菌1×PBS中，并重复洗涤过程两次以上。
- 制备所关注的蛋白的两倍所需的治疗浓度。
- 混合5微升的洗涤过的琼脂糖珠与5微升的2个蛋白存量，并轻轻搅拌中的蛋白质的珠。放置在冰上的管中1小时后，混合轻轻地每10-15分钟。
- 把珠子上的肠子前在无菌1X PBS冲洗短暂的珠子。
- 琼脂糖珠安置
- 轻轻将琼脂糖珠上使用吸管口用毛细管拉针肠子上。将珠子非常谨慎的粗糙处理会损害肠道，防止绒毛发展中的受伤部位。
- 将两倍多珠需要进行分析，因为肠子会发生蠕动和大约一半的放置会滚下肠子在培养时间的珠子。
- 培养肠道内固定
- 小心地从transwell小下面取出处理介质，并允许肠内空气干燥3分钟。
- 加入1 ml固定液的transwell小室下2分钟，然后盖与2ml固定液为的固定时间剩余肠道的顶部。修正了4％多聚甲醛在o / n 4℃或2小时在室温。
2，修正了影像的肠子
- Wholemount成像
- 将整个肠子（与内源性荧光）上用100微升1X DPBS的幻灯片。使用镊子轻轻地安排肠子。
- 使用实验室的组织，以小心地取出DPBS，立即加入100微升70％的甘油，使组织MO再透明，提高成像的可能深度。
注：不是安装在70％甘油中的肠如果肠的进一步渗透是期望的，浸泡在几滴焦点清除溶液中的肠10-30分钟。吸管关闭对焦清晰的解决方案，并安装与安装清除肠道。 - 每个四角盖玻片动用橡皮泥，拿起少量粘土使用的幻灯片和盖玻片之间的间隔，以保持盖玻片从压扁的肠道。
- 密封盖玻片上施加，用棉签融化VALAP的幻灯片。
- 图片上无论是直立或倒置的共聚焦显微镜的肠子。请参阅更详细的讨论。
- 固定肠子Vibratome切片（肠结构的剖视图）
- 在7％琼脂糖嵌入肠子在小塑料模具（10×10×15毫米），并允许将琼脂糖块冷却和固化。
- 从塑料模具和琼脂糖胶块与瞬间胶的vibratome收集阶段取出琼脂糖块。
- 填用冰冷的1X DPBS收集阶段。
- 切段在100-150微米之间的厚度。对于较厚的部分使用结算解决方案（在2.1.2节中描述），以可视化更深的横截面。
- 倾从收集阶段vibratome节到6孔板中存储的阱，在4℃。
- 固定，vibratome切片组织免疫荧光染色
- 将每口井5-12 vibratome节到24孔板与1X DPBS。
- 删除1X DPBS和每孔加入500μl的通透的解决方案。轻轻摇动样品在室温下25分钟。
- 透化后，用1×PBS洗涤样品3次。
- 阻断样品中加入500μl封闭液中的至少30分钟。
- 后堵，E交换网板用500μl稀释在封闭溶液中的初级抗体的阻断溶液并保持样品在4℃CO / N。
注：在冰冻和石蜡切片工作，以及一抗稀释液一般在vibratome部分工作得很好，但抗体需要核抗原修复一般不与本协议（ 例如，BrdU的）工作。 - 翌日，每次用封闭溶液洗涤样品3次，持续15分钟。
- 洗涤后，将500μl的稀释在封闭溶液中的二级抗体。包裹24孔板中的铝箔，以保护荧光团从光，并摇动样品45分钟至2小时，在室温。
- 用1×PBS洗涤样品3次，每次15分钟，并在第2.4节中所述安装在滑轨的vibratome部分。
- 安装vibratome节
- 准备幻灯片vibratome安装切割薄片双STICK胶带，并把它们沿着滑动的长边。
- 小心地放置在幻灯片上的双面胶的5-10 vibratome节下降100μL1X PBS中。
- 展开所有部分，并蔓延出来到对面的幻灯片单层。
- 删除多余的琼脂糖或不均匀位，防止盖玻片从坐在平坦。
- 小心使用实验室的组织来吸收多余的1X PBS来自各地的vibratome部分。
- 加一滴含水安装介质上的vibratome部分的顶部，然后盖玻片。
- 密封盖玻片上融化的VALAP应用，用棉签幻灯片。
- 图片上无论是直立或倒置的共聚焦显微镜的vibratome部分。请参阅有关选择的成像系统的进一步的细节进行讨论。
3，现场全肠道的影像学
肠子从fetuse收获ŠE12.5后，与所连接的大网膜原封不动，成功地利用上述系统开发绒毛文化。因此，本体外系统允许显影肠可重构的形态随时间的三维视图的活的z截面图像的捕捉。
- 建立实时成像
- 使用瞬间胶，坚持个人的聚碳酸酯膜细网筛。这提供了一个支架支撑，以保持肠道到位直立共聚焦显微镜的镜片浸泡在下面。请参考讨论部分对选择实时成像显微镜进一步的细节。
- 将网筛在中心以及文化板块。
- 将解剖肠到聚碳酸酯膜，并在两端加一滴瞬间胶。仅使用足够的胶水贴上肠道，而不是大衣呢！
- 添加酚红培养基免费聚碳酸酯以下膜在中心孔的培养板。
- 加水至培养板的外边缘，以提供湿度。
- 由于胎儿肠管发生在文化收缩蠕动，像波浪一样，加入100μl的1：在1X PBS溶液5甲苯噻嗪〜3毫升的媒体控制肠道而成像的运动。这个剂量控制肠道运动约8-10小时，不影响绒毛的发展。
- 对于肠道的横向视图，嵌入在3-4％琼脂糖溶液活肠切成厚的部分（150-500微米）上vibratome。匹配与肠的刚度琼脂糖的刚性被切割和经验确定的发育阶段。一般情况下，3％的琼脂糖溶液可以很好地用于肠道年龄小于E14.5和4％的溶液可以很好地用于肠E15-E16。
- 胶水vibratome部分以聚碳酸酯膜贴在网筛（如第3.1.1节），并培养第3.1.2-3.1.6所述。
- 利用双光子共聚焦荧光显微镜（690-1,040纳米之间的激光激发）上直立架与可调表进行实时成像。
- 双光子激光调谐到900nm的为用户提供了GFP信号的最佳分辨率深层渗透。它减少了损伤的组织，而成像。此外，激光的功率设定为尽可能低的排放量减少的组织损伤。通常，得到的GFP的良好激发，用12％的功率上的双光子激光。
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Representative Results
胎儿肠的整个外植体的培养可为位置的信号分子的坐标肠的发展，分配，和持续时间的分析，因为该系统能够与药理学试剂或重组蛋白质的信令的操作。 Transwell小培养系统（ 图1A中 ，从沃尔顿等再现。，2012）2提供了一种空气-液体界面，这使得它能够与毒品或蛋白质浸泡琼脂糖珠放置到组织中，从而建立本地信令资源（ 图1B ）。肠子从胚胎E10到E18.5收获的文化生存的转孔并进行移动的蠕动，像波浪一样。肠子文化开始从E13.5存活约10天或约到P3，鼠标的发展时，首先观察隐窝的形成阶段。虽然早期肠内的文化生存，前肠收获E12.5不出现绒毛可靠，可能是因为浆膜尚未生长完全覆盖肠由该时间。骨髓间充质集群形成和绒毛开始出现，并延长在肠道开始培养在E12.5，E13.5和E14.5，但与未培养，舞台相匹配的对照（ 图1，从沃顿等复制相比发展稍有延迟人 ，2012）2。无论在肠道的培养（E12.5-E14.5）的开始的阶段，肠子总是出现有24小时的近似延迟。在培养基中生长两天，E14肠呈现增长绒毛是更类似于E15肠比在子宫内 （ 图1C-F）2生长E16肠绒毛。
间充质簇的规律是由一个整体PDGFRαGFP / +肠的光学切片的三维重建在E15.5（ 图2中显示</ STRONG>，转载自沃顿等人，2012）2。此图像由Z-堆栈的图54的字段，通过在Leica LAS-AF软件被缝合在一起。肠道内的每一个点是由核绿色荧光蛋白标记的PDGFRα座14可视化表达间充质集群。该高分辨率图像的允许观众放大，在某些领域，研究的细节，但提供了在不能从视图或更低的功率放大单个字段中收集深度的空间关系。 电影1是一系列通过缝合Ž步进-stack图像是三维重构图2中的各个光的部分适合的细节进一步可视化，如在群集内的单细胞。
肠血管wholemount免疫与PECAM抗体的光学部分（BD Pharmingen公司557355;稀释1:1,000）用双光子激发和侦察捕获structed用了Imaris软件（ 图3）。这个三维的肠血管视图表明脉管系统的一个复杂的网络，它不能由薄膜部准备充分理解。 电影2，重建图像的图3中的一个旋转的三维投影，允许对如何进一步升值通过提供三维重建增加信息可以提高结构图案化的理解。
Vibratome切片允许立体观看的肠管从横向有利。在图4中，显影簇的关系（标有PDGFRαGFP / +）14与上皮和周围间质（标有膜番茄（ROSA26 MT /毫克）15被观察到。
可替换地，这个关系可通过抗体immunofluore观看间充质簇杨继明染色（ 图5）（绿色，用抗PDGFRα（圣克鲁斯C-20; 1:200稀释））与上皮细胞（红色，标有抗Ecadherin（BD转导研究实验室610181; 1:1,000稀释）。
这整个器官培养系统也可以被扩展以允许显影胎儿肠的双光子成像。在此设置中，在胎儿肠胶合到聚碳酸酯膜用网筛在一个较大的培养板支撑（ 图6）。将培养板中较大的井的尺寸允许用于共焦显微镜透镜接触肠道内很好。
在Transwell小文化系统如图1所示。发展的整个胎儿的肠子。 （A）置于Transwell小纪念品胎儿肠期Brane在6孔培养板BGJb媒体。前两名肠子都E12.5，底部有两个肠子都E13.0（B）牛血清白蛋白浸泡琼脂糖珠（淡蓝色）放置在Transwell小文化系统中的十二指肠。在深蓝色染色为X-gal染色用于PTC 的LacZ / +在记者刺猬鼠标线间充质集群新鲜收获E14.0（C）E15.0（D）和E16的16。（CF）的横截面。沾了E-cadherin的（绿色）和DAPI（蓝色）0（E），十二指肠组织。在E14.0时，unremodeled上皮仍假复层，而在E15.0和E16.0，新生的绒毛是可见的（F）的肠段相同，可见于（C）中，但培养两天（E14 + 2天）表明，绒毛发展，在文化，虽然略有推迟。面板（CF）是由沃尔顿等转载。，2012 2 SUP>。比例尺为50微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2三维重建的Z-堆栈从E15.5 wholemountPDGFRαEGFP / +肠缝合领域的形象是部分重建54缝合场（距离市中心65 Z-节5 1微米的部分）的视图上使用一个倒DMI 6000待机用双光子激光激发，在900 nm处LeicaSP5X共焦显微镜的电动载物台捕获。徕卡LAS-AF软件缝合的Z堆叠在一起以形成整个图像。比例尺是1毫米。
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图3：三维重建的光学截面图，显示在一个E14十二指肠肠血管wholemount抗PECAM免疫。光学切片捕获在上一个直立的DMI 6000 LeicaSP5X共聚焦显微镜观察站与双光子激发，在900 nm和三使用了Imaris 7.6.1软件三维重建。比例尺为200μm。
图4共聚焦vibratome切片E15.5PDGFRα 绿色荧光蛋白的图像/ +; ROSA26 mTmG空肠显示PDGFRαEGFP / +细胞的间充质团（绿色）其上覆上皮的紧密联系和周围的间质细胞（红色;膜番茄从ROSA26 mTmG）。< /强>比例尺是50微米，在上板和25μm的在下部面板。
共焦图象的从E15.5 vibratome剖肠即分别为抗体免疫荧光染色的图5的三维重建。比例尺为50μm。
图6。适应Transwell小文化系统的双光子实时成像。 （A）的网筛放置在培养皿中（B）的聚碳酸酯膜粘接在网筛（C）肠粘到聚碳酸酯膜和具有酚的DMEM培养基中培养。
电影2旋转动画表示在图2中PECAM染色的血管系统中的E14十二指肠的光学切片的三维重建 。
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Discussion
动态性和发展肠道复杂的组织相互作用的，需要三维可视化有这些形态发生事件的全面理解。随着不断变化的影像技术，能够检查绒毛形态进行了详细的发展/改善有了它，空间通信和交互的器官形成期的理解大大提高。
另一种方法培养整个肠子也进行了测试，但Transwell小系统仍是最可靠的更长的培养时间，并维持正常的集群和绒毛图案。三维培养系统（基质胶或胶原蛋白）的工作以及为年轻的肠子（E12.5-E15.5）的简称文化时期（少于24小时），但一旦肠道开始蠕动经历类似的运动和分泌酶和浪费入管腔，所述三维基材不保持良好。在液体培养肠也是会但是发展，缺乏支持或参考的方向，在一个自由浮动的文化似乎改变集群和绒毛的正常模式。因此，在Transwell小室系统是优选的，以检查集群构图和绒毛出苗和生长。
对于wholemount实时成像与不严格的设置另一种方法是使用minutien引脚贴上胎儿肠管至7％琼脂糖在35×10毫米的钢板的底部薄薄的一层。虽然这种方法是更容易设置， 请注意其使用仅限于年轻的阶段（E12.5-E15.5）或者更短的培养时间，因为基质胶不会容纳肠分泌物。
以制备的培养板中，倒入足够熔化7％琼脂糖只覆盖一个35×10mm的板的底部。放置一个玻璃毛细管在琼脂糖的中心，而它仍然是延展性。一旦琼脂糖已经凝固，取出的玻璃毛细管，并将吨他胎儿肠管沿广受毛细创建。与基质胶填充的毛细管以及围绕肠并将培养皿在37℃，直至基质胶集。小心添加酚红的DMEM培养基。将一个60×15毫米的钢板内的35×10毫米的钢板，并填写60毫米的钢板用清水营造湿热试验箱。
选择的安装方法（wholemount或vibratome）实时成像是基于对被可视化的区域的所需取向。例如，要查看通过wholemounted改变肠道上皮细胞形态，Z-堆栈提供意见心尖和基底表面。要查看interkinetic上皮片内的上皮细胞的核移植，vibratome部分允许在（横向）查看结束，观察心尖和基底表面。
样品的制备是得到最好的成像效果的关键。当使用vibratome部分的ND标准共聚焦显微镜，良好的分辨率可以达到最高的深度为75μm无结算试剂。目前，结算试剂活样品尚未确定，以便成像的深度是有限的。用于固定试样，采用一块空地试剂可以大大提高成像的深度。发现提供最佳的形态和分辨率结算试剂为重点清除17。结算焦点清晰，安装在Mount清晰30分钟后，胚胎肠道的各个阶段的整个深度可拍摄具有优异的分辨率。一个不太昂贵的清除方法是70％甘油，渗透于胚胎组织的，不过最大深度为150m的，此后的分辨率和信号强度都将丢失。
一个重要的注意事项是，信号在被安装并成像在同一天的染色完成的样品最限定。与信号保持水的安装介质安装（如延长黄金的抗褪色溶液（Life Technologies公司P36930）也有助于保持信号，但只有短暂;最清晰的图像总是染色和固定的样品后，立即得到。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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