Abstract
Die meisten morphogenetische Prozesse in der fetalen Darm haben von Dünnschnitten von fixierten Gewebe entnommen worden, die Bereitstellung Schnappschüsse von Veränderungen über die Entwicklungsstadien. Dreidimensionale Informationen aus dünnen Serienschnitten kann eine Herausforderung sein, wegen der Schwierigkeit der Rekonstruktion Serienschnitte perfekt und die Aufrechterhaltung der richtigen Ausrichtung des Gewebes über Serienschnitte zu interpretieren. Jüngsten Erkenntnisse Grosse et al., 2011, die Bedeutung der dreidimensionalen Informationen für das Verständnis der Morphogenese der Entwicklungs Zotten des Darms 1. Dreidimensionale Rekonstruktion des einfach markierten Darmzellen zeigte, dass die Mehrheit der intestinalen Epithelzellen treten sowohl die apikale und basale Oberflächen. Weiterhin dreidimensionale Rekonstruktion des Aktin an der apikalen Oberfläche des Epithels zeigte, dass die Darmlumen kontinuierlich ist und dass die sekundäre Lumen ein Artefakt sectioning. Diese zwei Punkte, zusammen mit dem Nachweis der interkinetic Kernwanderung im Darmepithel, definiert die Entwicklungs Darmepithel als mehrreihigen Epithel und nicht wie bisher angenommen geschichtete 1. Die Fähigkeit, das Epithel dreidimensional beobachten war wegweisend für demonstriert diesen Punkt und die Neudefinition epithelialen Morphogenese in der fetalen Darm. Mit der Entwicklung der Mehrphotonen-Bildgebungstechnik und dreidimensionale Rekonstruktionssoftware, die Fähigkeit zu visualisieren intakt Entwicklungsorgane rasch verbessert. Zwei-Photonen-Anregung ermöglicht weniger schädliches Eindringen tiefer in Gewebe mit hoher Auflösung. Zwei-Photon-Imaging und 3D-Rekonstruktion der gesamten fötalen Mausdarm in Walton et al., 2012, half, das Muster der Zotten Auswuchs 2 definieren. Hier beschreiben wir eine ganze Organkultursystem, das ex vivo Entwicklung der Zotten und Erweiterungen dieser Kultur-System ermöglicht, damitder Darm dreidimensional in ihrer Entwicklung dargestellt werden.
Protocol
HINWEIS: Alle Mäuse wurden mit human Protokolle, die von der University of Michigan Medical School Einheit für Labortiermedizin zugelassen und nach den Richtlinien der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren behandelt.
1. Vollorgankultursystem
- Herstellung der Medien und Kulturplatten
- In einer Gewebekultur Haube, entfernen 5 ml BGJb Medien aus der Flasche und 5 ml Pen / Strep. Bereiten Sie einen Arbeitsvorrat von Medien in einem 50 ml konischen Röhrchen, durch Zugabe von 1 ml 5 mg / ml Ascorbinsäure bis 49 ml BGJb Medien (mit Pen / Strep).
- Bereiten Sie eine 6-Loch-Kulturplatte durch Zugabe von 1 ml unter jedem der Transwells.
HINWEIS: Wenn alle 6 Transwells nicht verwendet werden, bewegen zusätzlichen Transwells in eine frische sterile 6-Well-Platte für die spätere Verwendung. 3 ml Arbeits BGJb Medien zu jedem der drei 10 cm sterile Petrischalen.
- Vorbereitung für die Präparation
- Weichen Sie sezieren Tools in 70% Ethanolnol und sicher sein, die Werkzeuge sauber zu halten, während der Arbeit.
- Einrichten der Sektionsbereich mit einem großen Eiskübel und platzieren Sie den 6-Loch-Kulturplatte und 10 cm Petrischalen mit BGJb Medien auf Eis. Arbeiten auf Eis, so viel wie möglich, während sezieren und die Vorbereitung der Darm für die Kultur.
- Betäuben erwachsenen weiblichen Mäusen in einer Kammer mit Isofluran (100 ul) vor der Euthanasie durch Genickbruch für die Ernte der fetalen Darm.
- Nach der Ernte der Föten von ihrer Mutter, zu inszenieren jeder Fötus sorgfältig nach dem Theiler Inszenierung Grafik 13. An den Tagen Verlassen Sie sich nicht nach dem Koitus auf das Alter des Fötus als Variationen von bis zu 24 Stunden in Entwicklungsstufe werden routinemäßig in einem einzigen Wurf beobachtet zu bestimmen.
- Dissektion der fetalen Darm
- Euthanize Föten durch Enthauptung vor der Entfernung der Eingeweide.
- Sezieren jeden Darm in 1x Dulbecco Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) und dann place es in eine 10 cm Petrischale mit Arbeits BGJb Medien.
- Die Milz aus dem Magen und die Bauchspeicheldrüse aus dem Magen und Zwölffingerdarm oberen vorsichtig entfernen.
- Trennen Sie vorsichtig das Netz darauf achten, dass die Netz so weit wie möglich und Trenn Verbindungen nur genug befestigt lassen, damit der Darm begradigt werden.
HINWEIS: Für Darm älter als E14.5 oder den Personen, die länger als 24 Stunden kultiviert, sanft trennen den Darm in 3 gleich große Segmente zu ermöglichen luminalen Inhalte durch den Darm fließen und von den Schnittenden ausgeschlossen werden. Für Kulturen begannen vor E13.5 warten, bis nach 24 h der Kultivierung vor Abtrennen der 3 Segmente des Darms, damit der Serosa ordnungsgemäß über die Länge des Darms wachsen. - Verwenden Sie einen Mund pipettieren, um die Darmstücke auf die Transwells von der Kulturplatte (1.1.2) zu übertragen.
- Vorsichtig positionieren den Darm nach Bedarf, so dass sie gerade über die transwell.
Hinweis: Wenn der Darm beginnen, sich luminalen Inhalte durch die Röhre, werden alle Knicke im Darm ein Backup und eine Beschädigung des Darmes führen.
- Kultur und Behandlung
- Entfernen Sie die Medien unter dem Transwell, fügen Sie 700 ul der Behandlung Medien (Arbeitsmedien mit Mehr rekombinanten Proteinen oder pharmakologische Inhibitoren) im Rahmen des Transwell.
- Fügen Sie 300 ul Behandlungsmedien tropfenweise auf der Oberseite des Darms und lassen Sie es durch die Transwell einweichen. Positionieren Sie den Darm wie nötig.
- Ändern Behandlungsmedien mindestens einmal täglich oder öfter in Abhängigkeit von der Halbwertszeit des Behandlungs Reagenz.
- Herstellung von Protein-Agarose-Kügelchen eingeweicht für eine lokalisierte Quelle der Behandlung Reagenz
- Resuspendieren der Agarose in ihren Vorratsbehälter und dann 100 ul Agarosekügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Füllen Sie die restliche Volumen des Rohres mit sterilem 1x Phosphate Kochsalzlösung (PBS) und mischen Sie die Perlen, um sie zu waschen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Rack für ein paar Minuten, damit die Perlen am Boden absetzen und dann pipettieren Sie das PBS von oben auf den Perlen. Füllen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit sterilem 1x PBS und zweimal wiederholen Sie den Waschprozess.
- Vorbereitung für das Protein von Interesse auf das Zweifache der für die Behandlung gewünschten Konzentration.
- Mischen 5 ul gewaschenen Agarose-Kügelchen mit 5 ul der Protein 2x Lager und sanft schütteln die Perlen in das Protein. Das Röhrchen auf Eis für 1 h, vorsichtiges Mischen alle 10-15 min.
- Spülen Sie die Perlen kurz in sterilem 1x PBS, bevor Sie die Perlen auf den Darm.
- Platzierung von Agarose-Beads
- Sanft legen Sie die Agarose-Kügelchen auf der Oberseite der Darm mit Hilfe eines mit dem Mund pipettieren gezogen Kapillarnadeln. Legen Sie die Perlen mit äußerster Vorsicht als grobe Behandlung wird den Darm beschädigen und zu verhindern villus Entwicklung in den verletzten Bereich.
- Legen Sie doppelt so viele Perlen wie für die Analyse benötigt werden, da der Darm wird peristaltische Bewegungen und etwa die Hälfte der Perlen gelegt wird weg von den Darm über die Kultivierungszeit rollen zu unterziehen.
- Fixierung von kultivierten Darm
- Die Behandlungsmedien vorsichtig aus unterhalb des Transwell und lassen den Darm an der Luft trocknen für 3 min.
- 1 ml Fixativ unter der Transwell für 2 min, dann decken die Spitze der Darm mit 2 ml Fixiermittel für den Rest der Fixierungszeit. Fix mit 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C oder für 2 Stunden bei RT.
2. Imaging von Fest Darm
- Wholemount-Bildgebung
- Stelle sämtliche Darm (mit endogenen Fluoreszenz) auf einem Objektträger mit 100 ul 1x DPBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig arrangieren den Darm.
- Verwenden Sie ein Labor Gewebe vorsichtig die DPBS und sofort 100 l 70% Glycerin, um das Gewebe zu machen mowieder transparent und erhöhen die mögliche Tiefe der Bildgebung.
HINWEIS: Wenn ein weiteres Eindringen des Darms gewünscht wird, statt die Montage der Darm in 70% Glycerin, genießen den Darm in ein paar Tropfen von Focus Klare Lösung für 10-30 min. Pipettieren Sie den Fokus Klare Lösung und montieren Sie den Darm mit dem Berg Klar. - Tauchen Sie jede der vier Ecken eines Deckglases in Knetmasse und holen Sie eine kleine Menge von Ton zu als Abstandshalter zwischen dem Schieber und Deckglas zu verwenden, um das Deckglas aus Abflachung der Darm zu halten.
- Deckglas auf den Objektträger mit geschmolzenem VALAP mit einem Wattestäbchen aufgetragen.
- Bild der Darm entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details.
- Vibratom Schnitte von Fest Darm (zum Querschnitt der Darmstrukturen)
- Einbetten Darm in 7% Agarose in kleinen Kunststoffformen (10 x 10 x 15 mm) und damit die Agarose-Blöckeabkühlen und sich verfestigen.
- Entfernen Agarose-Blöcke aus den Kunststoffformen und Leim Agarose-Blöcke auf die Sammlung Vibratom Bühne mit Sekundenkleber.
- Füllen Sie die Sammelphase mit eiskaltem 1x DPBS.
- Zuschnitte mit einer Dicke zwischen 100-150 um. Bei dickeren Abschnitte verwenden Clearing-Lösungen (in Abschnitt 2.1.2 beschrieben) tiefer in den Querschnitt zu visualisieren.
- Pour Vibratom Abschnitte der Sammelstufe in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Lagerung bei 4 ° C ist.
- Immunfluoreszenzfärbung von festen, Vibratom geschnitten Gewebe
- Zeigen 5-12 Vibratom Abschnitte pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit 1x DPBS.
- 1x DPBS entfernen und fügen 500 ul Permeabilisierung Lösung pro Vertiefung. Schaukeln die Proben für 25 min bei RT.
- Nach Permeabilisierung, waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS 1x.
- Block die Proben für mindestens 30 min in 500 ul Blockierungslösung.
- Nach dem Blockieren exchange der Blockierungslösung mit 500 ul primäre Antikörper verdünnt in Blockierungslösung und halte die Proben bei 4 ° CO / N.
HINWEIS: Die primären Antikörperverdünnungen, die auf gefrorenen und Paraffinschnitten gut funktionieren in der Regel gut auf Vibratom Abschnitte zu, jedoch erfordern Antikörper im Kern Antigen-Retrieval in der Regel nicht gut mit diesem Protokoll (zB BrdU) zu arbeiten. - Am folgenden Tag, waschen Sie die Proben 3 mal für 15 min mit je Blockierlösung.
- Nach dem Waschen anzuwenden 500 ul des sekundären Antikörpers in Blockierlösung verdünnt. Wickeln Sie die 24-Well-Platte in Alufolie, um die Fluorophore von Licht für 45 min bei RT schützen und rocken die Proben 2 Stunden.
- 3 mal waschen die Proben mit 1x PBS für jeweils 15 min und montieren Sie die Vibratom Abschnitte auf Objektträger, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben.
- Montage Vibratom Abschnitte
- Bereiten Sie Folien für Vibratom Montage durch Schneiden von dünnen Scheiben der Doppel-stick Band und indem sie entlang der langen Seiten der Folien.
- Vorsichtig 5-10 Vibratom Abschnitte zwischen dem doppelseitigem Klebeband auf den Folien in einem Tropfen von 100 ul 1x PBS.
- Entfalten alle Abschnitte und breitete sie in einer einzigen Schicht über die Rutsche.
- Entfernen Sie überschüssiges Agarose oder unebenen Bits, die einen Deckglas aus dem Sitzen Flach verhindern würde.
- Sorgfältig einen Labor Gewebe aus der ganzen Vibratom Abschnitte tanken überschüssige 1x PBS.
- Fügen Sie einen Tropfen wässrigen Eindeckmedium auf der Oberseite der Vibratom Abschnitte und dann das Deckglas.
- Verschließen Sie die Deckgläser auf die Objektträger mit zerlassener VALAP angewendet mit einem Wattestäbchen.
- Bild die Vibratom Abschnitte entweder aufrecht oder invertiert konfokalen Mikroskop. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Details zur Auswahl eines Abbildungssystems beziehen.
3. Live-Imaging von Whole Darm
Darm von fetuse geerntets nach E12.5, mit dem angeschlossenen Netz intakt gelassen, erfolgreich zu entwickeln Zotten in Kultur unter Verwendung der oben System. Daher ermöglicht diese ex vivo-System die Erfassung von lebenden z-Schnittbilder der Entwicklungs Darm, die eine dreidimensionale Ansicht der Morphogenese im Laufe der Zeit wieder aufgebaut werden kann.
- Einrichten Live-Bildgebung
- Sekundenkleber verwenden, eine individuelle Polycarbonatmembran auf ein feinmaschiges Sieb zu halten. Dies bietet eine Unterstützung Gerüst, um den Darm an Ort und Stelle unter dem Eintauchen Linse des konfokalen Mikroskop aufrecht zu halten. Bitte beachten Sie die Diskussion Abschnitt für weitere Details über die Auswahl der Live-Bildgebung Mikroskope beziehen.
- Legen Sie die Mesh-Bildschirm in der Mitte und einer Kulturplatte.
- Legen Sie die seziert Darm auf die Polycarbonatmembran und einen Tropfen Sekundenkleber an jedem Ende. Verwenden Sie nur ausreichend Leim, um den Darm zu befestigen, aber nicht überziehen es!
- Fügen Kulturmedien frei von Phenol-Rot unter dem PolycarbonatMembran in der Mitte und von der Kulturplatte.
- Wasser hinzufügen, um den äußeren Rand der Kulturplatte gegen Feuchtigkeit bieten.
- Da die fötalen Darm erfährt peristaltische artige Kontraktionswellen in der Kultur wird mit 100 ul einer 1: 5-Lösung von Xylazin in 1x PBS bis 3 ml Medium, um die Bewegung des Darmes während Abbildungs steuern. Diese Dosierung wird Darmbewegungen für etwa 8-10 Stunden ohne Kompromisse villus Entwicklung steuern.
- Für eine Queransicht des Darms, die Live-Darm einbetten in einer 3-4% igen Lösung und schneiden dicke Abschnitte (150-500 um) auf einem Vibratom. Entsprechen die Steifigkeit der Agarose mit der Steifigkeit des Darms geschnitten und empirisch ermittelt die Entwicklungsstadium. Im Allgemeinen wird eine 3% Agarose-Lösung eignet sich gut für Darm jünger als E14.5 und eine 4% ige Lösung funktioniert gut für Darm E15-E16.
- Kleben Sie die Vibratom Abschnitte, um eine Polycarbonatmembran mit einem Mesh-Sieb angebracht (wie in Abschnitt 3.1.1) undKultur, wie in Abschnitt 3.1.2-3.1.6 beschrieben.
- Führen die Echtzeit-Bildgebung unter Verwendung einer Zwei-Photonen konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Anregungslaser zwischen 690-1,040 nm) an einem aufrechten Ständer mit einem abstimmbaren Tabelle.
- Zwei-Photonen-Laser bis 900 nm tiefe Penetration mit der besten Auflösung für GFP-Signale bietet abgestimmt. Es reduziert Schäden an Geweben während Imaging. Darüber hinaus die Einstellung der Leistung des Lasers auf das geringstmögliche Emissions verringert Gewebeschäden. Typischerweise, um eine gute Anregung von GFP zu erhalten, verwenden 12% der Leistung auf der Zwei-Photonen-Laser.
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Representative Results
Kultur ganzer fötaler Explantate Darm ermöglicht die Analyse der Lage, die Verteilung, und die Dauer der Signalmoleküle, die Darmentwicklung zu koordinieren, da dieses System ermöglicht die Bearbeitung der Signalisierungs pharmakologische Reagenzien oder rekombinante Proteine. Die Transwell-Kultursystem (1A, von Walton et al wiedergegeben., 2012) 2 stellt ein Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle, die es ermöglicht, Wirkstoff-oder Protein getränkt Agarosekügelchen auf das Gewebe zu platzieren und dadurch das die lokale Signalquellen ermöglicht (1B ). Darm von Embryonen im E10 E18.5 geerntet überleben in Kultur auf Transwells und unterliegen peristaltische-wie Wellen der Bewegung. Darm begann in der Kultur von E13.5 überleben etwa 10 Tage oder rund um P3, der Phase der Entwicklung der Maus, wenn Kryptenbildung zuerst beobachtet. Obwohl frühzeitig Darm in Kultur überleben, geerntet Darm vorE12.5 nicht Zotten entstehen zuverlässig, wahrscheinlich, weil die Serosa ist nicht gewachsen, um den Darm zu diesem Zeitpunkt vollständig zu bedecken. Mesenchymalen Cluster zu bilden und Zotten beginnen zu entstehen und verlängern in Eingeweiden begann in Kultur bei E12.5, E13.5 E14.5 oder, wenn auch die Entwicklung etwas verzögert im Vergleich zu ungebildet, Bühnen abgestimmte Kontrollen (Abbildung 1, von Walton et wiedergegeben al., 2012) 2. Unabhängig von der Phase des Darms zu Beginn der Kultur (E12.5-E14.5), die Eingeweide erscheinen immer eine ungefähre Verzögerung von 24 Stunden. E14 Darm in der Kultur für zwei Tage gewachsen zeigen Wachstum der Zotten, die mehr Ähnlichkeit mit denen von E15 Darm als Zotten E16 Darm in utero (1C-F) 2 gewachsen sind.
Das regelmäßige Muster von mesenchymalen Cluster wird durch dreidimensionale Rekonstruktion der optischen Abschnitte eines ganzen PDGFRα GFP / + Darm bei E15.5 (2 zeigte </ Strong>, aus wieder Walton et al., 2012) 2. Dieses Bild besteht aus Z-Stapel von 54 Sichtfelder, die von der Leica LAS AF Software-zusammengenäht wurden. Jeder Punkt im Inneren des Darms ist eine mesenchymale Cluster durch Kern getaggt GFP aus der PDGFRα Locus 14 ausgedrückt visualisiert. Die hohe Auflösung des Bildes ermöglicht dem Betrachter, zoom-in, um bestimmte Bereiche, um Details zu prüfen, bietet aber in der Tiefe räumlichen Beziehungen, die nicht von einzelnen Sichtfelder oder niedriger Energievergrößerung aufgelesen werden können. Movie-1 ist eine Reihe Schritt durch die genäht z -stack Bilder, 3D sind in Abbildung 2 rekonstruiert. Die einzelnen optischen Abschnitte ermöglichen weitere Darstellung von Details wie einzelne Zellen innerhalb der Cluster.
Optische Schnitte Wholemount Immundarmgefäß mit PECAM-Antikörper (BD Pharmingen 557355, verdünnt 1: 1000) wurde mit der Zweiphotonenanregung und Recon fangenkonstruiert mit Imaris Software (Abbildung 3). Diese dreidimensionale Ansicht der Darmblutgefäße enthüllt eine komplizierte Netzwerk von Gefäßen, die nicht vollständig durch dünne Schnittpräparate geschätzt werden kann. Movie 2, eine rotierende dreidimensionale Projektion des rekonstruierten Bildes in Abbildung 3, ermöglicht weitere Aufwertung, wie die erhöht Information, die durch dreidimensionale Rekonstruktion des Verständnisses der Strukturmuster verbessern.
Vibratom Schnitte ermöglicht dreidimensionale Betrachtung des Darmes von einer Quer Vorteil. In 4 ist das Verhältnis der Entwicklungs Cluster 14 mit dem Epithel und Mesenchym Umgebung (mit PDGFRα GFP / + markiert) (mit Membran Tomate (Rosa26 mT / mg) 15 beobachtet wird markiert.
Alternativ kann dieses Verhältnis von Antikörper immunofluore betrachtenscence Färbung (Abbildung 5) der mesenchymalen Cluster (grün, mit Anti-PDGFRα (Santacruz C-20 markiert ist, verdünnt 1: 200)) mit dem Epithel (rot, mit Anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181 markiert ist; 1: 1.000 Verdünnung).
Diese ganze Organkultur-System kann auch erweitert werden, um für zwei-Photonen-Imaging von der Entwicklung fetalen Darm ermöglichen. In diesem Aufbau wird die fetale Darm auf eine Polycarbonat-Membran durch ein Maschensieb in einem größeren Kulturplatte (6) verklebt. Je größer und Größe der Kulturplatte ermöglicht die konfokale Mikroskopobjektive auf den Darm innen gut zu kontaktieren.
Abbildung 1. Entwicklung der gesamten fetalen Darm in einem Transwell-Kultursystem. (A) Fetal Darm auf einem Transwell-mem gesetztbran in einer 6-Well-Kulturplatte mit BGJb Medien. Top zwei Darm E12.5, unten zwei Darm E13.0. (B) Rinderserumalbumin getränkt Agarose-Kügelchen (helleres Blau) auf einem Zwölffingerdarm in der Transwell-Kultursystem platziert. Die dunkleren blauen Fleck ist X-gal-Färbung für PTC LacZ / + in den Hedgehog-Reporter Mauslinie Kennzeichnung mesenchymalen Cluster 16. (CF) Querschnitte von frisch geernteten E14.0 (C), E15.0 (D) und E16. 0 (E), Zwölffingerdarmgewebe mit E-Cadherin (grün) und DAPI (blau) gefärbt. Bei E14.0 wird das Epithel unremodeled noch pseudostratified, während bei E15.0 und E16.0, sichtbar werdende Zotten. (F) ein Darmsegment identisch mit der in (C) zu sehen ist, aber für zwei Tage kultiviert (E14 + 2 Tage) zeigt, dass die Zotten entwickeln in der Kultur, wenn auch etwas verzögert. Panels (CF) werden von Walton et al nachgedruckt., 2012 2 sup>. Scalebars sind 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Dreidimensionale Rekonstruktion von genähten Bereichen z-Stacks von einem E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + Darm. Das Bild ist eine teilweise Rekonstruktion (fünf Abschnitte 1 um von der Mitte der 65 z-Sektionen) ab 54 genäht Felder Blick erfasst mit Hilfe des Motortisch des LeicaSP5X konfokalen Mikroskop auf einem umgekehrten DMI 6000 Stand mit Zwei-Photonen-Laser-Anregung bei 900 nm auf. Leica LAS-AF Software genähte Z-Stapel zusammen, um das ganze Bild zu bilden. Maßstabsleiste 1 mm.
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Abbildung 3. Dreidimensionale Rekonstruktion des optischen Schnitte Wholemount anti-PECAM Immundarmgefäßsystem in einer E14 Duodenum. Optische Schnitte wurden mit einem konfokalen Mikroskop LeicaSP5X an einer aufrechten DMI 6000 erfasst stehen mit Zwei-Photonen-Anregung bei 900 nm und Drei form rekonstruiert mit Hilfe der Imaris 7.6.1 Software. Maßstabsleiste ist 200 um.
Abbildung 4. Die konfokale Bilder von Vibratom geschnitten E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG Jejunum, die die enge Verbindung der PDGFRα EGFP / + Zellen der mesenchymalen Cluster (grün) mit ihren darüberliegenden Epithel und Mesenchym Umgebung (rot; Membran Tomate von Rosa26 mTmG). < / Strong> sind Scalebars 50 um den oberen Platten und 25 um den unteren Platten.
Abbildung 5. Dreidimensionale Rekonstruktionen der konfokalen Bilder von E15.5 Vibratom geschnitten Därme, die Antikörper Immunfluoreszenz angefärbt waren. Maßstabsbalken 50 um.
Abbildung 6. Anpassung des Transwell-Kultursystem für 2-Photonen-Live-Bildgebung. (A)-Mesh-Sieb in eine Kulturschale gegeben. (B) Polycarbonatmembran ist mit dem Maschensieb eingeklebt. (C) Därme werden dem Polycarbonat-Membran geklebt und mit phenolfreiem DMEM-Medium kultiviert.
Film 2. Rotierende Film zeigt die dreidimensionale Rekonstruktion der optischen Abschnitte PECAM gefärbten Gefäß im Duodenum E14 in 2.
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Discussion
Die Dynamik und komplexe Gewebe-Wechselwirkungen der Entwicklungs Darm erfordert 3D-Visualisierung, um eine volle Anerkennung dieser morphogenetischen Ereignisse. Mit der Entwicklung der Imaging-Technologie, die Fähigkeit villus Morphogenese im Detail entwickelt / verbessert und mit ihr wird das Verständnis der räumlichen Kommunikation und Interaktion während der Organogenese stark verbessert zu prüfen.
Alternative Methoden zur Kultivierung ganze Darm wurden auch getestet worden, aber die Transwell-System bleibt die zuverlässigsten längere Kulturzeiten und für die Aufrechterhaltung der normalen Cluster und Musterung Zotten. Dreidimensionalen Kultursystemen (Matrigel oder Kollagen) eignen sich gut für kurze Zeiträume Kultur (weniger als 24 Stunden) von jüngeren Darm (E12.5 E15.5-), aber sobald der Darm unterziehen beginnen peristaltische Bewegungen und wie-sezernierenden Enzyme und Abfall in das Lumen, werden die dreidimensionalen Substraten nicht gut halten. Darm in Flüssigkulturs wird auch entwickeln, aber die mangelnde Unterstützung oder Referenz für Orientierung in einer frei schwebenden Kultur scheint normalen Muster der Cluster und Zotten ändern. Daher wird die Transwell-System bevorzugt, um die Cluster-Strukturierung und Zotten Entstehung und Auswuchs zu untersuchen.
Ein weiteres Verfahren für die Bildgebung Wholemount mit einer weniger strengen stellt, der Minutien Stifte zu verwenden, um die fötale Darm auf eine dünne Schicht von 7% Agarose auf dem Boden eines 35 x 10-mm-Platte zu befestigen. Diese Methode ist zwar einfacher einzurichten, beachten Sie, dass seine Verwendung ist beschränkt auf jüngere Stadien (E12.5 E15.5-) oder für kürzere Kultivierungszeiten, da die Matrigel wird nicht halten bis zu Darmsekrete.
Um die Kulturplatten vorzubereiten, gießen Sie genug geschmolzen 7% Agarose, nur den Boden einer 35 x 10-mm-Platte abdecken. Legen Sie eine Glaskapillare in der Mitte der Agarose, während es noch verformbar ist. Nach Erstarren der Agarose, entfernen Sie die Glaskapillare und legen ter fetalen Darm entlang der gut durch die Kapillare erstellt. Füllen Sie die Kapillare gut mit Matrigel, um den Darm umgibt, und legen Sie die Kulturschale bei 37 ° C, bis die Matrigel-Sets. Fügen Phenolrot-freiem DMEM Kulturmedien sorgfältig. Legen Sie die 35 x 10-mm-Platte in einem 60 x 15 mm-Platte und füllen Sie den 60-mm-Platte mit Wasser zu einer feuchten Kammer zu schaffen.
Auswahl des Montageverfahrens (Wholemount oder Vibratom) zur Echtzeit-Bildgebung wird auf Basis der gewünschten Ausrichtung der Fläche, die sichtbar gemacht werden. Zum Beispiel, um Veränderungen in epithelialen Zellform, Z-Stapel durch eine wholemounted Darm zu sehen, werden Ansichten der apikalen und basalen Oberflächen bereitzustellen. So zeigen interkinetic Kernwanderung der Epithelzellen in der Epithelschicht, Vibratom Abschnitte ermöglichen ein Ende auf (quer) Anzeigen der apikalen und basalen Flächen zu beobachten.
Vorbereitung der Proben ist wichtig, was die besten Abbildungsergebnisse. Bei der Verwendung von Vibratom Abschnitte And Standard konfokalen Mikroskopie, gute Auflösung bis zu Tiefen von 75 um ohne Clearing-Reagenz erreicht werden. Derzeit hat eine Clearing-Reagenz für Live-Proben nicht identifiziert worden, so dass die Tiefe der Bildgebung ist begrenzt. Für feste Proben, kann die Verwendung eines Clearing-Reagenz die Tiefe der Bildgebung erheblich verbessern. Die Lichtung Reagenz gefunden, um die besten Morphologie und bieten eine Auflösung von 17 Fokus Klar. Nach 30 min Lichtung im Fokus klar und Montage in Mount klar ist, kann die gesamte Tiefe aller Stadien der embryonalen Darm mit ausgezeichneter Auflösung abgebildet werden. Eine weniger teure Alternative Clearing 70% Glycerin, aber die maximale Eindringtiefe in embryonalen Geweben 150 m, danach wird die Auflösung und die Intensität des Signals verloren geht.
Eine wichtige Anmerkung ist, dass die Signale in den meisten Proben, gelagert sind und am gleichen Tag die Färbung beendet war abgebildet definiert. Montage mit Signal Erhaltung wässrigen Eindeckmedium (wie Prolong Gold Anti-Fade-Lösung (Life Technologies P36930) hilft mit der Erhaltung der Signal, aber nur kurz; die klarsten Bilder werden immer sofort nach Färbung und Montage der Proben erhalten.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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