Abstract
تم الاستدلال معظم عمليات التخلق في الأمعاء من الجنين أقسام رقيقة من الأنسجة الثابتة، وتوفير لقطات من التغيرات على مدى مراحل النمو. المعلومات ثلاثي الأبعاد من أقسام مسلسل رقيقة يمكن أن يكون تحديا لتفسير بسبب صعوبة إعادة بناء أقسام التسلسلية تماما والحفاظ على التوجه السليم للأنسجة على أقسام التسلسلية. النتائج الأخيرة من قبل غروس آخرون، 2011 تسليط الضوء على أهمية ثلاثية الأبعاد في فهم المعلومات التشكل من الزغب النامية في الأمعاء 1. أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الخلايا المعوية المسمى منفردة أن غالبية الخلايا الظهارية في الأمعاء اتصل كل من الأسطح قمية والقاعدية. وعلاوة على ذلك، أظهرت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من الهيكل الخلوي الأكتين على السطح القمي من ظهارة أن لمعة الأمعاء مستمرة وأن شمعة الثانوية وقطعة أثرية من لياليectioning. تلك نقطتين، جنبا إلى جنب مع تظاهرة الهجرة النووية interkinetic في الظهارة المعوية، ويعرف ظهارة الأمعاء النامية بصفة ظهارة مطبقة كاذبة وليس طبقية كما كان يعتقد سابقا 1. كانت القدرة على مراقبة ظهارة ثلاثة الأبعاد-المنوية لإثبات هذه النقطة، وإعادة التشكل الظهارية في الأمعاء الجنين. مع تطور تكنولوجيا التصوير متعدد الفوتون وبرامج إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد، والقدرة على تصور سليم، وتطوير أجهزة يتحسن بسرعة. ثنائي الفوتون الإثارة تتيح اختراق أقل ضررا أعمق في الأنسجة مع ارتفاع القرار. التصوير ثنائي الفوتون وإعادة الإعمار 3D من الأمعاء بأكملها الماوس الجنين في التون وآخرون، 2012 ساعد على تحديد نمط زغابة ثمرة 2. نحن هنا وصف نظام الثقافة الجهاز كله الذي يسمح فيفو السابقين تطوير الزغب وملحقات هذا النظام للسماح للثقافةالأمعاء لتكون ثلاثة الأبعاد تصويرها خلال تنميتها.
Protocol
ملاحظة: تم التعامل مع جميع الفئران إنسانية باستخدام بروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ميشيغان كلية الطب حدة لمختبر الطب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الجامعة على استخدام ورعاية الحيوانات.
1. كامل نظام الجهاز ثقافة
- إعداد وسائل الإعلام والثقافة لوحات
- في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، وإزالة 5 مل من BGJb سائل الإعلام من الزجاجة الأسهم وإضافة 5 مل من القلم / بكتيريا. إعداد الأوراق المالية تعمل وسائل الإعلام في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك بإضافة 1 مل من 5 ملغ / مل حمض الاسكوربيك إلى 49 مل من BGJb سائل الإعلام (مع القلم / بكتيريا).
- إعداد لوحة الثقافة 6 جيدا وذلك بإضافة 1 مل تحت كل من transwells.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدام جميع transwells 6، نقل transwells اضافية الى معقمة وحة 6 جيدا العذبة لاستخدامها لاحقا. إضافة 3 مل من العمل BGJb سائل الإعلام إلى كل من ثلاثة أطباق بتري 10 سم معقمة.
- التحضير للتشريح
- نقع أدوات تشريح في 70٪ ethaنول وتأكد للحفاظ على الأدوات نظيفة أثناء العمل.
- إعداد منطقة تشريح مع دلو الجليد كبيرة ووضع لوحة الثقافة 6 جيدا و10 سم أطباق بتري مع BGJb سائل الإعلام على الجليد. العمل على الجليد قدر الإمكان بينما تشريح وإعداد الأمعاء للثقافة.
- تخدير الفئران الإناث البالغين في الغرفة مع isofluorane (100 ميكرولتر) قبل euthanization خلع عنق الرحم لحصاد أمعاء الجنين.
- بعد حصاد الأجنة من الأم، كل مرحلة الجنين بعناية وفقا لتنظيم تايلر الرسم البياني 13. لا تعتمد على أيام ما بعد الجماع لتحديد عمر الجنين كما كل الاختلافات تصل إلى 24 ساعة في مرحلة التطوير لوحظ بشكل روتيني داخل القمامة واحدة.
- تشريح للأمعاء الجنين
- الموت ببطء الأجنة بواسطة قطع الرأس قبل إزالة الأمعاء.
- كل تشريح الأمعاء في 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) ثم جيش التحرير الشعبى الصينىم قبل أن تتحول إلى 10 سم لوحة بتري مع العمل BGJb سائل الإعلام.
- إزالة بعناية من الطحال والمعدة والبنكرياس من المعدة والاثني عشر العلوي.
- فصل بلطف الثرب مع الحرص على ترك الثرب المرفقة قدر الإمكان وفصل الاتصالات فقط بما يكفي للسماح الأمعاء ليتم تقويمها.
ملاحظة: للحصول على الأمعاء أقدم من E14.5 أو تلك التي يجري زرعها أطول من 24 ساعة، فصل بلطف الأمعاء إلى 3 شرائح متساوية للسماح لتدفق محتويات اللمعية من خلال الأمعاء ويطرد من خفض الغايات. ومع ذلك، للثقافات التي قبل E13.5، والانتظار حتى بعد 24 ساعة من زراعة قبل فصل 3 شرائح من الأمعاء للسماح للالمصلية أن ينمو بشكل صحيح على طول الأمعاء. - استخدام الماصة الفم لنقل القطع المعوية على transwells لوحة الثقافة (1.1.2).
- إعادة بلطف الأمعاء حسب الحاجة بحيث تكون مباشرة عبر transwelلتر.
ملاحظة: عندما تبدأ الأمعاء تتحرك محتويات اللمعية من خلال أنبوب، فإن أي مكامن الخلل في الأمعاء يسبب نسخة احتياطية وتلف الأمعاء.
- ثقافة والعلاج
- إزالة وسائل الإعلام من تحت transwell، إضافة 700 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج (وسائل الإعلام العمل مع البروتينات المؤتلف المضافة أو مثبطات الدوائية) تحت transwell.
- إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام العلاج قطرة من الحكمة في أعلى الأمعاء والسماح لها نقع من خلال transwell. إعادة الأمعاء عند الضرورة.
- تغيير العلاج وسائل الإعلام على الأقل مرة واحدة يوميا أو أكثر في كثير من الأحيان تبعا لعمر النصف للكاشف العلاج.
- إعداد البروتين غارقة الخرز الاغاروز عن مصدر المترجمة من كاشف العلاج
- resuspend والخرز الاغاروز في حاوية تخزين ونقل 100 ميكرولتر من الخرز agarose في أنبوب 1.5 مل microfuge.
- ملء حجم ما تبقى من الأنبوب عقيمة مع 1X دكتوراهosphate مخزنة المالحة (PBS) وتخلط حبات لغسلها. وضع microfuge أنبوب في رفوف لبضع دقائق للسماح للالخرز لتستقر في القاع ثم الماصة قبالة PBS من على أعلى من الخرز. إعادة ملء microfuge أنبوب معقم مع 1X PBS وتكرار عملية الغسيل مرتين أكثر.
- إعداد البروتين من الفائدة مرتين في التركيز المطلوب لتلقي العلاج.
- مزيج 5 ميكرولتر من الخرز agarose غسلها مع 5 ميكرولتر من الأسهم البروتين 2X وتستنهض الهمم بلطف حبات في البروتين. وضع أنبوب على الجليد لمدة 1 ساعة، والخلط بلطف كل 10-15 دقيقة.
- شطف حبات لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني 1X معقم قبل وضع الخرز على الأمعاء.
- وضع حبات الاغاروز
- ضع بلطف حبات الاغاروز على رأس الأمعاء باستخدام الماصة الفم مع الإبر سحبت الشعرية. وضع الخرز مع الحذر الشديد والتعامل معها بخشونة وتلف الأمعاء ومنع تطوير زغابة في المنطقة المصابة.
- وضع ضعف عدد حبات كانت هناك حاجة لتحليل منذ الأمعاء سيخضع الحركات وتحوي حوالي نصف من الخرز توضع سوف لفة الخروج من الأمعاء خلال وقت زراعة.
- تثبيت الأمعاء مثقف
- إزالة بعناية وسائل العلاج من تحت transwell والسماح للأمعاء إلى الهواء الجاف لمدة 3 دقائق.
- إضافة 1 مل من تثبيتي تحت transwell لمدة 2 دقيقة، ثم تغطية الجزء العلوي من الأمعاء مع 2 مل من تثبيتي للفترة المتبقية من الوقت التثبيت. مع تحديد بارافورمالدهيد 4٪ O / N عند 4 درجات مئوية أو لمدة 2 ساعة على RT.
2. التصوير من الأمعاء الثابتة
- التصوير Wholemount
- وضع الامعاء كلها (مع مضان الذاتية) على شريحة مع 100 ميكرولتر من 1X DPBS. استخدام ملقط لترتيب بلطف الأمعاء.
- استخدام مختبر الأنسجة لإزالة بعناية DPBS وإضافة على الفور 100 ميكرولتر من 70٪ الجلسرين لجعل مو الأنسجةإعادة شفافية وزيادة عمق ممكن من التصوير.
ملاحظة: إذا كان المطلوب مزيدا من تغلغل الأمعاء، بدلا من تركيب الأمعاء في 70٪ الجلسرين، ونقع في الأمعاء بضع قطرات من محلول تركيز واضح لمدة 10-30 دقيقة. الماصة قبالة الحل تركيز واضح وجبل مع جبل الأمعاء واضح. - تغمس كل من الزوايا الأربع من ساترة إلى الصلصال والتقاط كمية صغيرة من الطين لاستخدام الفواصل بين الشرائح وساترة للحفاظ على ساترة من تسطيح الأمعاء.
- ختم ساترة على الشريحة مع VALAP ذاب تطبيقها مع مسحة القطن.
- صورة الأمعاء على أي مجهر متحد البؤر تستقيم أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل.
- Vibratome باجتزاء من الأمعاء الثابتة (عن وجهة مستعرضة هياكل المعوية)
- في الأمعاء تضمين 7٪ الاغاروز في قوالب بلاستيكية صغيرة (10 × 10 × 15 مم) وتسمح للكتل الاغاروز ليبرد ويصلب.
- إزالة كتل الاغاروز من القوالب البلاستيكية والغراء كتل الاغاروز إلى مرحلة جمع vibratome مع الغراء الفورية.
- ملء مرحلة جمع مع الجليد الباردة 1X DPBS.
- قطع الفروع في سمك بين 100-150 ميكرون. لأقسام سمكا تستخدم حلول المقاصة (الموصوفة في القسم 2.1.2) لتصور أعمق في المقطع العرضي.
- صب vibratome المقاطع من مرحلة جمع في بئر من لوحة 6 جيدا للتخزين عند 4 درجات مئوية.
- المناعي تلطيخ والأنسجة vibratome مقطوع ثابت
- وضع 5-12 أقسام vibratome لكل بئر في لوحة 24 جيدا مع 1X DPBS.
- إزالة 1X DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من حل permeabilization لكل بئر. بلطف الصخور العينات لمدة 25 دقيقة في RT.
- بعد permeabilization، وغسل العينات 3 مرات مع 1X PBS.
- منع عينات لمدة 30 دقيقة على الأقل في 500 ميكرولتر من عرقلة الحل.
- بعد حجب، والبريدالتبادل عرقلة الحل مع 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل والحفاظ على العينات عند 4 درجات CO / N.
ملاحظة: التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي تعمل بشكل جيد على أقسام المجمدة والبارافين يعمل بشكل جيد عموما على vibratome أقسام أيضا، ولكن الأجسام المضادة التي تتطلب استرجاع مستضد النووي عموما لا تعمل بشكل جيد مع هذا البروتوكول (مثل BrdU). - في اليوم التالي، وغسل العينات 3 مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة مع عرقلة الحل.
- بعد الغسيل، وتطبيق 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في عرقلة الحل. التفاف 24 لوحة جيدا في رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من ضوء والصخور العينات لمدة 45 دقيقة إلى 2 ساعة على RT.
- غسل العينات 3 مرات مع 1X PBS لمدة 15 دقيقة لكل وجبل الأقسام vibratome على الشرائح كما هو موضح في القسم 2.4.
- تصاعد vibratome أقسام
- إعداد الشرائح لvibratome تصاعد طريق قطع شرائح رقيقة المزدوج الأمراض المنقولة جنسياالشريط المسيخ ووضعها على طول الجانبين طويلة من الشرائح.
- وضع بعناية 5-10 أقسام vibratome بين الشريط المزدوج عصا على الشرائح في قطرة من 100 ميكرولتر من 1X PBS.
- تتكشف جميع أقسام ونشرها للخروج الى طبقة واحدة عبر الشريحة.
- إزالة أي الاغاروز الزائد أو بت متفاوتة يحول دون ساترة من الجلوس شقة.
- استخدام بعناية مختبر الأنسجة لامتصاص الزائد 1X PBS من مختلف الأقسام vibratome.
- إضافة قطرة من مائي المتوسطة المتزايدة على رأس من المقاطع vibratome ثم ساترة.
- ختم لل coverslips على الشرائح مع ذاب تطبيق VALAP مع مسحة القطن.
- صورة المقاطع vibratome على أي مجهر متحد البؤر رأسي أو مقلوب. يرجى الرجوع إلى المناقشات لمزيد من التفاصيل حول اختيار نظام التصوير.
3. تصوير لايف من الأمعاء كامل
الأمعاء تحصد من fetuseق بعد E12.5، مع الثرب متصل يقم سليمة، ووضع بنجاح الزغب في الثقافة باستخدام النظام المذكور أعلاه. وبالتالي، يسمح هذا النظام خارج الحي القبض على الصور الحية ض جزء من الأمعاء النامية التي يمكن بناؤها للحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من التشكل مع مرور الوقت.
- وضع التصوير الحي
- استخدام الغراء الفورية الالتزام غشاء البولي الفردي إلى شاشة شبكة غرامة. وهذا يوفر سقالة الدعم لعقد الأمعاء في مكان تحت عدسة غمس المجهر مبائر تستقيم. يرجى الرجوع إلى قسم النقاش لمزيد من التفاصيل بشأن اختيار المجاهر التصوير الحية.
- وضع شاشة شبكة في وسط بئر من لوحة الثقافة.
- وضع تشريح الأمعاء على الغشاء البولي وإضافة قطرة من الغراء الفورية على حد سواء. استخدام الغراء فقط ما يكفي لتركيب الأمعاء، ولكن لا معطف ذلك!
- إضافة ثقافة الإعلام خالية من الفينول الأحمر تحت البوليالغشاء في وسط بئر من لوحة الثقافة.
- إضافة الماء إلى الحافة الخارجية للوحة الثقافة لتوفير الرطوبة.
- منذ الأمعاء الجنين يخضع موجات تشبه تحوي من انكماش في الثقافة، إضافة 100 ميكرولتر من 1: 5 من حل زيلازين في برنامج تلفزيوني 1X إلى 3 مل من وسائل الإعلام للسيطرة على حركة الأمعاء أثناء التصوير. وهذه الجرعة سيطرة الحركات المعوية لمدة 8-10 ساعة دون المساس تطوير زغابة.
- للحصول على عرض عرضية من الأمعاء، تضمين الأمعاء الحية في حل الاغاروز 3-4٪ وخفض أبواب سميكة (150-500 ميكرون) على vibratome. تتناسب مع صلابة من الاغاروز مع صلابة من الأمعاء يجري قص وتحدد تجريبيا المرحلة التنموية. عموما، حل الاغاروز 3٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء الذين تقل أعمارهم عن E14.5 وحل 4٪ يعمل بشكل جيد للأمعاء E15-E16.
- الغراء الأقسام vibratome إلى غشاء البولي اضافته على شاشة شبكة (كما في القسم 3.1.1) والثقافة كما وصفها في القسم 3.1.2-3.1.6.
- إجراء التصوير الحي باستخدام ثنائي الفوتون مضان المجهر متحد البؤر (ليزر الإثارة بين 690-1،040 نانومتر) على الوقوف بشكل مستقيم مع جدول الانضباطي.
- ثنائي الفوتون الليزر ضبطها إلى 900 نانومتر يوفر الاختراق العميق مع أفضل قرار لإشارات GFP. أنه يقلل من الأضرار التي لحقت الأنسجة أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك، وضع قوة الليزر إلى أدنى الانبعاثات الممكن يقلل من تلف الأنسجة. عادة للحصول على الإثارة جيدة من GFP، واستخدام السلطة 12٪ على الليزر ثنائي الفوتون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في ثقافة Explants كاملة من أمعاء الجنين يسمح للتحليل الموقع، والتوزيع، ومدة الجزيئات مما يشير إلى أن تنسيق التنمية المعوية، حيث أن هذا النظام يمكن التلاعب في الإشارات مع الكواشف الدوائية أو البروتينات المؤتلف. نظام الثقافة transwell (الشكل 1A، مستنسخة من التون وآخرون، 2012) 2 يوفر واجهة الهواء السائل، مما يجعل من الممكن لوضع بالمخدرات أو البروتين غارقة الخرز الاغاروز على الأنسجة وبالتالي إنشاء مصادر الإشارات المحلية (الشكل 1B ). الأمعاء تحصد من الأجنة في E18.5 E10 إلى البقاء على قيد الحياة في الثقافة على transwells وتخضع موجات تشبه تحوي من الحركة. بدأت الأمعاء في الثقافة E13.5 من البقاء على قيد الحياة حوالي 10 أيام أو تقريبا P3، مرحلة التنمية الماوس عندما لوحظ لأول مرة تشكيل سرداب. على الرغم من الأمعاء مرحلة مبكرة البقاء على قيد الحياة في الثقافة والأمعاء المقطوع قبلE12.5 لا تظهر الزغب بشكل موثوق، من المحتمل لأن المصلية لم نمت لتغطية تماما الأمعاء بحلول ذلك الوقت. مجموعات الوسيطة تشكل الزغب وتبدأ في الظهور وإطالة في الأمعاء بدأت في الثقافة في E12.5، E13.5 أو E14.5، على الرغم من تطوير تأخر قليلا بالمقارنة مع غير مثقف، وضوابط مطابقة المرحلة (الشكل 1، مستنسخة من التون وآخرون آل.، 2012) 2. بغض النظر عن مرحلة من الأمعاء في بداية ثقافة (E12.5-E14.5)، الأمعاء تظهر دائما يكون هناك تأخير تقريبي من 24 ساعة. الأمعاء E14 نمت في الثقافة لمدة يومين تظهر نمو الزوائد التي هي أكثر مماثلة لتلك التي من الأمعاء E15 من الزوائد في الأمعاء E16 تزرع في الرحم (الشكل 1C-F) 2.
وكشف نمط منتظم من قبل مجموعات الوسيطة إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من المقاطع البصرية من كل PDGFRα GFP / + الأمعاء في E15.5 (الشكل 2 </ قوي>، مستنسخة من التون وآخرون، 2012) 2. وتتكون هذه الصورة من مداخن Z-54 مجالات الرأي التي تم مخيط معا عن طريق برنامج لايكا LAS-AF. كل بقعة داخل الأمعاء هي مجموعة الوسيطة التي تصور GFP الموسومة النووي وأعرب عن موضع PDGFRα 14. على دقة عالية من الصورة يسمح للمشاهد أن تكبير في مناطق معينة لدراسة التفاصيل، ولكن يوفر في العلاقات المكانية العمق التي لا يمكن استخلاصها من الحقول واحدة للعرض أو أقل التكبير السلطة. فيلم 1 هو عبارة عن سلسلة التنقل خلال ض مخيط الصور -stack التي هي 3D إعادة بنائها في الشكل 2. والمقاطع البصرية الفردية تسمح لمزيد من التفاصيل التصور مثل الخلايا واحد ضمن مجموعات.
تم القبض على استخدام الإثارة ثنائي الفوتون وريكون:، من المقاطع البصرية المناعي wholemount من الأوعية الدموية في الأمعاء مع PECAM الأجسام المضادة (1،000 المخفف 1 BD Pharmingen 557355)structed مع برنامج Imaris (الشكل 3). هذا الرأي ثلاثي الأبعاد في الأوعية الدموية المعوية يكشف عن شبكة معقدة من الأوعية الدموية التي لا يمكن تقديرها بشكل كامل الاستعدادات القسم رقيقة. فيلم 2، والإسقاط ثلاثي الأبعاد الدورية للصورة التي أعيد بناؤها في الشكل 3، ويسمح لمزيد من التقدير لكيفية زيادة المعلومات التي قدمت إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد يمكن أن يحسن فهم الزخرفة الهيكلية.
Vibratome باجتزاء يسمح للعرض ثلاثي الأبعاد من الأمعاء من نظر عرضية. في الشكل 4، والعلاقة بين الكتل تطوير (ملحوظ مع PDGFRα GFP / +) 14 مع ظهارة والمحيطة اللحمة المتوسطة (ملحوظ مع غشاء الطماطم (Rosa26 طن / ملغ) 15 لوحظ.
بدلا من ذلك، يمكن أن ينظر إليه هذه العلاقة من قبل الأجسام المضادة immunofluoreتلطيخ مسرح الحادث (الشكل 5) من مجموعات الوسيطة (الأخضر والمسمى مع المضادة للPDGFRα (سانتا كروز C-20؛ المخفف 1: 200)) مع ظهارة (الأحمر والمسمى مع المضادة للEcadherin (BD تنبيغ مختبرات 610181، 1: 1،000 تمييع).
ويمكن أيضا أن هذا النظام الثقافة الجهاز كله أن تمتد للسماح للتصوير ثنائي الفوتون تطوير أمعاء الجنين. في هذا الإعداد، يتم لصقها الأمعاء الجنين لغشاء البولي تدعمها شاشة شبكة في لوحة الثقافة أكبر (الشكل 6). حجم أكبر من جانب لوحة الثقافة يسمح للعدسات المجهر مبائر للاتصال داخل الأمعاء بشكل جيد.
الشكل 1. تطوير أمعاء الجنين كلها في نظام الثقافة transwell. (A) أمعاء الجنين وضعها على ذاكرة transwellالغشاء في لوحة الثقافة 6 BGJb بشكل جيد مع وسائل الإعلام. اثنين من كبار الأمعاء هي E12.5، أسفل اثنين الأمعاء هي E13.0 (B) مصل الزلال البقري المنقوع الخرز الاغاروز (أخف الازرق) وضعت على الاثني عشر في نظام الثقافة transwell. وصمة عار الزرقاء الداكنة هي تلطيخ X-غال عن المؤسسة العامة للاتصالات LacZ / + في المجموعات الوسيطة القنفذ خط مراسل الماوس بمناسبة 16. (CF) عبر أقسام E14.0 المقطوع حديثا (C)، E15.0 (D) وE16. 0 (E)، والأنسجة الاثني عشر ملطخة E-كادهيرين (الخضراء) ودابي (الأزرق). في E14.0، لا يزال pseudostratified ظهارة unremodeled، بينما في E15.0 و E16.0، الزغب الوليدة مرئية. (F) جزء الأمعاء متطابقة لتلك التي شوهدت في (C)، ولكن مثقف لمدة يومين (E14 + 2DAYS) يدل على أن الزغب تطور في الثقافة، وإن تأخر قليلا. وطبع وحات (CF) من التون وآخرون، 2012 2 سوب>. Scalebars هي 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. ثلاثي الأبعاد إعادة بناء حقول مخيط من ض أكوام من wholemount E15.5 PDGFRα EGFP / + الأمعاء. الصورة هي إعادة الإعمار الجزئي (خمسة أقسام 1 ميكرون من وسط 65 ض أقسام) من 54 حقول مخيط نظر استولت باستخدام مرحلة الآلية المجهر متحد البؤر LeicaSP5X على المقلوب DMI 6000 موقف مع اثنين من الفوتون الإثارة الليزر على 900 نانومتر. برنامج لايكا LAS-AF مخيط Z-مداخن معا لتشكيل صورة كاملة. Scalebar هو 1 مم.
ن "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
تم القبض على الشكل 3. ثلاثي الأبعاد إعادة بناء المقاطع البصرية تظهر wholemount المناعي لمكافحة PECAM من الأوعية الدموية في الأمعاء في الاثني عشر E14. أقسام بصري على المجهر متحد البؤر LeicaSP5X على تستقيم 6000 مؤسسة دبي للإعلام الوقوف مع اثنين من الفوتون الإثارة في 900 نانومتر، وثلاثة أعيد بناؤها الأبعاد باستخدام برنامج Imaris 7.6.1. Scalebar هو 200 ميكرون.
الرقم 4. الصور متحد البؤر من vibratome مقطوع E15.5 PDGFRα EGFP / +. Rosa26 mTmG الصائم تبين ارتباط وثيق من PDGFRα EGFP / + خلايا مجموعات الوسيطة (الأخضر) مع ظهارة الفوقية والمحيطة اللحمة المتوسطة (أحمر، غشاء الطماطم من Rosa26 mTmG). < / قوي> Scalebars هي 50 ميكرون في لوحات العليا و 25 ميكرون في لوحات أقل.
الشكل 5. إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور مبائر من E15.5 vibratome مقطوع الأمعاء المناعي الأجسام المضادة التي كانت ملطخة. Scalebar هو 50 ميكرون.
الرقم 6. التكيف للنظام الثقافة transwell ل2 الفوتون التصوير الحي. (A) مش يتم وضع الشاشة في صحن الثقافة. يتم لصقها (B) غشاء البولي إلى شاشة شبكة. يتم لصقها (C) إلى الأمعاء الغشاء البولي ومثقف مع خالية من الفينول وسائل الاعلام DMEM.
فيلم 2. الدوارة فيلم يبين إعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من المقاطع البصرية من PECAM الأوعية الدموية الملون في الاثني عشر E14 في الشكل 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطبيعة الديناميكية والتفاعلات المعقدة للأنسجة الأمعاء وضع التصور 3D تتطلب أن يكون التقدير الكامل لهذه الأحداث التخلق. مع تطور تكنولوجيا التصوير، والقدرة على فحص زغابة التشكل بالتفصيل على تطوير / تحسين ومعها، وتعزيز فهم التواصل والتفاعل المكاني خلال توالد بشكل كبير.
كما تم اختبار طرق بديلة لزراعة الأمعاء بأكملها، ولكن يبقى نظام transwell الأكثر موثوقية لمرات أطول الثقافة والحفاظ على طبيعية العنقودية وزغابة الزخرفة. نظم الاستزراع ثلاثي الأبعاد (matrigel أو الكولاجين) تعمل بشكل جيد لفترات قصيرة الثقافة (أقل من 24 ساعة) من الأمعاء الأصغر سنا (E12.5-E15.5)، ولكن عندما تبدأ الأمعاء يخضعون للحركات مثل تحوي وإفراز الأنزيمات والنفايات في التجويف، ركائز ثلاثية الأبعاد لا تصمد جيدا. الأمعاء في الثقافة السائلةق ستطور أيضا، ومع ذلك، فإن عدم وجود دعم أو مرجعية للتوجيه في ثقافة التعويم الحر يبدو لتغيير النمط الطبيعي للتجمعات والزغب. لذا، يفضل النظام transwell لدراسة الزخرفة العنقودية وزغابة ظهور وثمرة.
طريقة أخرى لتصوير حي wholemount مع مجموعة أقل صرامة يصل هو استخدام دبابيس minutien لتركيب الأمعاء الجنين إلى طبقة رقيقة من 7٪ الاغاروز على الجزء السفلي من 35 × 10 مم لوحة. في حين أن هذا الأسلوب هو الأسهل لانشاء، لاحظ أن استخدامه يقتصر على المراحل الشابة (E12.5-E15.5) أو لفترات أقصر زراعة منذ ان matrigel لا تصمد لإفرازات الأمعاء.
لإعداد لوحات والثقافة، ويكفي صب ذاب 7٪ الاغاروز فقط لتغطية الجزء السفلي من 35 × 10 مم لوحة. وضع أنبوب زجاجي الشعرية في وسط الاغاروز حين انها لا تزال طيعة. مرة واحدة وقد عززت agarose، إزالة الزجاج الشعرية ووضع رانه الجنين الأمعاء على طول إنشاؤها بشكل جيد من قبل شعري. ملء الشعرية بشكل جيد مع matrigel لتطويق الأمعاء ووضع الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية حتى تغرب matrigel. إضافة الفينول الحمراء الخالية DMEM وسائل الإعلام ثقافة بعناية. وضع لوحة 35 ملم × 10 داخل 60 × 15 مم لوحة وملء 60 ملم لوحة مع الماء لإنشاء غرفة رطبة.
ويستند اختيار طريقة التركيب (wholemount أو vibratome) للتصوير الحي على التوجه المطلوب من المنطقة المراد تصور. على سبيل المثال، لعرض التغييرات في شكل الخلايا الظهارية، ض أكوام من خلال الأمعاء wholemounted سيوفر آراء السطوح القمية والقاعدية. لعرض interkinetic الهجرة النووية للخلايا الظهارية في ورقة الظهارية، تسمح vibratome أقسام حدا على (عرضية) بغية مراقبة الأسطح القمية والقاعدية.
إعداد العينات أمر بالغ الأهمية لتسفر عن أفضل نتائج التصوير. عند استخدام vibratome المقاطعالثانية القياسية متحد البؤر المجهر، ويمكن تحقيق قرار جيد حتى عمق 75 ميكرون دون كاشف المقاصة. حاليا، لم يتم تحديد كاشف المقاصة لعينات حية حتى عمق التصوير محدودة. لعينات ثابتة، يمكن استخدام كاشف المقاصة تحسن كثيرا من عمق التصوير. كان كاشف المقاصة وجدت لتقديم أفضل قرار التشكل وتركيز واضح 17. بعد 30 دقيقة من المقاصة في التركيز واضحة ومتزايدة في جبل اضح، وعمق كامل من جميع مراحل الجنينية الأمعاء ولا يمكن تصوير مع قرار ممتاز. ثمة بديل أقل تكلفة المقاصة هو 70٪ الجلسرين، ولكن عمق القصوى من التغلغل في الأنسجة الجنينية هو 150 m، بعد ذلك القرار وشدة إشارة تضيع.
واحد ملاحظة هامة هي أن الإشارات هي الأكثر معرفة في العينات التي يتم تحميلها وتصويرها في نفس اليوم تم الانتهاء من تلطيخ. تصاعد مع إشارة الحفاظ مائي تصاعد المتوسطة (مثل الذهب إطالة مكافحة تتلاشى الحل (لايف تكنولوجيز P36930) لا تساعد في الحفاظ على إشارة، ولكن فقط لفترة قصيرة. ويتم الحصول على أوضح الصور دائما مباشرة بعد تلطيخ وتركيب العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
