Abstract
La maggior parte dei processi morfogenetici nell'intestino fetale sono stati dedotto dalle sezioni sottili di tessuti fissati, fornendo istantanee di cambiamenti nel corso stadi di sviluppo. Informazioni tridimensionale da sezioni seriali sottili può essere difficile da interpretare a causa della difficoltà di ricostruire sezioni seriali perfettamente e mantenere il corretto orientamento del tessuto su sezioni seriali. Recenti scoperte di Grosse et al. 2011 sottolineano l'importanza di tre informazioni dimensionali nella comprensione morfogenesi dei villi sviluppo dell'intestino 1. Ricostruzione tridimensionale delle cellule intestinali singolarmente etichettati dimostrato che la maggior parte delle cellule epiteliali intestinali contattare sia le superfici apicali e basali. Inoltre, ricostruzione tridimensionale del citoscheletro actina alla superficie apicale dell'epitelio dimostrato che lume intestinale è continua e che lumen secondarie sono un artefatto di sectioning. Questi due punti, insieme con la dimostrazione della migrazione nucleare interkinetic nell'epitelio intestinale, definita l'epitelio intestinale in via di sviluppo come un epitelio pseudostratificato e non stratificati come si pensava 1. La capacità di osservare l'epitelio tridimensionale è stato seminale per dimostrare questo punto e ridefinendo morfogenesi epiteliale nell'intestino del feto. Con l'evoluzione della tecnologia di imaging multi-fotone e software di ricostruzione tridimensionale, la capacità di visualizzare intatto, lo sviluppo di organi sta rapidamente migliorando. Eccitazione a due fotoni permette la penetrazione meno dannoso più in profondità i tessuti con alta risoluzione. Due fotoni di imaging e la ricostruzione in 3D di tutto il fetali intestini del mouse in Walton et al., 2012 hanno contribuito a definire il modello di villi escrescenza 2. Qui si descrive un intero sistema di coltura d'organo che permette ex vivo sviluppo dei villi e le estensioni di quel sistema di coltura per consentirel'intestino ad essere tridimensionalmente ripreso durante il loro sviluppo.
Protocol
NOTA: Tutti i topi sono stati trattati umanamente utilizzando protocolli approvati dalla University of Michigan Medical School Unità per la Medicina di Laboratorio animali e secondo le linee guida della Commissione di Ateneo per l'uso e la cura degli animali.
1. intero sistema Cultura Organo
- Preparazione dei supporti e piastre di coltura
- In una cappa di coltura tissutale, rimuovere 5 ml di BGJb supporto dalla bottiglia stock e aggiungere 5 ml di Pen / Strep. Preparare uno stock di lavoro di media in un tubo conico da 50 ml, con l'aggiunta di 1 ml di 5 mg / ml di acido ascorbico a 49 ml di BGJb media (con Pen / Strep).
- Preparare una piastra di coltura ben 6 con l'aggiunta di 1 ml di sotto ciascuna delle transwells.
NOTA: Se non si utilizzano tutti i 6 transwells, spostare transwells in più in una sterile piatto 6 e fresco per un uso successivo. Aggiungere 3 ml di lavorare BGJb media per ciascuna delle tre piastre di Petri sterili 10 centimetri.
- Preparazione per la dissezione
- Immergere gli strumenti di dissezione nel 70% etanolo perNol ed essere sicuri di mantenere gli strumenti puliti durante il lavoro.
- Impostare l'area dissezione con un grande secchio di ghiaccio e posizionare la piastra di coltura ben 6 e 10 centimetri di Petri con BGJb multimediale su ghiaccio. Lavorare sul ghiaccio il più possibile mentre dissezione e preparare l'intestino per la cultura.
- Anestetizzare adulto topi femmina in una camera con isofluorane (100 ml) prima euthanization da dislocazione cervicale per la raccolta di intestino fetale.
- Dopo la raccolta i feti dalla madre, in scena ogni feto con attenzione secondo la Theiler messa in scena tabella 13. Non fare affidamento nei giorni post-coito per determinare l'età di ogni feto come variazioni fino a 24 ore in fase di sviluppo sono abitualmente osservati all'interno di una singola cucciolata.
- Dissezione di intestini fetali
- Euthanize feti di decapitazione prima della rimozione di intestino.
- Sezionare ogni intestino di 1x Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) e poi place in una piastra di Petri 10 centimetri con il lavoro BGJb media.
- Rimuovere con cautela la milza dallo stomaco e il pancreas dallo stomaco e duodeno superiore.
- Separare delicatamente il omento avendo cura di lasciare il omento divisoria per quanto possibile e separare connessioni solo sufficiente a permettere l'intestino da raddrizzare.
NOTA: Per intestini di età superiore a E14.5 o quelli in coltura più di 24 ore, separare delicatamente l'intestino in 3 segmenti uguali per consentire contenuto luminale di fluire attraverso l'intestino ed essere espulsi dalle estremità tagliate. Tuttavia, per le culture iniziato prima E13.5, attendere fino a dopo 24 ore di coltura prima di separare i tre segmenti di intestino per permettere la sierosa di crescere correttamente sulla lunghezza dell'intestino. - Utilizzare una pipetta bocca per trasferire i pezzi intestinali sui transwells della piastra di coltura (1.1.2).
- Riposizionare delicatamente l'intestino, se necessario in modo che siano dritti alla transwell.
NOTA: Una volta che gli intestini cominciano muoversi contenuto luminale attraverso il tubo, eventuali pieghe a livello intestinale causerà un backup e danni per l'intestino.
- Cultura e trattamento
- Rimuovere il supporto da sotto il transwell, aggiungere 700 ml di mezzi di trattamento (dei media che lavorano con l'aggiunta di proteine ricombinanti o inibitori farmacologici) sotto il transwell.
- Aggiungere 300 ml di supporti trattamento goccia a goccia sulla parte superiore dell'intestino e lasciare in ammollo attraverso il transwell. Riposizionare l'intestino, se necessario.
- Cambiare mezzi trattamento almeno una volta al giorno o più spesso a seconda del tempo di dimezzamento del reagente trattamento.
- Preparazione di proteine imbevuto agarosio perline per una fonte localizzata di reagente trattamento
- Risospendere le perline agarosio nel loro contenitore e trasferire 100 ml di perline agarosio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Riempire il volume rimanente del tubo con sterile 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS) e mescolare le perle di lavarli. Collocare la provetta da microcentrifuga in un rack per alcuni minuti per consentire le perle di depositarsi sul fondo e poi pipettare fuori dalla PBS in cima alle perline. Riempire la provetta per microcentrifuga con 1x PBS sterile e ripetere il processo di lavaggio altre due volte.
- Preparare la proteina di interesse a due volte la concentrazione desiderata per il trattamento.
- Mescolare 5 ml di perline agarosio lavato con 5 ml di proteina magazzino 2x e agitare delicatamente le perline nella proteina. Porre la provetta in ghiaccio per 1 ora, mescolando delicatamente ogni 10-15 min.
- Sciacquare le perline brevemente sterile 1x PBS prima di mettere le perline su intestini.
- Posizionamento di perline agarosio
- Posizionare delicatamente le perline agarosio sulla parte superiore dell'intestino utilizzando una pipetta bocca con aghi capillari tirato. Posizionare le perle con estrema cautela in quanto un trasporto sicuro danneggia l'intestino e prevenire lo sviluppo dei villi nella zona lesa.
- Posizionare il doppio delle perle come sono necessari per l'analisi in quanto l'intestino saranno sottoposti a movimenti peristaltici e circa la metà delle perline poste rotolerà fuori degli intestini oltre il tempo di coltura.
- Fissazione di intestino in coltura
- Rimuovere con cautela il supporto di trattamento da sotto la transwell e permettere l'intestino di aria secca per 3 min.
- Aggiungere 1 ml di fissativo sotto la transwell per 2 minuti, quindi coprire la parte superiore dell'intestino con 2 ml di fissativo per il resto del tempo di fissazione. Fissare con 4% paraformaldeide O / N a 4 ° C o per 2 ore a temperatura ambiente.
2 Imaging di Intestino fisse
- Immagini Wholemount
- Posizionare l'intero intestino (con fluorescenza endogena) su un vetrino con 100 ml di 1x DPBS. Usare pinze per organizzare delicatamente l'intestino.
- Utilizzare un tessuto laboratorio per rimuovere con attenzione i DPBS e immediatamente aggiungere 100 ml di glicerolo 70% per rendere il mo tessutiri trasparente e aumentare la possibile profondità di imaging.
NOTA: Se si desidera ulteriore penetrazione dell'intestino, invece di montare l'intestino in 70% glicerolo, immergere l'intestino in poche gocce di soluzione di messa a fuoco libero per 10-30 min. Pipettare fuori la soluzione messa a fuoco chiara e montare l'intestino con il Monte Chiaro. - Immergere ciascuno dei quattro angoli di un coprioggetto in creta e raccogliere una piccola quantità di argilla da utilizzare come distanziatori tra il vetrino e coprioggetto per mantenere il coprioggetto da appiattimento dell'intestino.
- Sigillare il coprioggetto sul vetrino con VALAP fusa applicato con un batuffolo di cotone.
- Immagine l'intestino su entrambi un microscopio confocale in posizione verticale o invertita. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli.
- Vibratome sezionamento di intestino fissi (per la vista in sezione trasversale di strutture intestinali)
- Intestini incorporare nel 7% di agarosio in piccoli stampi di plastica (10 x 10 x 15 mm) e consentire i blocchi di agarosio araffreddare e solidificare.
- Rimuovere i blocchi di agarosio dagli stampi di plastica e blocchi di colla di agarosio alla fase di raccolta vibratome con colla istantanea.
- Riempire la fase della raccolta con il freddo ghiaccio 1x DPBS.
- Tagliare sezioni ad uno spessore compreso tra 100-150 micron. Per le sezioni più spesse utilizzano le soluzioni di compensazione (descritti nella sezione 2.1.2) per visualizzare più in profondità la sezione trasversale.
- Versare vibratome sezioni dalla fase di raccolta in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti per la conservazione a 4 ° C.
- Immunofluorescenza colorazione dei tessuti, vibratome sezionati fissi
- Posizionare 5-12 sezioni vibratome per bene in un 24-pozzetti con 1x DPBS.
- Rimuovere 1x DPBS e aggiungere 500 ml di soluzione di permeabilizzazione per pozzetto. Agitare delicatamente i campioni per 25 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo permeabilizzazione, lavare i campioni 3 volte con PBS 1x.
- Bloccare i campioni per almeno 30 minuti in 500 ml di Blocking Solution.
- Dopo il blocco, exchange la soluzione di saturazione con 500 ml di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante e mantenere i campioni a 4 ° CO / N.
NOTA: Le diluizioni degli anticorpi primari che funzionano bene su sezioni congelate e paraffina generalmente funzionano bene su vibratome sezioni troppo, ma gli anticorpi che richiede il recupero dell'antigene nucleare in genere non funzionano bene con questo protocollo (ad esempio, BrdU). - Il giorno seguente, lavare i campioni 3 volte per 15 minuti ogni volta con soluzione bloccante.
- Dopo il lavaggio, applicare 500 ml di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante. Avvolgere la piastra di 24 pozzetti in un foglio di alluminio per proteggere i fluorofori dalla luce e rock i campioni per 45 minuti a 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare i campioni 3 volte con PBS 1x per 15 minuti ciascuno e montare le sezioni vibratome su vetrini come descritto nella Sezione 2.4.
- Montaggio vibratome sezioni
- Preparare i vetrini per vibratome il montaggio tagliando fette sottili di double-stinastro ck e metterli lungo i lati lunghi delle diapositive.
- Posizionare con cura 5-10 sezioni vibratome tra il nastro biadesivo sulle diapositive in una goccia di 100 microlitri di PBS 1x.
- Aprire tutte le sezioni e diffondere fuori in un unico livello in tutta la diapositiva.
- Rimuovere eventuali agarosio eccesso o pezzi irregolari che potrebbero impedire un coprioggetto da seduta piatta.
- Utilizzare con cautela un tessuto laboratorio per assorbire l'eccesso di PBS 1x attorno alle sezioni vibratome.
- Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio acquoso sulla cima delle sezioni vibratome e poi coprioggetto.
- Sigillare i coprioggetti sui vetrini con fuso VALAP applicato con un batuffolo di cotone.
- Immagine sezioni vibratome su entrambi un microscopio confocale diritta o capovolta. Si prega di fare riferimento alla discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di un sistema di imaging.
3 Immagini dal vivo di Intestino interi
Intestino raccolte da fetuses dopo E12.5, con l'omento collegato lasciato intatto, sviluppare con successo villi in coltura utilizzando il sistema di cui sopra. Pertanto, questo sistema ex vivo permette la cattura di immagini z-sezione live dell'intestino sviluppo che possono essere ricostruite per una vista tridimensionale della morfogenesi nel tempo.
- Impostazione di immagini dal vivo
- Utilizzare colla istantanea di aderire una membrana di policarbonato individuo a uno schermo a maglia fine. Questo fornisce un'impalcatura di sostegno per tenere l'intestino in posizione sotto la lente immersione del microscopio confocale montante. Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori dettagli sulla selezione di microscopi di imaging dal vivo.
- Posizionare lo schermo a rete al centro e di una piastra di coltura.
- Posizionare l'intestino sezionato sulla membrana di policarbonato e aggiungere una goccia di colla istantanea alle due estremità. Utilizzare solo abbastanza colla per apporre l'intestino, ma non ricoprirlo!
- Aggiungi terreni di coltura privo di fenolo rosso sotto il policarbonatomembrana nel centro pozzetto della piastra di coltura.
- Aggiungere acqua al bordo esterno della piastra di coltura per fornire umidità.
- Dal momento che l'intestino fetale subisce onde peristaltiche simili di contrazione nella cultura, aggiungere 100 ml di una soluzione 1: 5 di xilazina in 1x PBS a 3 ml di media per controllare il movimento dell'intestino durante l'imaging. Questo dosaggio controllerà i movimenti intestinali per circa 8-10 ore senza compromettere lo sviluppo dei villi.
- Per una vista trasversale dell'intestino, incorporare gli intestini vivi in una soluzione di agarosio 3-4% e tagliare sezioni spesse (150-500 micron) su un vibratome. Abbinare la rigidità del agarosio con la rigidità dell'intestino essere tagliati ed empiricamente determinata fase di sviluppo. In generale, una soluzione di agarosio al 3% funziona bene per l'intestino di età inferiore E14.5 e una soluzione al 4% funziona bene per l'intestino E15-E16.
- Incollare le sezioni vibratome ad una membrana di policarbonato, apposto su un schermo di maglia (come al punto 3.1.1) ecultura come descritto nella sezione 3.1.2-3.1.6.
- Condurre l'imaging dal vivo utilizzando un microscopio confocale a due fotoni (laser di eccitazione tra 690-1,040 nm) su un supporto verticale con un tavolo sintonizzabile.
- Laser a due fotoni sintonizzato a 900 nm fornisce penetrazione profonda con la migliore risoluzione per i segnali GFP. Riduce i danni ai tessuti durante l'imaging. Inoltre, impostando la potenza del laser per l'emissione più bassa riduce il danno tissutale. Tipicamente per ottenere una buona eccitazione di GFP, utilizzare potenza 12% sul laser a due fotoni.
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Representative Results
Cultura di espianti interi di intestini fetali consente per le analisi del luogo, la distribuzione, e la durata delle molecole di segnalazione che coordinano lo sviluppo intestinale, in quanto questo sistema consente la manipolazione della segnalazione con reagenti farmacologici o proteine ricombinanti. Il sistema di coltura transwell (Figura 1A, riprodotto da Walton et al., 2012) 2 fornisce una interfaccia aria-liquido, che permette di posizionare droga o proteine imbevuto di agarosio perline sul tessuto e quindi stabilire fonti segnalazione locale (Figura 1B ). Intestino raccolte da embrioni a E10 a E18.5 sopravvivono nella cultura su transwells e subiscono le onde peristaltica-come di movimento. Intestino iniziato nella cultura da E13.5 sopravvivere circa 10 giorni o più o meno a P3, lo stadio di sviluppo del mouse quando la formazione cripta è osservata la prima volta. Anche se intestini fase iniziale sopravvivono nella cultura, intestini raccolte primaE12.5 non emergono villi affidabile, probabilmente perché la sierosa non è cresciuta fino a coprire completamente l'intestino da quel momento. Cluster mesenchimali formano e villi cominciano ad emergere e allungare in intestini iniziato nella cultura a E12.5, E13.5 E14.5 o, anche se lo sviluppo è leggermente in ritardo rispetto ai controlli, incolti fase-matched (Figura 1, riprodotti da Walton et al., 2012) 2. Indipendentemente dalla fase dell'intestino all'inizio della cultura (E12.5-E14.5), gli intestini sembrano sempre avere un ritardo approssimativo di 24 ore. Intestino E14 coltivate in coltura per due giorni mostrano una crescita dei villi che sono più simili a quelli di intestino E15 di villi dell'intestino E16 coltivate in utero (Figura 1C-F) 2.
La struttura regolare di cluster mesenchimali è rivelata da ricostruzione tridimensionale di sezioni ottiche di un intero PDGFRα GFP / + intestino a E15.5 (Figura 2 </ Strong>, riprodotto da Walton et al., 2012) 2. Questa immagine consiste di z-pile di 54 campi di vista che sono stati cuciti insieme dal software Leica LAS-AF. Ogni punto all'interno dell'intestino è un cluster mesenchimale visualizzato da GFP tagged nucleare espresso dal locus PDGFRα 14. L'alta risoluzione delle immagini consente allo spettatore di zoom-in a determinate aree per esaminare i dettagli, ma offre in profondità le relazioni spaziali che non possono essere raccolte dai singoli campi di vista o l'ingrandimento di potenza inferiore. Movie 1 è una serie passando attraverso la z cucito immagini -stack che sono 3D ricostruiti nella Figura 2. Le singole sezioni ottiche consentono la visualizzazione di ulteriori dettagli come singole cellule all'interno dei cluster.
Sezioni ottiche di immunofluorescenza wholemount di vascolarizzazione intestinale con PECAM anticorpo (BD Pharmingen 557355; diluito 1: 1.000) sono stati catturati con eccitazione a due fotoni e ricognizionestruito con software Imaris (Figura 3). Questa visione tridimensionale dei vasi sanguigni intestinali rivela una intricata rete di vasi che non può essere pienamente apprezzato dai preparativi sezione sottile. Movie 2, ruotando una proiezione tridimensionale dell'immagine ricostruita in figura 3, permette di ulteriore apprezzamento di come il aumentata informazioni fornite ricostruzione tridimensionale può migliorare la comprensione di patterning strutturale.
Vibratome sezionamento consente una visualizzazione tridimensionale dell'intestino da una osservazione trasversale. Nella Figura 4, il rapporto dei cluster in via di sviluppo (contrassegnato con PDGFRα GFP / +) 14 con l'epitelio e mesenchima circostante (contrassegnato con membrana di pomodoro (Rosa26 mT / Mg) 15 si osserva.
In alternativa, questo rapporto può essere visualizzato da immunofluore anticorposcence colorazione (Figura 5) dei cluster mesenchimali (verde, marcato con anti-PDGFRα (SantaCruz C-20, diluito 1: 200)) con l'epitelio (rosso, marcato con anti-Ecadherin (BD Transduction Labs 610.181; 1: 1.000 diluizione).
L'intero sistema di coltura organo può anche essere esteso per consentire a due fotoni di imaging di sviluppare intestini fetali. In questa configurazione, l'intestino fetale è incollata una membrana di policarbonato sostenuto da uno schermo di maglia in una piastra di coltura maggiore (Figura 6). La dimensione ben maggiore della piastra di coltura consente per le lenti microscopio confocale per contattare l'intestino dentro bene.
Figura 1. Sviluppo di intere intestini fetali in un sistema di coltura transwell. (A) intestini fetali immessi in un mem transwellbrane in una piastra di coltura 6 bene con BGJb media. Top due intestini sono E12.5, in basso due intestini sono E13.0. (B) di albumina sierica bovina imbevuto perline agarosio (più leggero blu) immessi in un duodeno nel sistema di coltura transwell. La scura macchia blu è X-gal colorazione per Ptc LacZ / + nella marcatura Hedgehog linea di topi giornalista cluster mesenchimali 16. (CF) Sezioni di E14.0 appena raccolti (C), E15.0 (D) ed E16. 0 (E), il tessuto duodenale colorato con E-caderina (verde) e DAPI (blu). Al E14.0, l'epitelio unremodeled è ancora pseudostratificato, mentre a E15.0 e E16.0, villi nascenti sono visibili. (F) Un segmento intestinale identico a quello visto in (C), ma in coltura per due giorni (E14 + 2 giorni) dimostra che villi si sviluppano nella cultura, anche se leggermente in ritardo. Pannelli (CF) vengono ristampati da Walton et al., 2012 2 sup>. Barre con la scala sono 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. ricostruzione tridimensionale dei campi cuciti su z-stack da un wholemount E15.5 PDGFRα EGFP / + intestino. L'immagine è una ricostruzione parziale (1 cinque sezioni micron dal centro della 65 z-sezioni) da 54 campi cucite di vista catturati utilizzando la fase motorizzato del microscopio confocale LeicaSP5X su un inverted DMI 6000 stand con laser di eccitazione a due fotoni a 900 nm. Software Leica LAS-AF cucito Z-stack insieme per formare l'intera immagine. Scalebar è di 1 mm.
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Figura 3 la ricostruzione tridimensionale di sezioni ottiche mostrano wholemount anti-PECAM immunofluorescenza della vascolarizzazione intestinale in un duodeno E14. Sezioni ottiche sono stati catturati su un microscopio confocale LeicaSP5X su un montante DMI 6000 stand con eccitazione a due fotoni a 900 nm e tre dimensionalmente ricostruito utilizzando il software Imaris 7.6.1. Scalebar è di 200 micron.
Figura 4 immagini confocale di vibratome sezionato E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG digiuno che mostra la stretta associazione delle / + cellule PDGFRα EGFP dei cluster mesenchimali (verde) con la loro epitelio sovrastante e mesenchima circostante (rosso; membrana Pomodoro da Rosa26 mTmG). < / Strong> barre con la scala sono 50 micron di pannelli superiori e 25 micron di pannelli inferiori.
Figura 5: ricostruzioni tridimensionali di immagini confocali da E15.5 vibratome sezionata intestino che erano immunofluorescenza anticorpi macchiato. Scalebar è di 50 micron.
Figura 6 Adeguamento del sistema di coltura transwell per 2-fotone immagini dal vivo. (A) Mesh schermo è collocato in un piatto di cultura. (B) membrana in policarbonato è incollato allo schermo di maglia. (C) Intestino sono incollati alla membrana in policarbonato e la coltura con DMEM privo di fenolo media.
Film 2 film Rotazione mostra la ricostruzione tridimensionale delle sezioni ottiche di PECAM vascolarizzazione tinto in duodeno E14 in Figura 2.
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Discussion
La natura dinamica e le interazioni complesse dei tessuti dell'intestino in via di sviluppo richiede la visualizzazione 3D per avere una comprensione completa di questi eventi morfogenetici. Con la continua evoluzione tecnologia di imaging, la capacità di esaminare villi morfogenesi in dettaglio si sta sviluppando / miglioramento e con esso, la comprensione della comunicazione spaziale e l'interazione durante l'organogenesi è notevolmente migliorata.
Metodi di coltura intestini interi alternativi sono stati testati, ma il sistema transwell rimane la più affidabile per tempi più lunghi di cultura e per mantenere il normale cluster e villi patterning. Sistemi di coltura tridimensionale (Matrigel o collagene) funzionano bene per periodi brevi cultura (meno di 24 ore) di intestini più giovani (E12.5-E15.5), ma una volta che gli intestini cominciano subire movimenti peristaltici-come e secernono enzimi e rifiuti nel lume, i substrati tridimensionali non reggono bene. Intestino in coltura liquidas svilupperà anche, però, la mancanza di sostegno o di riferimento per l'orientamento in una cultura fluttuante sembra alterare il normale andamento dei cluster e villi. Pertanto, il sistema transwell è preferibile esaminare cluster di patterning e villi emergenza e escrescenza.
Un altro metodo per wholemount l'imaging in tempo reale con un set up è meno rigorosa usare perni minutien apporre l'intestino fetale di un sottile strato del 7% agarosio sul fondo di una piastra 35 x 10 mm. Anche se questo metodo è più semplice da configurare, si noti che il suo uso è limitato a stadi più giovani (E12.5-E15.5) o per tempi più brevi di coltura in quanto il matrigel non può contenere fino a secrezioni intestinali.
Per preparare le piastre di coltura, versare abbastanza fuso 7% agarosio a coprire solo la parte inferiore di una piastra 35 x 10 mm. Inserire un tubo capillare di vetro al centro della agarosio mentre è ancora malleabile. Una volta che l'agarosio si è solidificato, rimuovere il capillare di vetro e posizionare tegli fetale intestino lungo il pozzo creato dal capillare. Riempire il capillare bene con Matrigel per circondare l'intestino e posizionare il piatto di coltura a 37 ° C fino a quando il set di Matrigel. Aggiungi attentamente rosso fenolo-gratis DMEM cultura mediatica. Posizionare la piastra di 35 mm x 10 mm all'interno di una piastra 60 x 15 e riempire la piastra di 60 mm, con acqua per creare una camera umida.
La selezione del metodo di montaggio (wholemount o vibratomo) per l'imaging in tempo reale si basa sul l'orientamento desiderato della zona da visualizzare. Ad esempio, per visualizzare i cambiamenti di forma delle cellule epiteliali, z-stack attraverso un intestino wholemounted fornirà vista delle superfici apicali e basali. Per visualizzare interkinetic migrazione nucleare delle cellule epiteliali all'interno del foglio epiteliale, vibratome sezioni permettono una fine a (trasversalmente) al fine di osservare le superfici apicali e basali.
Preparazione dei campioni è fondamentale per cedere i migliori risultati di imaging. Quando si utilizza vibratome sezioni and microscopia confocale normale, buona risoluzione può essere ottenuto fino a una profondità di 75 micron, senza un reagente di compensazione. Attualmente, un reagente di compensazione per campioni vivi non è stato identificato così la profondità di imaging è limitata. Per campioni fissi, l'uso di un reagente di compensazione può migliorare notevolmente la profondità delle immagini. Il reagente di compensazione trovata per fornire la migliore morfologia e la risoluzione è stata messa a fuoco Cancella 17. Dopo 30 min di compensazione in Focus chiaro e il montaggio a Mount chiaro, tutta la profondità di tutte le fasi di intestini embrionali può essere ripreso con ottima risoluzione. A meno costosa di compensazione alternativo è del 70% glicerolo, tuttavia la profondità massima di penetrazione nei tessuti embrionali è di 150 m, successivamente, la risoluzione e l'intensità del segnale si perde.
Una nota importante è che i segnali sono più definite in campioni che sono montati e ripreso lo stesso giorno la colorazione è stata completata. Montaggio con mezzo di montaggio segnale conservazione acquosa (come la soluzione anti-fade Prolungare oro (Life Technologies P36930) aiuta a preservare il segnale, ma solo per breve tempo; le immagini più chiare sono sempre ottenuti immediatamente dopo la colorazione e il montaggio dei campioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
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