Abstract
De fleste morphogenetic prosesser i foster tarmen har blitt utledes fra tynne snitt av fast vev, og gir øyeblikksbilder av endringer over utviklingsstadier. Tredimensjonal informasjon fra tynne seriesnitt kan være utfordrende å tolke på grunn av vanskeligheter med å rekonstruere seriesnitt perfekt og opprettholde riktig orientering av vevet enn seriesnitt. Nyere funn av Grosse et al., 2011 markere betydningen av tredimensjonalt informasjon for å forstå morphogenesis av utviklings villi av tarmen en. Tredimensjonal rekonstruksjon av enkeltvis merkede tarmceller viste at de fleste av de intestinale epitelceller kontakt med både de apikale og basaloverflater. Videre tredimensjonal rekonstruksjon av aktin cytoskjelettet på den apikale overflate av epitelet viste at tarmlumen er kontinuerlig, og at sekundære lumen er en gjenstand av sectioning. Disse to punkter, sammen med en påvisning av interkinetic atom migrasjon i intestinal epitelium, defineres det fremkallende intestinal epitelium som pseudostratified epitel og ikke som tidligere antatt stratifisert 1. Evnen til å observere Epitel tredimensjonalt var banebrytende for å demonstrere dette punktet, og redefinerte epitelial morphogenesis i fosterets tarmen. Med utviklingen av multi-foton avbildningsteknologi og tredimensjonal rekonstruksjon programvare, til evnen til å visualisere intakt, utvikle organer er i sterk forbedring. To-foton eksitasjon tillater mindre skadelig inntrengning dypere inn i vev med høy oppløsning. To-foton avbildning og 3D rekonstruksjon av hele føtale mus tarmen i Walton et al. 2012 bidratt til å definere mønsteret av villus utvekst 2. Her beskriver vi et helt organ kultur system som lar ex vivo utvikling av villi og utvidelser av at kultur system for å tillatetarmen til å være tredimensjonalt fotografert under utvikling.
Protocol
MERK: Alle mus ble håndtert humant å bruke protokoller godkjent av University of Michigan Medical School Enhet for forsøksdyr medisin og i henhold til retningslinjene ved Universitetet komité for bruk og stell av dyr.
1. Hele Organ Kultur System
- Utarbeidelse av media og kulturplater
- I en vev kultur hette, fjerne 5 ml BGJb media fra aksje flasken og tilsett 5 ml Pen / Strep. Forbered en arbeider lager av media i en 50 ml konisk rør, ved å tilsette 1 ml 5 mg / ml askorbinsyre til 49 ml BGJb media (med Pen / Strep).
- Forbered en 6 vel kultur plate ved å legge en ml under hvert av transwells.
MERK: Hvis alle 6 transwells ikke brukes, flytte ekstra transwells inn en frisk steril 6 brønn plate for senere bruk. Tilsett 3 ml arbeider BGJb media til hver av tre 10 cm sterile petriskåler.
- Forberedelse til disseksjon
- Sug dissekere verktøy i 70% etaNol og sørg for å holde verktøyene rent mens du arbeider.
- Sett opp dissekere område med et stort isen bøtte og plassere seks godt kultur plate og 10 cm petriskåler med BGJb media på is. Arbeid på is så mye som mulig mens dissekere og forberede tarmen for kultur.
- Anesthetize voksen hunnmus i et kammer med isofluorane (100 pl) før euthanization ved halshugging for innhøsting av fosterets tarmen.
- Etter høsting fostrene fra sin mor, iscenesette hver fosteret nøye i henhold til Theiler staging Figur 13. Ikke stol på dager etter samleie for å fastslå alder for hvert foster som variasjoner på opptil 24 timer i utviklingsstadiet blir rutinemessig observert innenfor en enkelt kull.
- Disseksjon av føtale tarmen
- Avlive fostre ved halshugging forut for fjerning av innvollene.
- Dissekere hver tarmen i 1x Dulbeccos Fosfat saltvann (DPBS) og deretter place den inn i en 10 cm petriskål med arbeider BGJb media.
- Fjern forsiktig milten fra mage og bukspyttkjertel fra magesekken og den øvre duodenum.
- Forsiktig skille omentum ta vare å forlate omentet festet så mye som mulig, og separering av forbindelsene bare nok til å tillate tarmen å rettes ut.
MERK: For tarmen eldre enn E14.5 eller de som blir dyrket i mer enn 24 timer, forsiktig skille tarmen inn i 3 like store segmenter for å tillate luminal innholdet til å flyte gjennom tarmen og bli utvist fra kuttet endene. Imidlertid, for kulturer i gang før E13.5, vente til etter 24 timer av dyrking før separering av de 3 segmenter av tarmen for å tillate serosa til riktig vokse over lengden av tarmen. - Bruk en munn-pipette for å overføre tarmstykker på de transwells av kulturplate (1.1.2).
- Forsiktig reposisjonere tarmen etter behov, slik at de er rette over hele transwell.
MERK: Når tarmen begynne å flytte luminal innholdet gjennom røret, vil eventuelle knekk på tarmen føre til en backup og skade på tarmen.
- Kultur og behandling
- Fjern materialet fra under Transwell, tilsett 700 mL av behandling media (jobber media med ekstra rekombinante proteiner eller farmakologiske hemmere) under Transwell.
- Legg 300 mL av behandlingen medier dråpevis på toppen av tarmen og la den suge gjennom Transwell. Reposisjonering tarmen etter behov.
- Endring -behandlingsmedier minst en gang daglig eller oftere, avhengig av halveringstiden for behandling reagens.
- Fremstilling av protein fuktet agarosekuler for en lokalisert kilde for behandling reagens
- Resuspender agarosekulene i sin lagringsbeholder og overføre 100 ul av agarose perler inn i et 1,5 ml mikro-sentrifugerør.
- Fylle den gjenværende volum av røret med steril 1 x Phosphate-bufret saltvann (PBS), og bland perlene for å vaske dem. Plasser mikrosentrifugerør i et stativ i et par minutter for å tillate kulene fikk sette seg på bunnen og deretter pipettér av PBS fra på toppen av kulene. Påfyll mikrosentrifugen tube med sterilt 1x PBS og gjenta vaskeprosessen to ganger mer.
- Klargjør for proteinet av interesse ved to ganger den ønskede konsentrasjon for behandling.
- Bland 5 pl av de vaskede agarosekuler med 5 pl av 2 x protein lager og forsiktig agitere perlene i proteinet. Plasser røret på is i 1 time, blandes forsiktig hver 10-15 min.
- Skyll perlene kort i sterile 1x PBS før du legger perlene på tarmen.
- Plassering av agarosekuler
- Forsiktig plassere agarosekulene på toppen av tarmen ved hjelp av en munn-pipette med trukket kapillær nåler. Plassere perler med ekstrem forsiktighet som røff behandling vil skade tarmen og hindre villus utvikling i det skadde området.
- Plasser dobbelt så mange kuler som er nødvendig for analysen, siden tarmen vil gjennomgå peristaltiske bevegelser og omtrent halvparten av kulene som er lagt inn vil rulle ut av tarmen over dyrkning tid.
- Fiksering av dyrkede tarmen
- Fjern forsiktig behandling mediet fra under Transwell og tillate tarmen lufttørke i 3 min.
- Tilsett 1 ml fiksativ under Transwell i 2 min, og deretter dekke toppen av tarmen med 2 ml fiksativ for resten av fiksering tid. Løs med 4% paraformaldehyd O / N ved 4 ° C eller i 2 timer ved RT.
2. Imaging av Faste Innvoller
- Wholemount bildebehandling
- Plassere hele tarmen (med endogen fluorescens) på et lysbilde med 100 mL av 1x DPBS. Bruk pinsett til forsiktig ordne tarmen.
- Bruk en lab vev for å forsiktig fjerne DPBS og umiddelbart legge 100 mL av 70% glyserol for å gjøre vevet more gjennomsiktig og øke den mulige dybde for avbildning.
MERK: Hvis videre penetrasjon av tarmen er ønskelig, i stedet for å montere tarmen i 70% glyserol, suge tarmen i noen få dråper av Focus Klar løsning for 10-30 min. Pipettér av Focus Klar oppløsning og montere tarmen med Mount Clear. - Dypp hver av de fire hjørnene av et dekkglass i modelleire og plukke opp en liten mengde av leire for å bruke som avstandsstykker mellom lysbildet og dekkglass for å holde dekkglass fra utflating tarmen.
- Forsegle dekkglass på lysbildet med smeltet VALAP påføres med en bomullspinne.
- Bilde tarmen på enten en oppreist eller invertert konfokal mikroskop. Vennligst referer til diskusjon for ytterligere detaljer.
- Vibratome seksjonering av fast tarmen (for tverrsnitt av intestinal strukturer)
- Embed tarmen i 7% agarose i små plaststøpeformer (10 x 10 x 15 mm) og la agarose blokker tilavkjøles og stivne.
- Fjern agarose blokker fra plastformer og lim agarose blokker til vibratome samling scenen med instant lim.
- Fyll samlingen scenen med iskald 1x DPBS.
- Snitt i en tykkelse mellom 100-150 mikrometer. For tykkere seksjoner bruke clearing løsninger (som beskrevet i seksjon 2.1.2) for å visualisere dypere inn i tverrsnitt.
- Hell vibratome seksjoner fra oppsamlingstrinnet, i en brønn av en 6-brønns plate for lagring ved 4 ° C.
- Immunfluorescens farging av faste, vibratome seksjonert vev
- Plasser 5-12 vibratome snitt per godt inn i en 24-brønns plate med 1x DPBS.
- Fjern 1x DPBS og tilsett 500 mL av permeabilization løsning per brønn. Rist prøvene for 25 min ved RT.
- Etter permeabilization, vaske prøvene tre ganger med 1x PBS.
- Blokkere prøvene i minst 30 min i 500 mL av blokkering løsning.
- Etter blokkering, exchange den blokkerende løsning med 500 mL av primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning og holde prøvene ved 4 ° CO / N.
MERK: Den primære antistoff fortynninger som fungerer godt på frosne og parafinsnitt generelt fungerer godt på vibratome deler også, men antistoffer krever atom antigen henting generelt ikke fungerer godt med denne protokollen (f.eks BrdU). - Den følgende dag, vaskes prøvene 3 ganger i 15 min hver gang med blokkeringsløsning.
- Etter vasking, anvende 500 pl av det sekundære antistoff fortynnet i blokkeringsløsning. Vikle 24-brønns plate i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys og fluoroforer gynge prøvene i 45 min til 2 t ved RT.
- Vask prøvene tre ganger med 1x PBS i 15 min hver og montere vibratome seksjoner på lysbilder som beskrevet i punkt 2.4.
- Montering vibratome seksjoner
- Forbered lysbilder for vibratome montering ved å kutte tynne skiver av dobbel-STIck tape og plassere dem langs langsidene av lysbildene.
- Plasser forsiktig 5-10 vibratome seksjoner mellom dobbel-stick tape på lysbildene i en dråpe 100 mL av 1x PBS.
- Brett ut alle deler og spre dem ut i et enkelt lag på tvers av raset.
- Fjern overflødig agarose eller ujevne biter som ville hindre en dekkglass fra sittende flat.
- Bruke nøye en lab vev for å suge opp overflødig 1x PBS fra rundt vibratome seksjoner.
- Tilsett en dråpe vandig montering medium på toppen av vibratome seksjoner og deretter dekkglass.
- Forsegle dekkglass på lysbildene med smeltet VALAP påføres med en bomullspinne.
- Bilde vibratome seksjoner på enten en stående eller invertert konfokal mikroskop. Vennligst referer til diskusjon for ytterligere informasjon om utvalg av et bildebehandlingssystem.
3. Levende Imaging av Whole Innvoller
Innvoller høstet fra fetuses etter E12.5, med tilkoblet omentum intakt, lykkes med å utvikle villi i kultur bruker over systemet. Derfor tillater denne ex vivo system fangst av levende z-seksjon bilder av utviklings tarmen som kan rekonstrueres for en tre-dimensjonal visning av morphogenesis over tid.
- Sette opp direkte avbildning
- Bruk instant lim til å følge et individ polykarbonat membran til et finmasket skjerm. Dette gir et støttestillas for å holde tarmen på plass under dyppe linsen i oppreist konfokalmikroskop. Vennligst referer til diskusjon avsnitt for mer informasjon om valg av levende bilde mikroskoper.
- Plasser mesh sikt i sentrum brønn av en kulturplate.
- Plasser dissekert tarmen på polykarbonat membran og legge en dråpe instant lim i hver ende. Bruk bare nok lim til å feste tarmen, men ikke pels det!
- Legg kulturmedier uten fenolrødt under polykarbonatMembranen i sentrum godt av kulturen platen.
- Tilsett vann til den ytre kanten av den kultur-plate for å gi fuktighet.
- Siden fetal tarm undergår peristaltiske-som bølger av sammentrekning i kultur, tilsett 100 pl av en 1: 5 oppløsning av xylazin i 1x PBS til 3 ml av media for å styre bevegelse av tarmen samtidig avbildning. Denne dosen vil kontrollere tarmbevegelser for ca 8-10 timer uten at det går villus utvikling.
- For en tverrstilt visning av tarmen, legge inn live tarmen i en 3-4% agarose løsning og skjære tykke seksjoner (150-500 mikrometer) på en vibratome. Matche stivhet av agarose med stivhet i tarmen kuttes og empirisk bestemt utviklingsstadiet. Vanligvis en 3% agarose løsning fungerer bra for tarmene yngre enn E14.5 og en 4% løsning fungerer bra for tarmene E15-E16.
- Lim vibratome seksjoner til en polykarbonat membran festet til en maske skjermen (som i avsnitt 3.1.1) ogkultur som beskrevet i punkt 3.1.2-3.1.6.
- Gjennomføre direkte avbildning ved hjelp av en to-foton confocal fluorescens mikroskop (eksitasjon laser mellom 690-1,040 nm) på en oppreist stativ med fleksibel bord.
- To-foton laser innstilt til 900 nm gir dyp penetrering med den beste oppløsningen for GFP signaler. Det reduserer skade på vev mens bildebehandling. I tillegg, å sette strømmen av laseren til det lavest mulige utslipp reduserer vevsskade. Typisk å få en god eksitasjon av GFP, bruker 12% strøm på to-foton laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrkning av hele eksplantater av føtale tarmene tillater for analysene av plasseringen, distribusjon, og varigheten av de signalmolekyler som koordinerer intestinal utvikling, da dette system muliggjør manipulering av signale med farmakologiske reagenser eller rekombinante proteiner. Systemet Transwell kultur (figur 1A, gjengitt fra Walton et al. 2012) 2 gir en luft-væske-grensesnittet, som gjør det mulig å sette inn eller proteinlegemiddel fuktet agarose perler på vevet og derved å opprette lokale signalkilder (figur 1B ). Innvoller høstet fra embryoer E10 til E18.5 overleve i kultur på transwells og gjennomgå peristaltiske-lignende bølger av bevegelse. Innvoller startet i kultur fra E13.5 overleve ca 10 dager eller omtrent til P3, scenen av muse utvikling når krypten formasjonen er først observert. Selv om tidlig stadium tarmen overleve i kultur, tarmer høstes førE12.5 ikke dukke villi pålitelig, sannsynligvis fordi serosa ikke har vokst til å dekke tarmen innen den tid. Mesenchymale klynger danne og villi begynner å dukke opp og forlenge i tarmen startet i kultur på E12.5, E13.5 eller E14.5, selv om utviklingen er litt forsinket i forhold til ukultur, scene-matchet kontroller (Figur 1, gjengitt fra Walton et al. 2012) 2. Uavhengig av scenen av tarmen ved starten av kultur (E12.5-E14.5), tarmen vises alltid har en omtrentlig forsinkelse på 24 timer. E14 tarmen dyrket i kultur for to dager viser vekst av villi som er mer lik de av E15 tarmen enn villi av E16 tarmen dyrket in utero (figur 1C-F) 2.
Det vanlige mønsteret av mesenchymale klynger er avslørt av tredimensjonal rekonstruksjon av optiske deler av en helhet PDGFRα GFP / + tarmen på E15.5 (figur 2 </ Strong>, gjengitt fra Walton et al., 2012) 2. Dette bildet består av z-stabler av 54 synsfelt som ble sydd sammen av Leica LAS-AF programvare. Hver flekk på innsiden av tarmen er en mesenchymale klynge visualisert ved atom merket GFP uttrykt fra PDGFRα locus 14. Den høye oppløsningen i bildet gjør at betrakteren til å zoome inn på visse områder for å undersøke detaljer, men gir i dybden romlige relasjoner som ikke kan leses ut fra enkelt synsfelt eller lavere strøm forstørrelse. Movie 1 er en serie stepping gjennom sydd z -stack bilder som er 3D rekonstruert i Figur 2. De enkelte optiske seksjoner tillate ytterligere visualisering av detaljer som enkeltceller innenfor klynger.
Optiske deler av wholemount immunfluorescens av tarm blodkar med PECAM antistoff (BD Pharmingen 557355; utvannet 1: 1000) ble tatt med to-foton eksitasjon og recongjennomgang gjennom med Imaris programvare (figur 3). Denne tre-dimensjonal visning av intestinal blodkar avslører en intrikat nettverk av blodkar som ikke kan bli fullt ut forstås av tynne seksjons preparater. Film 2, en roterende tredimensjonal projeksjon av det rekonstruerte bildet i figur 3, gjør det mulig for ytterligere forståelse av hvordan økt informasjon ved gitt tredimensjonal rekonstruksjon kan gi en bedre forståelse av konstruksjons mønster.
Vibratome seksjonering åpner for tredimensjonal visning av tarmen fra en tverrstilt utsikts. I figur 4, er forholdet av de utviklings klynger (merket med PDGFRα GFP / +) 14 med epitel og omliggende mesenchyme (merket med membran Tomat (Rosa26 mT / mg) 15 observeres.
Alternativt kan dette forholdet bli sett av antistoff Immunofluorescensscence farging (figur 5) av mesenchymale klynger (grønn, merket med anti-PDGFRα (Santacruz C-20, fortynnet 1: 200)) med epitel (rød, merket med anti-Ecadherin (BD Transduksjon Labs 610181, 1: 1000 fortynning).
Denne hel-organkultur-systemet kan også utvides for å tillate to-foton avbildning for å utvikle fetal tarm. I dette oppsettet blir fetal tarm limt til en polykarbonatmembran som støttes av en mesh sikt i en større kulturplate (figur 6). Jo større vel størrelsen av kulturen platen gir mulighet for de konfokale mikroskop linser for å kontakte tarmen innvendig godt.
Figur 1. Development hele foster tarmen på en Transwell kultursystem. (A) Foster tarmen plassert på en Transwell membrane i en 6-brønners dyrkings-plate med BGJb media. Topp to Tarmen er E12.5, to nederste tarmen er E13.0. (B) bovinserumalbumin gjennomvåt agarosekuler (lysere blå) plassert på en tolvfingertarmen i Transwell kultursystem. Jo mørkere blå flekken er X-gal farging for Ptc LacZ / + i Hedgehog reporter mus linje merking mesenchymale klynger 16. (CF) Tverrsnitt av nyhøstet E14.0 (C), E15.0 (D) og E16. 0 (E), duodenal vev farget med E-cadherin (grønn) og DAPI (blå). På E14.0 er unremodeled epitel fortsatt pseudostratified, mens på E15.0 og E16.0, begynnende villi er synlige. (F) En tarmsegment identisk med det som ble sett på (C), men dyrket i to dager (E14 + 2days) viser at villi utvikle seg i kultur, men litt forsinket. Paneler (CF) er gjengitt fra Walton et al., 2012 2 sup>. Scalebars er 50 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tredimensjonal rekonstruksjon av strikkede felt av z-stabler fra en E15.5 wholemount PDGFRα EGFP / + tarmen. Bildet er en delvis gjenoppbygging (fem 1 mikrometer seksjoner fra midten av 65 z-seksjoner) fra 54 sydd felt syn tatt ved bruk av motoriserte fasen av LeicaSP5X konfokalmikroskop på en omvendt DMI 6000 stativ med to-foton laser eksitasjon ved 900 nm. Leica LAS-AF programvare sydd Z-stabler sammen for å danne hele bildet. Scalebar er 1 mm.
n "src =" / filer / Ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Tredimensjonal rekonstruksjon av optiske seksjoner som viser wholemount anti-PECAM immunfluorescens av tarm blodkar i en E14 tolvfingertarmen. Optiske seksjoner ble tatt opp med et LeicaSP5X konfokalmikroskop på en oppreist DMI 6000 stå med to-foton eksitasjon ved 900 nm og tre form rekonstruert ved hjelp av Imaris 7.6.1-programvaren. Scalebar er 200 mikrometer.
Figur 4. Confocal bilder av vibratome seksjonert E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG jejunum som viser den nære sammenslutning av de PDGFRα EGFP / + celler av mesenchymale klynger (grønn) med sin overliggende epitel og omkringliggende mesenchyme (rød, membran Tomato fra Rosa26 mTmG). < / Strong> Scalebars er 50 mikrometer i de øvre paneler og 25 mikrometer i de nedre paneler.
Figur 5. Tre-dimensjonale rekonstruksjoner av confocal bilder fra E15.5 vibratome seksjonert tarmen som var antistoff immunfluorescens farget. Scalebar er 50 mikrometer.
Figur 6. Tilpasning av Transwell kultur system for 2-foton direkte avbildning. (A) mesh sikt er plassert i en dyrkningsskål. (B) polykarbonat membran er limt til mesh sikt. (C) Innvoller er limt til polykarbonatmembran og kultivert med fenol-fri DMEM medier.
Film 2. Roterende film som viser den tredimensjonale rekonstruksjon av de optiske deler av PECAM farget vaskulaturen i E14 duodenum i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dynamiske natur og komplekse vev interaksjoner av utviklings tarmen krever 3D-visualisering for å ha en full forståelse av disse morphogenetic hendelser. Med utvikling bildeteknologi, muligheten til å undersøke villus morphogenesis i detalj er utvikling / forbedring og med det, er forståelsen av den romlige kommunikasjon og samhandling under organogenesen sterkt forbedret.
Alternative metoder for dyrking av hele tarmen er også testet, men Transwell systemet forblir den mest pålitelige for lengre kultur ganger og for å opprettholde normal klynge og villus mønster. Tredimensjonal kultursystemer (matrigel eller kollagen) fungerer godt for korte kultur perioder (mindre enn 24 HR) på yngre tarmen (E12.5-E15.5), men når tarmen begynne omgår peristaltiske-lignende bevegelser og utskiller enzymer og avfall inn i lumen, gjør tredimensjonale underlag som ikke holder seg godt. Tarmen i flytende kulturs vil også utvikle seg, men mangelen på støtte eller referanse for orientering i en fritt-flytende kultur synes å endre normale mønster av klyngene og villi. Derfor er Transwell system foretrukket å undersøke klynge mønster og villus veksten og utvekst.
En annen fremgangsmåte for wholemount direkte avbildning med en mindre streng er satt opp, er å bruke minutien nålene å påføre fetal tarm til et tynt lag på 7% agarose på bunnen av et 35 x 10 mm plate. Selv om denne metoden er enklere å sette opp, merk at bruken er begrenset til yngre stadier (E12.5-E15.5) eller for kortere dyrknings ganger siden matrigel ikke vil holde seg til tarm sekret.
For å fremstille kulturplater, hell nok smeltet 7% agarose for å bare dekke bunnen av et 35 x 10 mm plate. Plasser en glass kapillarrør i sentrum av agarose mens den fremdeles formbare. Når agarose har stivnet, fjerne glass kapillær og plassere than foster tarmen langs brønnen skapt av kapillær. Fyll kapillær godt med matrigel å omgi tarmen og plassere kulturen fatet ved 37 ° C før matrigel sett. Legg fenol rød-fri DMEM kultur media nøye. Plasser 35 x 10 mm plate i et 60 x 15 mm plate, og posisjonen 60 mm plate med vann for å lage et fuktighetskammer.
Seleksjon av monteringsmetoden (wholemount eller vibratome) for direkte avbildning er basert på den ønskede orientering av det område som skal visualiseres. For eksempel for å vise endringer i epitelcelle form, z-stabler gjennom en wholemounted tarmen vil gi utsikt over apikale og basale overflater. Hvis du vil vise interkinetic atom migrasjon av epitelceller innenfor epiteliale ark, vibratome seksjoner tillate en slutt på (tverrgående) sikte på å observere de apikale og basale overflater.
Fremstilling av prøvene er kritisk for å gir de beste avbildningsresultatene. Når du bruker vibratome seksjoner and standard konfokal mikroskopi, kan god oppløsning oppnås opp til dybder på 75 mikrometer uten en lysning reagens. Foreløpig har en lysning reagens for live prøvene ikke blitt identifisert så dybden av bildebehandling er begrenset. For faste prøver, kan bruken av en lysning reagens betraktelig bedre dybden av bildebehandling. Clearing reagent funnet å gi best morfologi og oppløsning var Focus Clear 17. Etter 30 min med clearing i Fokus klar og montering i Mount klar, kan hele dybden av alle faser av embryonale tarmen avbildes med god oppløsning. Et mindre kostbart alternativ er lysning 70% glycerol, men den maksimale dybden av gjennomtrengning i embryonale vev er 150 m, hvoretter oppløsningen og intensiteten av signalet faller bort.
En viktig merknad er at signalene blir mest definert i prøver som er montert og avbildes på samme dag fargingen ble gjennomført. Montering med signal bevare vandig monteringsmedium (slik som Prolong gull anti-fade-løsning (Life Technologies P36930) hjelper med å bevare den signal, men bare en kort stund; de klareste bildene er alltid oppnås umiddelbart etter farging og montering prøvene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
