Abstract
Большинство морфогенетические процессы в кишечнике плода были выведены из тонких срезов фиксированных тканей, обеспечивая снимки изменений более стадиях развития. Трехмерная информация из тонких серийных срезов может быть сложным для интерпретации в связи с трудностями восстановления серийных срезов прекрасно и поддержание правильной ориентации ткани над серийных срезов. Недавние открытия, сделанные Grosse др., 2011 подчеркивают важность трехмерной информации в понимании морфогенез развивающихся ворсинок кишечника 1. Трехмерная реконструкция однократно меченных клеток кишечника показали, что большинство из эпителиальных клеток кишечника связаться оба апикальных и базальных поверхностей. Кроме того, трехмерная реконструкция цитоскелета на апикальной поверхности эпителия показали, что просвет кишечника непрерывна и что вторичные люмен являются артефактом сectioning. Эти две точки, наряду с демонстрацией interkinetic атомной миграции в кишечном эпителии, определяется развивающийся кишечный эпителий как многорядный эпителий, а не расслаивается, как считалось ранее 1. Возможность наблюдать эпителия трехмерно был семенных к демонстрации этой точки и переосмысление эпителиальных морфогенез в плода кишечника. С развитием многофотонной технологии визуализации и трехмерного программного обеспечения реконструкции, способность визуализировать нетронутыми, разработки органы быстро улучшается. Двухфотонного возбуждения позволяет менее вредны проникновение вглубь тканей с высоким разрешением. Двухфотонное изображений и 3D реконструкция целых плода кишечника мыши в Уолтон и др., 2012 помог определить структуру ворсинок вырост 2. Здесь мы опишем всю систему органной культуре, которая позволяет экс естественных развитие ворсинок и расширений этой системы культуры, чтобы позволитькишечник, чтобы быть трехмерно отображаемого в процессе их развития.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши были обработаны гуманно, используя протоколы, утвержденные Мичиганского университета Медицинской школы Unit лабораторных животных медицины и в соответствии с руководящими принципами Комитета университета по использованию и уходу за животными.
1 целая система Органная культура
- Подготовка информации и культуры пластин
- В капюшоне культуры ткани, удалить 5 мл BGJb СМИ с фондового бутылки и добавляют 5 мл пен / стреп. Подготовьте рабочую запас СМИ в 50 мл коническую трубку, путем добавления 1 мл 5 мг / мл аскорбиновой кислоты в 49 мл BGJb СМИ (с пен / стреп).
- Подготовка культуры пластины 6 также путем добавления 1 мл под каждой из transwells.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все 6 transwells не используются, двигаться дополнительные transwells в свежем стерильной 6-луночного планшета для последующего использования. Добавить 3 мл рабочего BGJb СМИ, чтобы каждый из трех 10 см стерильные чашки Петри.
- Подготовка для вскрытия
- Замочите рассекает инструменты в 70% этанольннол и не забудьте сохранить инструменты чистыми во время работы.
- Настройте рассекает центр с большим ведром льда и поместите культуры пластину 6 а и 10 см чашки Петри с BGJb СМИ на льду. Работа на льду, насколько это возможно, а рассечения и подготовки кишечника к культуре.
- Обезболить взрослых самок мышей в камере с изофлуораном (100 мкл) до euthanization смещением шейных позвонков для сбора плода кишечника.
- После сбора плоды от своей матери, поставить друг плод тщательно в соответствии с Theiler постановка диаграмму 13. Не полагайтесь на дней после полового акта, чтобы определить возраст каждого плода как вариаций до 24 часов в стадии развития регулярно наблюдается в пределах одного помета.
- Рассечение плода кишечника
- Усыпить плоды от обезглавливания перед удалением кишечника.
- Рассеките каждый кишечник в 1X Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), а затем PLAв.п. его в 10 см чашку Петри с работы BGJb СМИ.
- Осторожно снимите селезенки из желудка и поджелудочной железы от живота и верхней двенадцатиперстной кишки.
- Аккуратно отделить сальник заботясь, чтобы оставить сальника, прикрепленный как можно больше и разделения соединений только достаточно, чтобы позволить кишечник, чтобы быть выпрямлены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для кишечник старше E14.5 или тех, которые культивировали дольше, чем 24 часов, мягко отделить кишечник на 3 равные части, чтобы обеспечить просвета содержание течь через кишечник и быть исключен из обрезанными концами. Тем не менее, для культур начала до E13.5, ждать, пока после 24 ч культивирования перед отделением 3 сегменты кишечника, чтобы позволить серозной расти должным образом по всей длине кишечника. - Используйте рот пипеткой перенести кишечную штук на transwells культуральной пластины (1.1.2).
- Осторожно переместить кишечник по мере необходимости так, что они прямо через transwelл.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как кишечник начинают двигаться просвета содержимое через трубку, либо перегибы в кишечнике вызовет резервного копирования и повреждения кишечника.
- Культура и лечение
- Выньте материал из под Transwell, добавить 700 мкл лечения СМИ (Рабочая среда с добавлением рекомбинантных белков или фармакологических ингибиторов) под Transwell.
- Добавить 300 мкл лечение СМИ каплям сверху кишечнике и дайте ему впитаться через Transwell. Повторно кишечник по мере необходимости.
- Изменение обработки медиа по крайней мере, один раз в день или чаще, в зависимости от периода полураспада реагента лечения.
- Подготовка белковых замачивают агарозы для локализованного источника лечения реагента
- Ресуспендируют агарозном бисером в их контейнере для хранения и передачи 100 мкл агарозы в 1,5 мл пробирке.
- Заполните оставшееся объем трубки стерильной 1x Phosphate-солевой буфер (PBS) и смешать шарики, чтобы вымыть их. Поместите пробирке в стойку в течение нескольких минут, чтобы позволить шарики оседают на дно, а затем пипеткой от PBS от сверху бисером. Заполните пробирке стерильным 1x PBS и повторить процесс стирки в два раза больше.
- Подготовьте интерес белок в два раза больше требуемой концентрации для лечения.
- Смешайте 5 мкл промытых агарозы с 5 мкл белка складе 2x и аккуратно перемешивать шарики в белке. Поместите пробирку на льду в течение 1 ч, перемешивание аккуратно каждые 10-15 минут.
- Промыть бусы кратко в стерильной 1x PBS до размещения бусинки на кишечнике.
- Размещение агарозы
- Аккуратно поместить агарозном бисером в верхней части кишечника с помощью пипетки с рот тянут капиллярных игл. Поместите шарики с особой осторожностью, так как небрежное обращение может привести к повреждению кишечника и предотвратить развитие ворсинок в травмированной области.
- Поместите в два раза больше бусины, которые необходимы для анализа, так как кишечник будет пройти перистальтических движений и около половины шариков, помещенных сойдет кишечника за время культивирования.
- Фиксация культивируемых кишечника
- Осторожно снимите лечения СМИ снизу Transwell и позволяют кишечник высохнуть на воздухе в течение 3 мин.
- Добавить 1 мл фиксатора под Transwell в течение 2 мин, затем покрыть верхнюю часть кишечника с 2 мл фиксатора на оставшуюся часть времени фиксации. Закрепить 4% параформальдегидом O / N при 4 ° С или в течение 2 ч при комнатной температуре.
2 Визуализация основных кишок
- Wholemount изображений
- Поместите целые кишечник (с эндогенной флуоресценции) на слайде с 100 мкл 1х DPBS. Используйте пинцет, чтобы аккуратно организовать кишечник.
- Используйте лаборатории ткань осторожно снимите DPBS и сразу добавить 100 мкл 70% глицерина, чтобы сделать ткани моповторно прозрачным и увеличить возможную глубину изображения.
Примечание: Если дальнейшее проникновение кишечника желательно, вместо монтажа в кишечник в 70% глицерине, замочить в кишечник в течение нескольких капель раствора фокусировки Ясно в течение 10-30 мин. Внесите от решения Фокус Ясно и смонтировать кишечник с горы дожди. - Опустите каждый из четырех углов покровного в пластилина и забрать небольшое количество глины для использования в качестве прокладок между горкой и покровного держать покровное от уплощение кишечник.
- Печать покровное на слайд с растопленным VALAP прикладной ватным тампоном.
- Изображение кишечник по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для более подробной информации.
- Vibratome секционирования основных кишечника (для поперечного сечения зрения кишечных структур)
- Код для вставки кишечник в 7% агарозы в небольших пластиковых форм (10 х 10 х 15 мм) и позволить агарозные блоки востыть и затвердеть.
- Удалить агарозные блоки из пластиковых форм и клей агарозные блоков в стадии сбора vibratome с мгновенным клеем.
- Заполните этап сбора ледяной 1x DPBS.
- Сокращение секции при толщине между 100-150 мкм. Для более толстые участки использовать клиринговые решения (описанный в разделе 2.1.2), чтобы визуализировать глубже в поперечном сечении.
- Налейте vibratome секции от стадии сбора в лунку 6-луночного планшета для хранения при 4 ° С.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных, vibratome секционного тканей
- Поместите 5-12 vibratome секции на лунку в 24-луночный планшет с 1x DPBS.
- Удалить 1x DPBS и добавить 500 мкл пермеабилизации решения на лунку. Осторожно образцы в течение 25 мин при комнатной температуре.
- После проницаемости, мыть образцы 3 раза 1x PBS.
- Блок образцы, по крайней мере 30 минут в 500 мкл блокирующего раствора.
- После блокировки, еXCHANGE блокирующий раствор с 500 мкл первичных антител разводят в блокирующем растворе и поддерживать образцов при 4 ° CO / N.
ПРИМЕЧАНИЕ: разведения первичных антител, которые хорошо работают на замороженных и парафиновых срезах как правило, работают хорошо на vibratome секций тоже, однако антитела требуя извлечение ядерного антигена как правило, не работают хорошо с этим протоколом (например, BrdU). - На следующий день, мыть образцы 3 раза в течение 15 мин каждый раз с блокирующим раствором.
- После промывки применяют 500 мкл вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе. Оберните пластину 24-а в алюминиевую фольгу для защиты флуорофоры от света и рок образцы в течение 45 мин до 2 ч при комнатной температуре.
- Вымойте образцы 3 раза 1x PBS в течение 15 мин каждого и смонтировать vibratome разделы на слайдах, как описано в разделе 2.4.
- Монтаж vibratome разделы
- Подготовить слайды для vibratome монтажа за счет сокращения тонкие ломтики дважды ИПППск ленты и размещение их вдоль длинных сторон слайдов.
- Осторожно поместите 5-10 vibratome разделы между двойной палки лентой на слайдах в капле 100 мкл 1x PBS.
- Открываются все разделы и разложил их в один слой по стеклу.
- Удалите излишки агарозы или неровные кусочки, которые препятствовали бы покровное от сидения плоским.
- Осторожно использовать лабораторную ткани, чтобы впитать лишнюю 1x PBS со всего секциях vibratome.
- Добавить каплю водной среде монтажа на верхней части секций vibratome а затем покровное.
- Печать покровные на слайдах с растаял VALAP применяется с помощью ватного тампона.
- Изображение в vibratome разделы по обе вертикальном или перевернутом конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к дискуссии для получения более подробной информации по выбору системы формирования изображения.
3 Живая съемка Whole кишок
Кишечник собирают из fetuseс после E12.5, с подключенный сальник остаются нетронутыми, успешно развиваться ворсинки в культуре с использованием вышеуказанного систему. Таким образом, этот экс виво система допускает захват живых Z-секции изображений развивающихся кишечника, которые могут быть восстановлены для трехмерного зрения морфогенеза с течением времени.
- Настройка живого изображения
- Используйте мгновенный клей придерживаться индивидуального поликарбоната мембраны к экрану мелкой сеткой. Это обеспечивает поддержку эшафот провести кишечник в месте ниже погружения хрусталика вертикальном конфокальной микроскопии. Пожалуйста, обратитесь к разделу обсуждения для получения более подробной информации по выбору живых микроскопов изображений.
- Поместите сито в центре лунку планшета для культуры.
- Поместите расчлененный кишечник на поликарбонатную мембрану и добавить каплю моментального клея на обоих концах. Используйте только достаточно клея, чтобы прикрепить кишечник, но не пальто это!
- Добавить питательных сред бесплатно из фенола красного ниже поликарбонатаМембрана в центре скважины из культурального планшета.
- Добавьте воду к внешнему краю пластины культуры, чтобы обеспечить влажность.
- Поскольку плода кишечник подвергается перистальтический-как волны сжатия в культуре, добавить 100 мкл 1: 5 решения ксилазина в 1x PBS до 3 мл СМИ контролировать движение кишечника то время визуализации. Эта доза будет контролировать кишечных движений для около 8-10 часов без ущерба для развития ворсин.
- Для поперечной зрения кишечника, вставлять живые кишечник в 3-4% раствором агарозы и сократить толстые секции (150-500 мкм) на vibratome. Подходим жесткость агарозы с жесткостью кишечника сокращаются и эмпирически определили этап развития. Как правило, 3% раствор агарозы хорошо работает для кишечника в возрасте до E14.5 и 4% раствор хорошо работает для кишечника E15-E16.
- Клей vibratome разделы на поликарбонатную мембрану, проставленный на сито (как в разделе 3.1.1) икультура, как описано в разделе 3.1.2-3.1.6.
- Проведите живого изображения с использованием двухфотонного конфокальной флуоресцентной микроскопии (лазерный возбуждения между 690-1,040 нм) на вертикальном стенде с перестраиваемой таблице.
- Двухфотонное лазер настроен на 900 нм обеспечивает глубокое проникновение с наилучшим разрешением для GFP сигналов. Это уменьшает повреждение тканей во время визуализации. Кроме того, установив мощность лазера до минимально возможного выброса уменьшает повреждение тканей. Как правило, чтобы получить хороший возбуждение GFP, использовать 12% мощности на двухфотонного лазера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Культура целых эксплантатах плода кишечника позволяет анализов расположения, распределения и продолжительности сигнальных молекул, которые координируют кишечного развитие, так как эта система позволяет манипулировать сигнализации с фармакологических реагентов или рекомбинантных белков. Система Transwell культуры (Фигура 1А, воспроизводятся с Walton и соавт., 2012) 2 обеспечивает интерфейс воздуха и жидкости, что позволяет разместить лекарственно или белок пропитанные шарики агарозы на ткани и тем самым создать местные источники сигналов (фиг.1В ). Кишечник, полученные из эмбрионов на E10 до E18.5 выжить в культуре на transwells и пройти перистальтический-как волны движения. Кишечник начал в культуре от E13.5 выжить примерно 10 дней или примерно в P3, стадии развития мыши, когда склеп образование сначала наблюдается. Хотя ранние стадии кишечник выжить в культуре, кишечник собирают доE12.5 не возникают ворсинки надежно, вероятно, потому, что серозной не вырос, чтобы полностью покрыть кишечник к этому времени. Мезенхимальные кластеры формируются и ворсинки начинают появляться и удлинить в кишечнике начал в культуре на E12.5, E13.5 или E14.5, хотя развитие слегка задерживается по сравнению с некультурных, сценических из контрольной (рис.1, воспроизведенных из Уолтон др др., 2012) 2. Независимо от стадии кишечника в начале культуры (E12.5-E14.5), кишечник всегда появляется имеют приблизительное задержки 24 часов. E14 кишечника, выращенные в культуре в течение двух дней показать рост ворсинок, которые более сходны с E15 кишечника, чем ворсинок кишечника E16, выращенных в матке (рисунок 1С-F) 2.
Закономерность мезенхимальных кластеров раскрывается трехмерной реконструкции оптических секций целого PDGFRα GFP / + кишечника у E15.5 (рис 2 </ Сильная>, воспроизводятся с Walton и соавт., 2012) 2. Это изображение состоит из Z-стеки 54 полей зрения, которые были сшиты вместе с помощью программного обеспечения Leica LAS-AF. Каждое пятно внутри кишки является мезенхимальных кластер визуализировали ядерной меткой GFP выраженной от PDGFRα локуса 14. Высокое разрешение изображения позволяет зрителю увеличение для некоторых областях изучить детали, но обеспечивает в глубины пространственных отношений, которые не могут быть почерпнутые из отдельных полей зрения или меньшем увеличении мощности. Movie 1 серия пошагового сшитой г -stack изображения, которые 3D реконструкция на рисунке 2. Отдельные оптические разделы позволяют для дальнейшего визуализации деталей, таких как отдельных клеток в кластерах.
Оптические разделы Wholemount иммунофлюоресценции кишечной сосудистой с PECAM антител (BD Pharmingen 557355; разбавленные 1: 1000) были получены с помощью двухфотонного возбуждения и разведкуПостроенное с программным обеспечением Imaris (Рисунок 3). Этот трехмерный вид кишечной кровеносных сосудов показывает сложную сеть сосудов, которые не могут быть в полной мере оценены с помощью тонких секции препаратов. Фильм 2, вращающейся трехмерной проекции восстановленного изображения на рисунке 3, обеспечивает дальнейшее понимание того, как увеличение объема информации по предоставленной трехмерной реконструкции может улучшить понимание структурной паттерна.
Vibratome секционирования позволяет трехмерной просмотра кишечника от поперечной Vantage. На рисунке 4, отношения развивающихся кластеров (отмечены PDGFRα GFP / +) 14 с эпителия и окружающей мезенхимы (отмечены мембраны Помидор (Rosa26 мТл / мг) 15 наблюдается.
С другой стороны, эти отношения могут быть просмотрены антител immunofluoreСЦЕНА окрашивание (фиг.5) из мезенхимальных кластеров (зеленый, помечены с анти-PDGFRα (Santacruz C-20; разводили 1: 200)) с эпителием (красный, помечены с анти-Ecadherin (BD Transduction Labs 610181; 1: 1000 разведение).
Вся эта система органов культуры также может быть расширена, чтобы обеспечить двухфотонного визуализации развития плода кишечник. В этой установке, плода кишки приклеивается к поликарбонатную мембрану поддержке сито в большую культуру пластину (Рисунок 6). Чем больше размер лунку планшета для культуры позволяет конфокальной микроскопии линзы связаться кишечник внутри хорошо.
Рисунок 1. Развитие целых кишечника плода в системе Transwell культуры. () Плода кишечник, размещенные на Transwell мембран в культуральной пластины 6 а с BGJb СМИ. Лучшие две кишечник E12.5, два нижних кишечник E13.0. (B) бычий сывороточный альбумин замачивают агарозные гранулы (светлее синего), размещенные на двенадцатиперстной кишки в системе Transwell культуры. Чем темнее синий пятно X-гал окрашивание Ptc LacZ / + в Hedgehog репортер мыши линии разметки мезенхимальных кластеров 16. (CF) Сечения свежесобранном E14.0 (C), E15.0 (D) и E16. 0 (E), двенадцатиперстной ткани окрашивали Е-кадгерином (зеленый) и DAPI (синий). В E14.0, unremodeled эпителий еще Многорядный, в то время как E15.0 и E16.0, зарождающиеся ворсинки видны. (F), кишечного сегмента идентичен тому, которое наблюдалось в (С), но культивировали в течение двух дней (E14 + 2дня) показывает, что ворсинки развиваться в культуре, хотя с небольшой задержкой. Панели (CF) перепечатаны с Уолтон соавт., 2012 2 вир>. Масштабные линейки являются 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 Трехмерная реконструкция скреплены областях Z-стеки от E15.5 Wholemount PDGFRα EGFP / + кишечник. Изображение является частичная реконструкция (пять 1 мкм разделы от центра 65 Z-секций) от 54 прошитых полей зрения получены с помощью моторизованного этап конфокальной микроскопии LeicaSP5X на перевернутой DMI 6000 стенд с лазерной двухфотонного возбуждения при 900 нм. Программное обеспечение Leica LAS-AF сшитые Z-стеки вместе, чтобы сформировать все изображение. Масштабной линейки 1 мм.
н "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51817 / 51817fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3 Трехмерная реконструкция оптических разделов с указанием Wholemount анти-PECAM иммунофлюоресценции кишечной сосудистой в двенадцатиперстную кишку E14. Оптические срезы, снятые на LeicaSP5X конфокальной микроскопии на вертикальном DMI 6000 стенд с двухфотонного возбуждения при 900 нм и трех- размерно реконструирован с использованием программного обеспечения Imaris 7.6.1. Масштабной линейки 200 мкм.
Фигура 4 Конфокальные образы vibratome секционного E15.5 PDGFRα EGFP / +; Rosa26 mTmG тощей кишки показывая тесную связь из / + клеток PDGFRα EGFP мезенхимальных кластеров (зеленый) с их вышележащих эпителия и окружающих мезенхиму (красный; мембрана Томатный от Rosa26 mTmG). < / Сильный> масштабные линейки являются 50 мкм в верхних панелей и 25 мкм в нижних панелей.
Рис.5 Трехмерные реконструкции конфокальных изображений от E15.5 vibratome срезы кишечника, которые были антитела иммунофлюоресценции пятнами. Масштабной линейки 50 мкм.
Рисунок 6. Адаптация системы культуры Transwell для 2-фотона живого изображения. (А) меш помещают в чашку для культивирования. (В) поликарбонатную мембрану приклеен к сито. (C) Кишечник приклеены к поликарбонатную мембрану, и культивировали с фенолом, свободной DMEM средств массовой информации.
Фильм 2 Вращающийся ролик, показывающий трехмерную реконструкцию оптических секций РЕСАМ окрашенных сосудистой в двенадцатиперстной кишке E14 на рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Динамичный характер и сложные ткани взаимодействия развивающегося кишечника требуется 3D визуализацию, чтобы иметь полную оценку этих морфогенетических событий. С развивается технология визуализации, способность изучать ворсинок морфогенез подробно разрабатывает / улучшение и с ним, понимание пространственной общения и взаимодействия во время органогенеза значительно усиливается.
Альтернативные методы культивирования целые кишечник также были протестированы, но система Transwell остается наиболее надежным для более длительного времени культуры и для поддержания нормального кластера и ворсинок кучность. Трехмерная культуры системы (Matrigel или коллаген) хорошо работать в течение коротких периодов культуры (менее 24 ч) младших кишечника (E12.5-E15.5), но как только кишечник начинают переживает перистальтический подобных движений и секреции ферментов и отходы в просвет, трехмерные субстраты не держит хорошо. Кишечник в жидкой культурыс также будет развиваться, однако, отсутствие поддержки или ведения ориентации в свободно плавающего культуры, кажется, изменяют нормальную структуру кластеров и ворсинок. Таким образом, система Transwell является предпочтительным для изучения кластера кучность и ворсинок возникновение и разрастание.
Другой способ Wholemount живого изображения с менее строгими настроить заключается в использовании minutien флажки для прикрепления плода кишечник, чтобы тонкий слой 7% агарозы в нижней части 35 х 10 мм пластины. Хотя этот метод проще в настройке, обратите внимание, что его использование ограничивается молодых стадий (E12.5-E15.5) или в течение более короткого времени культивирования с матригель не будет проводить до кишечных выделений.
Для приготовления культуру, живущую, залить достаточно растопленное 7% агарозы просто покрыть дно 35 х 10 мм пластины. Поместите стекло капиллярную трубку в центре агарозы, пока она еще податливым. После агарозном укрепил, снять стеклянный капилляр и поместите тон плода кишечник вдоль скважины создан капилляра. Заполните капилляр и с Матригель, чтобы окружать кишечник и не размещать антенну культуры при 37 ° С до тех пор, наборов Матригель. Добавить фенол красный без DMEM культуральной среды осторожно. Поместите мм пластины 35 х 10 внутри мм пластины 60 х 15 и заполнить 60 мм пластины с водой, чтобы создать влажную камеру.
Выбор монтажного метода (Wholemount или vibratome) для живого изображения основан на желаемой ориентации области, чтобы быть визуализированы. Например, для просмотра изменений в эпителиальных формы клеток, Z-стеки через wholemounted кишечника обеспечит вид на апикальной и базальной поверхностей. Для просмотра interkinetic ядерного миграцию эпителиальных клеток в эпителиальных листа, vibratome участки позволяют конец на (поперечной) зрения для наблюдения за апикальных и базальных поверхностей.
Подготовка образцов имеет решающее значение получают лучшие результаты обработки изображений. При использовании vibratome разделый стандарт конфокальной микроскопии, хорошее разрешение может быть достигнуто до глубины 75 мкм без клиринговой реагента. В настоящее время, очистка реагент для живых образцов не было выявлено так глубина визуализации ограничена. При фиксированных образцов, использование расчетной реагента может значительно улучшить глубину изображения. Очистное реагент нашли, чтобы обеспечить лучшее морфологию и резолюция Фокус Ясно 17. Через 30 мин очистки в фокусе ясной и монтажа в горе ясной, вся глубина всех этапах эмбрионального кишечника могут быть отображены с отличным разрешением. Менее дорогой альтернативой является очистка 70% глицерина, однако максимальная глубина проникновения в эмбриональных тканях 150 m, после чего разрешение и интенсивность сигнала теряется.
Важно отметить, что сигналы наиболее определены в образцах, которые установлены и отображенных в тот же день окрашивание было закончено. Монтаж с сигналом сохраняя водный монтажной среды (таких как Продлить золото анти-увядает решение (Life Technologies P36930) действительно помогает с сохранением сигнал, но только на короткое время; наиболее яркие изображения всегда получаются непосредственно после окрашивания и монтажа образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2 pairs |
| 70% Ethanol | |||
| 1x sterile Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14040-133 | 500 ml |
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| 24 well plates | Costar | 3524 | |
| 60 x 15 mm petri dishes | Falcon | 451007 | |
| Transwell plates, 24 mm inserts, 8.0 mm polycarbonate membranes | Corning Costar | 3428 | 6 inserts per plate |
| BGJb media | Invitrogen | 12591-038 | 500 ml |
| PenStrep (10,000U/ml Penicillin; 10,000 mg/ml Streptomycin) | Gibco | 15140 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A0278 | make 5 mg/ml stock, filter, aliquot and store at -20 °C |
| Mouth pipet (Drummond 1-15 inch aspirator tube assembly) | Fisher | 21-180-10 | remove the aspirator assembly and replace it with a 1,000 µl pipet tip which acts as an adaptor to plug in a 6 inch glass Pasteur pipet. |
| 6 inch glass pasteur pipets | |||
| Capillary Tubes | World Precision Instruments | TW100F-4 | pull to needles |
| 4% Paraformaldehyde | made in 1 x PBS, pH to 7.3 | ||
| Culture plates | Falcon | 353037 | |
| Fine mesh stainless steel screen | purchase at hardware store | ||
| Polycarbonate membranes | Thomas scientific | 4663H25 | alternatively, cut Corning Costar 3428 membranes off of transwell supports |
| Instant glue | purchase at hardware store | gel based preferrably | |
| 35 x 10 mm plates | Falcon | 351008 | |
| 7% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| minutien pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Phenol red free media (DMEM) | Gibco | 21063-029 | |
| Xylazine (100 mg/ml) | AnaSed | 139-236 | |
| Matrigel | BD | 356231 | basement membrane matrix, growth factor reduced, phenol red-free |
| 3-4% agarose | Sigma | A9414 | prepare w/v in 1x DPBS, heating to dissolve in a waterbath |
| Imaging of fixed intestines | |||
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| vaseline | purchase at pharmacy | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin | |
| lanolin | Sigma | L7387 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| paraffin | Surgipath | 39601006 | used to make VALAP: equal parts vaseline, lanolin, paraffin |
| 70% glycerol in 1 x PBS | |||
| Focus clear and Mount Clear | CelExplorer Labs Co. | F101-KIT | |
| Modeling clay | purchase at art supply store | ||
| double stick tape | |||
| cotton applicator swabs | |||
| plastic molds, 10mm x 10mm x 5 mm) | Tissue Tek | 4565 | |
| slides | |||
| coverslips | |||
| lab wipe | Kimberly Clark | 34155 | lint free delicate task wipe |
| Theiler staging chart | http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ downloads/theiler2.pdf | ||
| Leica SP5X confocal microscope | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Leica DMI 6000 stand | Leica | Used to conduct the live imaging | |
| Aqueous mounting medium (Prolong Gold) | Molecular Probes | P36930 | |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 24 well plate | Costar | 3524 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | used to make Permeabilization solution: 0.5% Triton X-100 in 1 x PBS |
| Goat serum | used to make Blocking Solution: 4% Goat serum, 0.1% Tween20 in 1x PBS | ||
| Tween20 | Sigma | P9416 |
References
- Grosse, A. S., et al. Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis. Development. 138, 4423-4432 (2011).
- Walton, K. D., et al. Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Vertebrate endoderm development. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).
- Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse. Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).
- Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. Morphogenesis of fetal rat duodenal villi. Am J Anat. 146, 73-92 (1976).
- Burns, R. C., et al. Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse. Dev Biol. 265, 61-74 (2004).
- Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development. Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).
- Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine. Development. 126, 2215-2225 (1999).
- Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation. Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).
- Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine. J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).
- Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis. Development. 127, 3457-3466 (2000).
- Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract. Development. 137, 1721-1729 (2010).
- Theiler, K. The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age. , 2, Springer-Verlag. (1989).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Fu, Y. Y., et al. Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution. Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).
