Introduction
Anche se ci sono molti metodi ampiamente utilizzati per la generazione di moderata-grave trauma cranico (TBI), sono state sviluppate poche tecniche per indurre lievi, chiuso ferite alla testa nei roditori. A causa del fatto che il trauma cranico lieve (mTBI) è tre volte più comune di lesione cerebrale moderata e grave combinata 1, è necessario un modello affidabile di mTBI per facilitare la ricerca in materia di fisiopatologia, risultati neurobiologici e comportamentali, e strategie terapeutiche. Ad esempio, gli studi clinici di droga in parte a causa dei limiti di modelli animali attuali 2, negli ultimi dieci anni ci sono stati più di 200 non riusciti per il trattamento di TBI 3. Quando i sistemi di modellazione sono generati per studi di ricerca traslazionale, l'applicabilità dei risultati dipendono dalla validità del modello implementato. Per lo studio della mTBI / sbattimento, un modello animale affidabile non solo imitare il forze biomeccanico responbile per lesioni eziologia, ma potrebbe anche indurre sintomi compatibili con quelli riportati dalla popolazione clinicamente rilevante. Inoltre, perché i bambini sono a rischio particolarmente elevato per mTBI, sistemi di modellazione ottimale sarebbe applicabile ai roditori giovani e giovanili, oltre ai loro equivalenti adulti.
Analisi biomeccaniche di circostanze in cui gli atleti hanno sostenuto mTBIs o lesioni cerebrali concussive indicano che i fattori predittivi più critici per infortunio sono accelerazioni testa rapidi e impatti ad alta velocità 4. La maggior parte dei modelli di roditori attualmente utilizzati per l'induzione di TBI permette poco o nessun movimento della testa 5 (per una rassegna vedi 2). Il modello qui delineato, fornisce un impatto ad alta velocità alla testa di un ratto giovanile fisicamente incontrollato che è accompagnata da una rotazione di 180 ° e caduta libera che applica forze di accelerazione / decelerazione di testa e corpo del soggetto. Tqui sono due vantaggi principali di questa tecnica di peso goccia modificato per l'induzione di mTBI. In primo luogo, il modello produce concussive clinicamente rilevante come sintomatologia senza causare alcun danno evidente al cervello (per la descrizione completa dei risultati comportamentali vedi 6). Coerente anche con i rapporti clinici di sindrome post-concussive, questa tecnica di peso-drop modificato produce risultati eterogenei. Anche se gli effetti della mTBI sono significativi, vi è una sostanziale differenza tra i roditori che hanno subito un mTBI se esaminato su più misure di outcome. In secondo luogo, il metodo consente lo studio di mTBI ripetitivo 7. Poiché la maggior parte dei modelli TBI esistenti infliggere tali lesioni gravi, è spesso difficile indurre una seconda ferita, e quasi impossibile studiare TBI ripetitivo senza danni estesi a tutta la corteccia.
Pertanto, la logica principale per utilizzare la tecnica del peso goccia modificato per l'induction di mTBI è quello di produrre una ferita che rappresenta più da vicino la fisiopatologia e la sintomatologia di concussione e ripetitivo TBI nelle popolazioni giovanili. Con la crescente incidenza di mTBI legati allo sport, cadute, e incidenti automobilistici, soprattutto durante l'infanzia, questo modello roditore unico di mTBI fornisce ai ricercatori uno strumento prezioso per lo studio delle lesioni cerebrali concussive-like che può essere facilmente applicato a multiple-hit paradigmi.
Protocol
NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Consiglio canadese della cura degli animali e sono stati approvati dalla University of Calgary, per animali Comitato Etico.
1. Allevamento e preparazione degli animali
- Ordinare ratte gravide di fornitori di animali da laboratorio standard o cuccioli di razza in casa secondo protocolli di allevamento standard.
- Casa tutti gli animali con ad libitum accesso a cibo e acqua, in un topo stanza contenitore a temperatura controllata (21 ° C), che è mantenuto su una luce 12:12 hr: ciclo scuro.
- Quando cuccioli raggiungono postnatale giorno 21 (P21), svezzare i cuccioli dalle loro madri e casa in gruppi dello stesso sesso di 3 o 4.
2. Set-up di Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) Apparecchi
- Prima dell'inizio della procedura, pesi mulino alla massa desiderato (ad esempio 150 g). Saldamente allegare un anello di metallo all'estremità superiore del peso consente al filo da pesca di essere fisso al peso.
- Punteggio stagnola con una lametta affilata. Assicurarsi che la carta stagnola segnato sostiene il peso corporeo del ratto ma non interferirà con l'accelerazione del ratto seguente impatto della testa con il peso.
- Nastro il stagnola ottenuto alla fase U in plastica trasparente (38 x 27 x 27 cm 3) che contiene una spugna di raccolta (38 x 25 x 15 cm 3) (Figura 1), in modo che sia teso.
- Posizionare la fase di plastica a forma di U nella posizione corretta sotto il tubo di guida in plastica trasparente.
- Tenere il tubo di guida di plastica (2,2 cm di diametro x 1,5 m) in posizione con uno stand morsetto e posizionare il tubo di guida in modo che è di 3,5 cm sopra la stagnola segnato.
- Fissare la lenza attraverso l'anello metallico al peso garantire che il fondo del peso pende liberamente 2,5 centimetri sopra la stagnola segnato.
- Collegare saldamente la linea di pesca al supporto pinza.
NOTA: Tethering il peso per la vongolabasamento p ad una altezza di 2,5 cm sopra la stagnola impedisce re-colpi mentre il ratto sta cadendo dall'impatto alla spugna di raccolta). - Tirare il peso attraverso il tubo di guida di plastica con la lenza e tenerlo in posizione con un perno chiave esagonale a 1,0 m.
3. induzione di mTBI
- Quando i ratti raggiungono P30 spostamento gabbie nella stanza procedurale.
- Inserire ratti in una camera isoflurano e leggermente anestetizzare il ratto finché non è sensibile ad una zampa o la coda pinch.
- Introdurre rapidamente il ratto petto in giù sul stagnola segnato con la testa direttamente nel percorso del peso cadente. Vedere la Figura 2. Se il topo comincia a muoversi o wake-up prima di poter essere immesso sul stagnola segnato, tornare alla camera di isoflurano fino che non risponde a una zampa o la coda pizzico e ricominciare.
- Estrarre il perno chiave a brugola, permettendo il peso cadere verticalmente attraverso il tubo di guida plastica e colpire il topo sulla testa. The ratto rapidamente subire una rotazione di 180 ° e la terra in posizione supina.
- Rimuovere immediatamente il ratto dalla spugna di raccolta e applicare lidocaina topica alla testa del ratto con un applicatore con punta di cotone.
- Posizionare il ratto in posizione supina in una gabbia pulita che viene riscaldata impostando su di una piastra elettrica disponibile in commercio.
- Utilizzando un cronometro o timer digitale acquisire il "time-to-destra". Time-to-destra è il tempo impiegato per il ratto di svegliarsi dall'anestesia e capovolgere dalla posizione supina alla posizione prona o iniziare a camminare.
- Ritorna il ratto della sua casa-gabbia dopo aver recuperato un comportamento normale (grooming, camminare, esplorare, etc.).
- Ripetere i passaggi 3,2-3,8 per ogni ratto supplementare che richiede un mTBI.
- Ripetere la procedura sulla stessa ratto a diversi intervalli di tempo per gli esperimenti mTBI ripetitive.
4. Induzione della Sham Injury
- Leggermente Anesthetize il ratto con isoflurano fino a quando è non risponde ad una zampa o la coda pizzico.
- Introdurre rapidamente il ratto petto in giù sul stagnola segnato con la testa direttamente nel percorso del peso cadente.
- Rimuovere il ratto dal stagnola senza tirare il perno brugola dal tubo di guida in plastica e applicare lidocaina topica alla testa del ratto con un applicatore con punta di cotone.
- Posizionare il ratto in posizione supina in una gabbia pulita che viene riscaldata impostando su di una piastra elettrica disponibile in commercio.
- Utilizzare un cronometro o timer digitale per acquisire il "time-to-destra".
- Ritorna il ratto della sua casa-gabbia dopo aver recuperato un comportamento normale (grooming, camminare, esplorare, etc.).
5. Verifica dei mTBI con il Walking Beam Test 8
- 24 ore dopo l'induzione del mTBI o animali sham ritorno pregiudizio alla camera procedurale.
- Trasferire i ratti in una gabbia tenuta pulitae posizionare home-gabbia del ratto a fine stretta dei 165 centimetri rastremate raggio in modo che la porzione aperta della casa gabbia affacciantesi all'estremità più stretta del fascio.
NOTA: Il fascio conico è lunga 165 centimetri. La piattaforma centro del fascio ha una larghezza di 6 cm in estremità larga e 1,75 cm in estremità stretta. Il fascio di centro ha sporgenze (2 cm di larghezza e 2 cm sotto la trave centrale) che forniscono la sicurezza quando scivola il piede del ratto. Posizionare imbottitura in schiuma sotto il fascio per ridurre il rischio di lesioni ai ratti che potrebbe cadere il fascio durante la prova. - Inserire una videocamera alla estremità larga del fascio e la posizione rastremato / immagine videocamera per assicurare che il ricercatore guardando il video può chiaramente vedere i movimenti di ratto per l'intera lunghezza della trave rastremata.
- Posizionare il topo alla larga del fascio conico e incoraggiarla a attraversare il raggio della sua casa-gabbia. Una volta che il topo attraversa il fascio conico, lasciare il ratto nella sua casa-gabbia per almeno 60 sec a reinForce il percorso di destinazione. Questo è Trial # 1 e non inclusi nell'analisi.
- Accendere la videocamera e permette al topo per completare l'operazione fascio-walking 4 volte supplementari (mantenendo i periodi di rinforzo 60 sec nella gabbia di casa). Una volta che il topo ha completato tutte le prove, ritorno il ratto alla sua casa-gabbia.
- A segnare, registrare il numero di posteriori della gamba piede-scivola che si verificano e il tempo / tempo di attraversare il fascio, per ogni singola prova. Utilizzare questi dati per calcolare il numero medio di gambe posteriori piede scivola e tempo di attraversare il fascio per ciascun ratto.
Representative Results
La tecnica di peso-drop modificato sopra descritto è un metodo affidabile per l'induzione di lieve trauma cranico (mTBI) in ratti giovani. Utilizzando un peso di 150 g impatto, questa tecnica è stata applicata con successo per ratti giovani che vanno 50-120 g. Inoltre, la procedura può essere facilmente ripetuta negli stessi animali per lo studio di mTBI ripetitivo. Anche se gli animali che l'esperienza di una singola esposizione mTBI un aumento del time-to-destra (figura 3) e sembrano storditi al risveglio, hanno rapidamente riprendere le attività normali e sono visivamente indistinguibili da animali sham-feriti. Dato che la lesione è lieve, lidocaina topica che elimina qualsiasi dolore associato con l'impatto un'occhiata, è l'unico analgesico desiderato. Questo è importante per la ricerca come analgesici sono noti per interferire con i processi tipici infiammatori e di recupero. A causa della mancanza di sintomatologia conclamata, il compito trave mobile è un affidabileolo che può essere utilizzato per convalidare l'induzione della mTBI. E 'importante notare che non tutti gli animali che l'esperienza di un mTBI esporranno deficit sul compito fascio piedi, ma come gruppo, ratti giovani con mTBI dimostrano molto più posteriori della gamba piede-scivola rispetto ai ratti giovani con un infortunio alla farsa (Figura 4).
Un'altra caratteristica fondamentale di questa tecnica peso goccia modificata è la mancanza di ritenuta applicata al ratti giovani durante l'induzione lesioni. Fornendo un colpo di striscio alla testa, seguito da una rapida accelerazione rotazionale e decelerazioni, questo modello rappresenta più da vicino le forze biomeccaniche attribuite a mTBI e commozione cerebrale. Quando questa procedura viene applicata a ratti giovani o topi adulti, i tassi di mortalità sono estremamente bassi (7/202 animali giovani ~ tasso di mortalità 3,4%), e la frattura del cranio e l'emorragia intracranica sono eccezionalmente rare 6,7. Inoltre, il modello produce SY clinicamente rilevantimptomology. Roditori Minorenni che hanno subito un solo mTBI dimostrato deficit nei bilanci e motori comportamenti, insieme con deficit nella funzione esecutiva, un aumento dei comportamenti depressivi-like, e alterate interazioni sociali 6,9. Allo stesso modo, topi adulti mostrano anche equilibrio e coordinazione deficit lievi che recuperano con il tempo 7. Infine, induzione di mTBI utilizzando questo modello richiede anestetico minimo e non comporta la preparazione chirurgica o scavare nel cranio. I risultati non sono quindi influenzati da effetti infiammatori o immunologici confondenti innescati dalla chirurgia o anestesia. Inoltre, il tempo di recupero rapida e mancanza di ferite aperte permette l'inizio di paradigmi di test aggiuntivi per attivarsi poco dopo roditori sperimentano l'mTBI.
Figura 1: > C rappresentazione artoon della U fase plastica e raccolta spugna con tutte le dimensioni pertinenti. Una distanza di 10 cm deve essere mantenuta tra la spugna raccolta e all'inizio della fase plastica per assicurare la ratti giovani ha abbastanza tempo per completare la 180 Rotazione °.
Figura 2: (A) rappresentazione fotografica della piattaforma di induzione pregiudizio. Il ratto viene posto giovanile petto in giù sul stagnola segnato modo che la testa è direttamente sotto il peso cadente. (B) Vista laterale della piattaforma di induzione pregiudizio. (C) dimostrazione fotografica del peso utilizzato nell'induzione della mTBI .
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Figura 3: Rappresentazione grafica delle differenze medie di time-to-destra tra ratti giovani che hanno sperimentato un singolo mTBI e ratti giovani che hanno subito un infortunio alla farsa (* p <0,01) ratti che hanno ricevuto una mostra mTBI un significativo aumento del. durata del tempo necessario per alzarsi dalla posizione supina.
Figura 4: Rappresentazione grafica del numero medio di posteriori della gamba piede-scivola esposti sul compito Bilanciere da ratti giovani che ha sperimentato un singolo mTBI e ratti giovani che hanno subito un infortunio alla farsa (* p <0.05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass Weights | Ginsberg Scientific | 7-2500-2 | Need to have metal loop attached to base |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Masking Tape | Commercially available | ||
| U-Shaped Plastic Stand | Constructed by Laboratory | ||
| Clamp Stand | Sigma-Aldrich | Z190357 | |
| Plastic Guide Tube | Could be constructed or purchased at a hardware store | ||
| Fishing Line | Angler 10lb | Purchased from a sporting goods retailer | |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02237518 | Inhalation Anesthetic |
| Topical Lidocaine (30ml) | Astra Zeneca | DIN 0001694 | Xylocaine Jelly 2% |
| Cotton Swabs | Commercially available | ||
| Heating Pad - 3 heat setting | Commercially available | ||
| Stop Watch | Sportline | L303 | Purchased from a sporting goods retailer |
| Video Camera | Sony | HDR-CX260V | |
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house |
| Balance Beam | Constructed by Laboratory |
References
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