Introduction
Selv om det er mange mye brukt metoder for generering av moderat til alvorlig traumatisk hjerneskade (TBI), har svært få teknikker blitt utviklet for å indusere mild, lukket hodeskader i gnagere. På grunn av det faktum at mild traumatisk hjerneskade (mTBI) er tre ganger mer vanlig enn moderat og alvorlig hjerneskade kombinert en, er en pålitelig modell av mTBI nødvendig å legge til rette for forskning om patofysiologien, nevrobiologiske og atferdsmessige utfall, og terapeutiske strategier. For eksempel, delvis på grunn av begrensninger i dagens dyremodeller to, i det siste tiåret har det vært over 200 mislyktes kliniske utprøving av legemidler til behandling av TBI tre. Når modellering systemer er generert for translasjonsforskning forskningsstudier, anvendelsen av funnene er avhengig av gyldigheten av modellen implementert. For studiet av mTBI / hjernerystelse, vil en pålitelig dyremodell ikke bare etterligne den biomekaniske krefter ansvarslig for skade etiologi, men vil også indusere symptomer forenlig med de som er rapportert ved klinisk relevant befolkningen. Videre, fordi barn er spesielt høy risiko for mTBI, ville optimale modellering systemer være aktuelt for unge og unge gnagere, i tillegg til sine voksne ekvivalenter.
Biomekaniske analyser av situasjoner der utøvere har påført mTBIs eller concussive hjerneskader indikerer at de mest kritiske prediktive faktorer for skade er rask hode akselerasjon og høy hastighet konsekvenser fire. Flertallet av gnagermodeller for tiden anvendes for induksjon av TBI tillater liten eller ingen bevegelse av hodet 5 (for oversikt se 2). Modellen skissert her, leverer en høy hastighet innvirkning til hodet på en fysisk uhemmet juvenile rotte som er ledsaget av en 180 ° rotasjon og fritt fall som gjelder akselerasjon / farten senkes til faget hode og kropp. Ther er to hovedfordeler i forbindelse med denne modifiserte vekt slipp for induksjon av mTBI. For det første frembringer modellen klinisk relevant concussive som symptomologi uten å forårsake noen åpenbar skade på hjernen (for fullstendig beskrivelse av atferdsmessige resultater se 6). Også konsistent med kliniske rapporter om post-concussive syndrom, produserer denne modifiserte vekt-slipp teknikk heterogene utfall. Selv om effektene fra mTBI er betydelige, er det stor variasjon mellom gnagere som opplevde en mTBI når undersøkt på flere utfallsmål. For det andre, tillater fremgangsmåten studiet av repeterende mTBI 7. Ettersom de fleste av de eksisterende modeller TBI påføre slike alvorlige skader, er det ofte vanskelig å indusere et andre skader, og nesten umulig å studere repeterende TBI uten omfattende skade på hele cortex.
Derfor er den primære begrunnelsen for anvendelse av den modifiserte vektfallet teknikk for induDette skjer av mTBI er å produsere en skade som nærmere representerer patofysiologien og symptomology av hjernerystelse og repeterende TBI hos unge befolkninger. Med den økende forekomsten av mTBI relatert til idrett, faller, og bil ulykker, spesielt i barndommen, dette unike gnager modell av mTBI gir forskere med et verdifullt verktøy for studiet av concussive-lignende hjerneskade som enkelt kan brukes til flere-hit paradigmer.
Protocol
MERK: Alle forsøkene ble utført i samsvar med den kanadiske Council of Animal Care og ble godkjent av University of Calgary, Animal Care Ethics Committee.
1. Avl og Animal Forberedelse
- Bestille drektige rotter fra standard forsøksdyr leverandører eller rase unger i huset i henhold til standard avl protokoller.
- Huset alle dyr med ad libitum tilgang til mat og vann, i et temperaturkontrollert rotte huset rom (21 ° C), som holdes på en 12:12 timers lys: mørke syklus.
- Når valpene kommer postnatal dag 21 (P21), avvenne valper fra sine mødre og hus i samme kjønn grupper på tre eller fire.
2. Oppsett av Mild traumatisk hjerneskade (mTBI) Apparatus
- Før oppstart av prosedyren, møllen vekter til ønsket masse (f.eks 150 g). Sikkert feste en metallsløyfe til den øverste enden av vekten slik at snøret å være fixed til vekten.
- Resultat aluminiumsfolie med en skarp barberblad. Sikre at mottok aluminiumsfolie støtter kroppsvekt til rotten, men vil ikke interferere med akselerasjon av rotte følgende hodet påvirkning med vekten.
- Tape mottok aluminiumsfolie til den U-formede trinns laget av klar plast (38 x 27 x 27 cm 3) som inneholder en samling svamp (38 x 25 x 15 cm 3) (figur 1), slik at den er stram.
- Plasser den U-formede plast fasen i korrekt stilling under føringsrøret er laget av klar plast.
- Hold plastføringsrøret (2,2 cm diameter x 1,5 m) på plass med en klemme stativ og posisjonere føringsrøret, slik at den er på 3,5 cm over et innlegg aluminiumsfolie.
- Feste snøret gjennom metallsløyfen til vekten sikrer at bunnen av vekten henger fritt 2,5 cm over mottok aluminiumsfolie.
- Sikkert feste snøret til klemmen stand.
MERK: tjore vekt på muslingp stand på en høyde på 2,5 cm over aluminiumsfolie hindrer re-treff mens rotta faller fra virkningen til samlingen svamp). - Trekk vekten opp gjennom plasten styrerøret med fiskesnøre og hold det på plass med en unbrakonøkkel pin på 1,0 m.
3. Induksjon av mTBI
- Når rotter nå P30 flytte bur inn i saksbehandlings rom.
- Plassere rottene i et kammer isofluran og lett bedøve rat til den er ikke-responsiv til en labb eller hale klemme.
- Raskt plassere rotte brystet ned på scoret aluminiumsfolie med hodet rett i veien for den fallende vekt. Se figur 2. Hvis rotta begynner å bevege seg eller våkne opp før det kan plasseres på den scoret aluminiumsfolie, gå tilbake til isofluran kammer før non-respondere på en pote eller hale klype og begynne på nytt.
- Trekk unbrakonøkkelen pin, slik at vekten å falle vertikalt gjennom plasten føringsrøret og slå rotte på hodet. The rotte vil raskt gjennomgå en 180 ° rotasjon og landet på ryggen.
- Umiddelbart fjerne rotte fra samlingen svamp og påfør aktuell lidokain til rotta hode med en bomulls tippet applikator.
- Plasser rotte i liggende stilling i et rent bur som er oppvarmet ved å sette den på en kommersielt tilgjengelig varmepute.
- Ved hjelp av en stoppeklokke eller digital timer erverve "time-til-høyre". Tid til høyre er den tiden tatt av rotte å våkne fra narkosen og flip fra liggende stilling til liggende stilling eller begynn å gå.
- Returner rotte til sin hjemme-buret etter at den har gjenopprettet normal atferd (grooming, turgåing, utforske, etc.).
- Gjenta trinn 3,2-3,8 for hver ekstra rotte krever en mTBI.
- Gjenta prosedyren på den samme rotte på flere tidspunkter for repetitive mTBI eksperimenter.
4. Induksjon av Sham Injury
- Lett ANESThetize rotte med isofluran før det er non-respondere på en pote eller hale knipe.
- Raskt plassere rotte brystet ned på scoret aluminiumsfolie med hodet rett i veien for den fallende vekt.
- Ta av rotte fra aluminiumsfolie uten å trekke i unbrakonøkkel pin fra plaststyrerøret og anvende aktuell lidokain til hodet på rotta med en bomulls tippet applikator.
- Plasser rotte i liggende stilling i et rent bur som er oppvarmet ved å sette den på en kommersielt tilgjengelig varmepute.
- Bruk en stoppeklokke eller digital timer for å skaffe seg den "time-til-høyre".
- Returner rotte til sin hjemme-buret etter at den har gjenopprettet normal atferd (grooming, turgåing, utforske, etc.).
5. Verifisering av mTBI med Beam Walking Test 8
- 24 timer etter induksjon av mTBI eller simulert skade retur dyr til den prosessuelle rom.
- Overfør rottene til et rent holdingselskap burog plassere rottenes hjemme-buret ved smalere ende av den koniske stråle 165 cm, slik at den åpne delen av hjemme-buret vender mot den trangere ende av bjelken.
MERK: Den koniske strålen er 165 cm lang. Midtplattform av strålen har en bredde på 6 cm på den brede enden og 1,75 cm ved den smale enden. Senteret bjelke har avsatser (2 cm bred og 2 cm under senter bjelke) som gir trygghet når rotta fot slips. Plassere skum padding under strålen for å redusere faren for skader på rotter som kan falle av strålen under testen. - Plassere et videokamera på den brede enden av den koniske stråle og plassering / tørre videokameraet for å sikre at undersøkeren å se på videoen kan tydelig se bevegelsene til rotte for hele lengden av den koniske stråle.
- Plasser rotte i den brede enden av den koniske bjelke og oppmuntre det til å gå over strålen til sin hjemme-buret. Når rotta krysser koniske bjelke, la rotta på sin hjemme-bur i minst 60 sek til reinForce målplasseringen. Dette er Trial # 1 og er ikke inkludert i analysen.
- Slå videokameraet på og la rotte for å fullføre bjelke-walking oppgave 4 ekstra ganger (opprettholde de 60 sek forsterknings perioder i hjemmeburet). Når rotta har fullført alle prøvelser, returnere rotte til sin hjemme-buret.
- For å score, registrere antall bakbenet fot-slips som oppstår og tid / varighet å krysse strålen, for hver enkelt studie. Bruke disse dataene til å beregne gjennomsnittlig antall bakben fot-slips og tid til å krysse strålen for hver rotte.
Representative Results
Den modifiserte vekt-slipp-teknikk som er beskrevet ovenfor er en pålitelig metode for induksjon av mild traumatisk hjerneskade (mTBI) hos unge rotter. Utnytte en innvirkning vekt på 150 g, har denne teknikken blitt brukt til unge rotter som spenner 50-120 g. I tillegg kan fremgangsmåten enkelt kan gjentas i de samme dyrene for studiet av repeterende mTBI. Selv om dyr som opplever en enkelt mTBI utstillings en økning i tiden til høyre (figur 3) og vises lamslått etter våkner, de raskt gjenoppta normale aktiviteter og er visuelt skille fra humbug-skadde dyr. Gitt at skaden er mild, aktuell lidokain som eliminerer eventuelle smerter forbundet med skotter effekt, er den eneste smertestillende nødvendig. Dette er viktig for forskning som smertestillende medikamenter er kjent for å forstyrre typiske betennelses og utvinningsprosesser. På grunn av mangelen på åpenlys symptomologi, er strålegang oppgaven en pålitelig åol som kan brukes til å validere induksjonen av mTBI. Det er viktig å merke seg at ikke alle dyr som opplever en mTBI vil vise underskudd på bjelken gang oppgave, men som en gruppe, unge rotter med en mTBI demonstrere betydelig mer bakben fot-slips i forhold til unge rotter med en falsk skade (figur 4).
Et annet viktig kjennetegn ved denne modifiserte vekt-slipp-teknikken er mangel på holde påført på juvenile rotter under skade induksjon. Ved å levere en skotter slag mot hodet fulgt av hurtig roterende akselerasjon og retardasjon, representerer denne modellen nærmere biomekaniske krefter tilskrives mTBI og hjernerystelse. Når denne prosedyren brukes på unge rotter eller voksne mus, Dødeligheten er svært lav (7/202 unge dyr ~ 3,4% dødelighet), og kraniebrudd og hjerneblødning er usedvanlig sjelden 6,7. I tillegg produserer modell klinisk relevant symptomology. Juvenile gnagere som opplevde en enkelt mTBI viste underskudd i balanse og motoriske atferd, sammen med underskudd i utøvende funksjon, økt depressiv-lignende atferd, og endrede sosiale interaksjoner 6,9. Tilsvarende voksne mus også vise milde balanse og koordinasjon underskudd som gjenvinner med tiden 7. Til slutt, induksjon av mTBI bruke denne modellen krever minimal bedøvelse og ikke involverer kirurgisk forberedelse eller gravende inn i skallen. Resultatene er derfor ikke partisk av konfunderende inflammatoriske eller immunologiske effekter utløst av kirurgi eller bedøvelse. Videre er den raske utvinning tid og mangel på åpne sår muliggjør begynnelsen av ytterligere testing paradigmer å skje like etter gnagere oppleve mTBI.
Figur 1: > C Artoon representasjon av den U-formede plasttrinn og samling svamp med alle relevante dimensjoner. En avstand på 10 cm må opprettholdes mellom oppsamlings svamp og toppen av plast trinnet for å sikre juvenile rotter har nok tid til å fullføre 180 ° rotasjon.
Figur 2: (A) fotografisk representasjon av skaden induksjon plattformen. Juvenile rotter plasseres bryst-ned på et innlegg aluminiumsfolie, slik at hodet er rett under den fallende vekt. (B) sideriss av skaden induksjons plattformen. (C) Fotografisk demonstrasjon av vekten som brukes i induksjon av mTBI .
laste opp / 51820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3: Grafisk fremstilling av gjennomsnittlig forskjeller i tid til rett mellom unge rotter som opplevde en enkelt mTBI og unge rotter som opplevde en humbug skade (* p <0,01) Rotter som har mottatt en mTBI utstillings en betydelig økning i den. varigheten av tiden det tar å rette seg fra liggende stilling.
Figur 4: Grafisk fremstilling av gjennomsnittlig antall bakben fot-slips utstilt på Beam Walking oppgave av unge rotter som opplevde en enkelt mTBI og unge rotter som opplevde en humbug skade (* p <0,05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass Weights | Ginsberg Scientific | 7-2500-2 | Need to have metal loop attached to base |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Masking Tape | Commercially available | ||
| U-Shaped Plastic Stand | Constructed by Laboratory | ||
| Clamp Stand | Sigma-Aldrich | Z190357 | |
| Plastic Guide Tube | Could be constructed or purchased at a hardware store | ||
| Fishing Line | Angler 10lb | Purchased from a sporting goods retailer | |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02237518 | Inhalation Anesthetic |
| Topical Lidocaine (30ml) | Astra Zeneca | DIN 0001694 | Xylocaine Jelly 2% |
| Cotton Swabs | Commercially available | ||
| Heating Pad - 3 heat setting | Commercially available | ||
| Stop Watch | Sportline | L303 | Purchased from a sporting goods retailer |
| Video Camera | Sony | HDR-CX260V | |
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house |
| Balance Beam | Constructed by Laboratory |
References
- DeWitt, D., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C., Dash, P., Robertson, C. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30, 688-701 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
- Zhang, Z., Lerner, S., Kobiessy, F., Hayes, R., Wang, K. Systems biology and the anostic approach to drug discovery and development to treat traumatic brain injury. Systems Biology in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Yan, Q. , Springer Science. Forthcoming.
- Viano, D., Casson, I., Pellmen, E. Concussion in profession football: Biomechanics of the struck player - Part 14. Neurosurgery. 61, 313-327 (2007).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats: Part 1 - Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80, 291-300 (1994).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), (2014).
- Kane, M., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Schallert, T., Woodlee, M., Fleming, S. Disentangling multiple types of recovery from brain injury. Pharmacology of Cerebral Ischemia. Krieglstein, J., Klumpp, S. , Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart. (2002).
- Mychasiuk, R., Hehar, H., Farran, A., Esser, M. J. Mean Girls: Sex differences in the effects of mild traumatic brain injury on the social dynamics of juvenile rat play behaviour. Behavioural Brain Research. 259, (2014).
- Centers for Disease Control and Prevention. Report to congress on mild traumatic brain injury in the United States: Steps to prevent a serious public health problem. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. 1-47 (2003).
