En roman Modell av Mild traumatisk hjärnskada för unga råttor

Introduction

Även om det finns många allmänt använda metoder för generering av måttlig till svår traumatisk hjärnskada (TBI), har mycket få tekniker utvecklats för att inducera milda, stängd huvudskador hos gnagare. På grund av det faktum att milda traumatisk hjärnskada (mTBI) är tre gånger vanligare än måttlig och svår hjärnskada kombinerat ¹ behövs en tillförlitlig modell av mTBI att underlätta forskning om patofysiologi, neurobiologiska och beteende utfall, och terapeutiska strategier. Till exempel, delvis på grund av begränsningar i nuvarande djurmodeller ^2, under det senaste decenniet har det varit över 200 missade kliniska läkemedelsprövningar för behandling av TBI ^3. När modelleringssystem genereras för translationforskningsstudier, tillämpligheten av resultaten är beroende av giltigheten av modellen genomförts. För studiet av mTBI / hjärnskakning, skulle en pålitlig djurmodell inte bara härma biomekaniska krafter ansvarsrar för skada etiologi, men skulle också leda symtom som överensstämmer med dem som rapporteras av kliniskt relevant befolkningen. Dessutom eftersom barn löper särskilt stor risk för mTBI skulle optimala modelleringssystem tillämpas på unga och unga gnagare, förutom sina vuxna motsvarigheter.

Biomekaniska analyser av omständigheter som idrottare har lidit mTBIs eller concussive hjärnskador visar att de mest kritiska prediktiva faktorer för skador är snabb huvudet acceleration och hög hastighet effekter ^4. Majoriteten av gnagarmodeller för närvarande används för induktionen av TBI medger liten eller ingen rörelse av huvudet ⁵ (för översikt se ^2). Modellen beskrivs här, ger en hög hastighet effekt till chefen för en fysiskt ohämmad juvenil råtta som åtföljs av en 180 ° rotation och fritt fall som gäller acceleration / retardation krafter till ämnet huvud och kropp. THär finns två huvudsakliga fördelar med denna modifierade vikt drop teknik för induktion av mTBI. Först, producerar modellen kliniskt relevant concussive som symptomologi utan att orsaka någon uppenbar skada på hjärnan (för fullständig beskrivning av beteende utfall se ^6). Överensstämmer också med kliniska rapporter om post concussive syndrom, producerar denna modifierade tyngd-släpp-teknik heterogena utfall. Även om effekterna från mTBI är betydande, det finns en betydande variation mellan gnagare som upplevt en mTBI vid undersökning på flera utfallsmått. För det andra, medger metoden studiet av repetitiva mTBI ^7. Eftersom majoriteten av befintliga TBI modeller fogar sådana svåra skador, är det ofta svårt att framkalla en andra skada, och nästan omöjligt att studera repetitiva TBI utan omfattande skador på hela cortex.

Därför det primära motivet för att använda den modifierade vikt drop teknik för induInsatser av mTBI är att producera en skada som närmare representerar den patofysiologi och symptomologi av hjärnskakning och repetitiva TBI i juvenila populationer. Med den ökande förekomsten av mTBI relaterade till sport, faller, och bilolyckor, särskilt under barndomen, denna unika gnagarmodell av mTBI förser forskare med ett värdefullt verktyg för att studera concussive liknande hjärnskada som lätt kan appliceras på flera hit paradigm.

Protocol

OBS: Alla experiment utfördes i enlighet med den kanadensiska Rådet Djurvård och godkändes av University of Calgary, Djurvård etikkommitté.

1. Avel och djur Förberedelse

1. Beställ dräktiga råttor från standardförsöksdjurs leverantörer eller ras valpar internt enligt standardavelsprotokoll.
2. House har alla djur med fri tillgång till mat och vatten, i en temperaturkontrollerad råtthuset rummet (21 ° C), som upprätthålls på en 12:12 timmar ljus: mörker-cykel.
3. När valparna når postnatal dag 21 (P21), avvänja valpar från sina mödrar och hus i samkönade grupper om 3 eller 4.

2. Ställ upp Mild traumatisk hjärnskada (mTBI) Apparater

1. Innan de inleder förfarandet, kvarn vikter till önskad massa (t.ex. 150 g). Säkert fästa en metallslinga till den övre änden av vikten låta fiskelina för att vara fixed till vikten.
2. Betyg stanniol med ett vasst rakblad. Se till att den skårade stanniol stödjer kroppsvikten hos råttan, men kommer inte att störa acceleration hos råttan efter huvudattrapp med vikten.
3. Tejp den scored stanniol till den U-formade stadiet gjord av klar plast (38 x 27 x 27 cm ³⁾ som innehåller en samling svamp (38 x 25 x 15 cm ³⁾ (figur 1), så att den är spänd.
4. Placera den U-formade plaststeget i rätt läge nedanför styrröret tillverkat av klar plast.
5. Håll plaststyrröret (2,2 cm diameter x 1,5 m) på plats med en klämma stativ och positionera styrröret så att den är 3,5 cm ovanför scored stanniol.
6. Fäst fiskelinan genom metallslingan till vikten säkerställer att botten av vikten fritt hänger 2,5 cm ovanför den scored stanniol.
7. Säkert fästa lina till klämman montern.
   OBS: tethering vikten till clamp monter på en höjd av 2,5 cm ovanför stanniol förhindrar åter hits medan råttan faller från påverkan till samlingen svamp).
8. Dra upp vikten genom plaststyrröret med lina och hålla den på plats med en insexnyckel stift på 1,0 m.

3. Induktion av mTBI

1. När råttorna når P30 flytta burar in i procedur rummet.
2. Placera råttor i en isofluran kammare och lätt söva råttan tills den är icke-mottaglig för en tass eller svans nypa.
3. Placera snabbt råtta bröstet nedåt på gjorde stanniol med huvudet direkt i vägen för den fallande vikten. Se figur 2. Om råttan börjar flytta eller väckning innan den kan släppas ut på gjorde stanniol, återgå till isofluran kammaren tills inte svarade på en tass eller svans nypa och börja igen.
4. Dra insexnyckel stiftet, vilket gör att vikten att falla vertikalt genom plaststyrröret och slå råttan på huvudet. The råtta kommer snabbt genomgå en 180 ° rotation och mark i ryggläge.
5. Ta omedelbart råttan från uppsamlings svampen och applicera aktuell lidokain till råttans huvud med en bomullspinne.
6. Placera råttan i ryggläge i en ren bur som värms genom att sätta den på en kommersiellt tillgänglig värmedyna.
7. Med hjälp av ett stoppur eller digital timer förvärva "time-to-höger". Time-to-höger är den tid det tar råttan att vakna ur narkos och vända från ryggläge till liggande ställning eller börjar gå.
8. Återgå råttan till sitt hem-bur efter att den har återhämtat sig normalt beteende (grooming, promenader, utforska, etc.).
9. Upprepa steg 3,2-3,8 för varje ytterligare råtta kräver en mTBI.
10. Upprepa proceduren på samma råtta vid flera tidpunkter för repetitiva mTBI experiment.

4. Induktion av Sham Skada

1. Lätt Anesthetize råtta med isofluran tills det är icke-mottaglig för en tass eller svans nypa.
2. Placera snabbt råtta bröstet nedåt på gjorde stanniol med huvudet direkt i vägen för den fallande vikten.
3. Ta råttan från stanniol utan att dra insexnyckeln stiftet från plaststyrröret och tillämpa aktuella lidokain till chefen för råttan med en bomullspinne.
4. Placera råttan i ryggläge i en ren bur som värms genom att sätta den på en kommersiellt tillgänglig värmedyna.
5. Använd ett stoppur eller digital timer för att förvärva "time-to-höger".
6. Återgå råttan till sitt hem-bur efter att den har återhämtat sig normalt beteende (grooming, promenader, utforska, etc.).

5. Kontroll av mTBI med Beam Walking Test ⁸

1. 24 timmar efter induktion av mTBI eller simulerade skador retur djur till procedur rummet.
2. Överför råttorna till en ren anläggning buroch placera råttans hem-bur vid den smalare änden av de 165 cm avsmalnande balk så att den öppna delen av hem-buren är vänd mot den smalare änden av balken.
   OBS: Den avsmalnande strålen är 165 cm lång. Mitt plattform av strålen har en bredd av 6 cm vid den breda änden och 1,75 cm vid den smala änden. Mittbalken har avsatser (2 cm bred och 2 cm nedanför mittbalken) som ger säkerhet när råttans fot slirar. Placera stoppning nedanför balken för att minska risken för skador på råttor som kan falla utanför balken under testet.
3. Placera en videokamera vid den breda änden av den avsmalnande balk och position / in videokameran för att säkerställa att utredaren tittar på videon tydligt kan se rörelser råttan för hela längden av den avsmalnande balk.
4. Placera råtta vid den breda änden av den avsmalnande balken och uppmuntra den att gå över strålen till sitt hem-buren. När råttan korsar den avsmalnande balk, lämna rat i sitt hem-bur under minst 60 sek till reiNFORCE målplatsen. Detta är Trial # 1 och inte ingår i analysen.
5. Vänd videokameran och låt råttan att slutföra balkgång uppgiften ytterligare 4 gånger (bibehållande av 60 sek armerings perioder i buren). När råttan har avslutat alla rättegångar, tillbaka råttan till sitt hem-buren.
6. Gör mål, registrera antalet bakbens mul-halk som uppstår och den tid / varaktighet att korsa balken, för varje enskild prövning. Använd dessa data för att beräkna det genomsnittliga antalet bakbens mul-halk-och tid för att korsa strålen för varje råtta.

Representative Results

Den modifierade vikt-släpp ovan beskrivna tekniken är en tillförlitlig metod för induktion av mild traumatisk hjärnskada (mTBI) hos unga råttor. Med hjälp av en slagvikt på 150 g, har denna teknik med framgång tillämpas på unga råttor som sträcker 50-120 g. Dessutom kan proceduren lätt upprepas i samma djur för att studera repetitiva mTBI. Även djur som upplever en enda mTBI uppvisar en ökning av tiden till höger (figur 3) och visas bedövas på att vakna, de snabbt återuppta normala aktiviteter och är visuellt skilja från sken skadade djur. Med tanke på att skadan är lindrig, topikal lidokain som eliminerar all smärta i samband med den blick effekt, är den enda smärtstillande som krävs. Detta är viktigt för forskning som smärtstillande medel är kända för att interferera med typiska inflammatoriska och återvinningsprocesser. På grund av bristen på öppen symptomologi är strålen gång uppgiften en pålitlig tillol som kan användas för att validera induktion av mTBI. Det är viktigt att notera, att inte alla djur som upplever en mTBI ställer ut underskott på balken gång uppgift, men som grupp, unga råttor med mTBI visar betydligt mer bakbens mul-halk jämfört med unga råttor med en bluff skada (Figur 4).

En annan viktig egenskap hos denna modifierade tyngd-släpp teknik är bristen på återhållsamhet appliceras på juvenil råtta under skade induktion. Genom att leverera en blick slag mot huvudet följt av snabb rotations acceleration och retardation, denna modell representerar närmare de biomekaniska krafter skrivs mTBI och hjärnskakning. När detta förfarande tillämpas på unga råttor eller vuxna möss, dödligheten är extremt låga (7/202 unga djur ~ 3,4% dödlighet) och skallfraktur och intrakraniell blödning är exceptionellt sällsynta ^6,7. Dessutom producerar modellen kliniskt relevant SYmptomology. Juvenile gnagare som upplevt en enda mTBI visade underskott i balansen och motoriken beteenden, tillsammans med brister i exekutiva funktioner, ökade depressiva-liknande beteenden och förändrade sociala interaktioner ^6,9. Likaså vuxna möss visar också milda balans och koordination underskott som återvinner med tiden ^7. Slutligen induktion av mTBI använda denna modell kräver minimal bedövningsmedel och inte innebär kirurgisk förberedelse eller gräva i skallen. Resultaten därför inte påverkade av confounding inflammatoriska eller immunologiska effekter som utlöses av kirurgi eller narkos. Dessutom snabb återhämtningstid och brist på öppna sår möjliggör påbörjandet av ytterligare test paradigm inträffa strax efter gnagare uppleva mTBI.

Figur 1: > C Artoon representation av den U-formade plaststadiet och insamling svamp med alla relevanta dimensioner. Ett avstånd på 10 cm måste upprätthållas mellan uppsamlings svamp och toppen av plastskedet för att säkerställa den juvenile råttan har tillräckligt med tid för att slutföra 180 ° rotation.

Figur 2: (A) fotografisk representation av skadan induktions plattformen. Den juvenil råtta placeras bröstet nedåt på gjorde stanniol så att huvudet är direkt under den fallande vikten. (B) Sidovy av skadan induktionsplattform. (C) Fotografisk demonstration av vikten används i induktion av mTBI .

ladda upp / 51820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3: Grafisk representation av de genomsnittliga skillnaderna i tid till rätt mellan unga råttor som upplevt en enda mTBI och juvenila råttor som upplevt en bluff skada (* p <0.01) Råttor som fått en mTBI uppvisar en signifikant ökning av. tid tid som behövs för att rätta sig från ryggläge.

Figur 4: Grafisk representation av det genomsnittliga antalet bakbens mul-halk utställda på Beam Walking uppgiften genom unga råttor som upplevt en enda mTBI och juvenila råttor som upplevt en bluff skada (* p <0,05).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass Weights	Ginsberg Scientific	7-2500-2	Need to have metal loop attached to base
Alluminum Foil	Alcan		Available at most grocery stores
Masking Tape			Commercially available
U-Shaped Plastic Stand			Constructed by Laboratory
Clamp Stand	Sigma-Aldrich	Z190357
Plastic Guide Tube			Could be constructed or purchased at a hardware store
Fishing Line	Angler 10lb		Purchased from a sporting goods retailer
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02237518	Inhalation Anesthetic
Topical Lidocaine (30ml)	Astra Zeneca	DIN 0001694	Xylocaine Jelly 2%
Cotton Swabs			Commercially available
Heating Pad - 3 heat setting			Commercially available
Stop Watch	Sportline	L303	Purchased from a sporting goods retailer
Video Camera	Sony	HDR-CX260V
Sprague Dawley Rats	Charles River Laboratories	SAS SD 40	Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house
Balance Beam			Constructed by Laboratory