Summary
Интегрированный набор методов визуализации была применена для определения полипов морфологию и структуру ткани в Карибском кораллы Montastraea annularis и М. faveolata. Флуоресценции, серийный блок лицо, и двухфотонного конфокальной лазерной сканирующей микроскопии выявили структуру лопастные, полипов стены, и расчетное chromatophore и плотности Зооксантелл и распределения.
Abstract
Интегрированный набор методов визуализации была применена для определения трехмерной (3D) морфологию и клеточную структуру с полипами тканей, составляющих Карибское строительные коралловых рифов Montastraea annularis и М. faveolata. Эти подходы включают флуоресцентной микроскопии (FM), серийный блок лица томографии (SBFI) и двухфотонного конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (TPLSM). SBFI предоставляет глубоких тканей изображений после физической срезов; это детали текстуры поверхности тканей и 3D визуализацию к глубине тканей более чем на 2 мм. FM комплементарной и выход TPLSM ультра-изображений с высоким разрешением из ткани ячеистой структуры. Результаты были: (1) определены ранее незарегистрированных морфологии лопастные ткани на наружной стене отдельных коралловых полипов и (2) были созданы первые карты поверхности на 3D распределения и ткани плотностью хроматофоров и водорослей, как динофлагеллят Зооксантелл эндосимбионтов. Спектральный гороха поглощенияKS 500 нм и 675 нм, соответственно, предполагают, что M. annularis и М. faveolata содержат аналогичные виды хлорофилла и хроматофоров. Тем не менее, М. annularis и М. faveolata демонстрируют существенные различия в плотности ткани и 3D распределения этих ключевых клеточных компонентов. Это исследование, посвященное методов визуализации показывает, что SBFI чрезвычайно полезен для анализа больших образцов мм-масштабных Декальцинированное коралловых тканей. FM бесплатный и TPLSM выявить тонкие изменения субмиллиметровом масштабе клеточного распределения и плотности в образцах nondecalcified ткани кораллов. Техника TPLSM дает: (1) минимально инвазивной пробоподготовки, (2) превосходит способность оптического секционирования, и (3) минимальное поглощение света и рассеяние, в то же время позволяя визуализации глубоких тканей.
Introduction
Глобальное потепление и сопутствующее изменение окружающей среды непосредственно сказываются на здоровье и распределение тропических морских кораллов 1-4. Наблюдаются множественные удары, в том числе обесцвечивания кораллов и появлением инфекционных заболеваний 5-6. Тем не менее, более точный прогноз будущей кораллового ответ на эти экологических угроз потребует гистологическое "базовый" устанавливается, что определяет тканей морфологию и состав клеток и распределение для «практически здоровых» кораллов. В свою очередь, "влияние" кораллы могут быть количественно по сравнению. Кроме того, эта базовая должны быть установлены для практически здоровых кораллов в различных условиях окружающей среды, так что "здоровая реакция" также можно судить по градиентов окружающей среды. В качестве первого шага на пути к созданию этой базовой линии, 3D исследование высокого разрешения была предпринята, как практически здоровых коралловых полипов тканиморфология и клеточный состав реагирует на увеличение в глубине (WD) и сопровождающие снижением солнечного света излучения. Результаты могут быть использованы для установления более полное механическое понимание коралловый адаптации, а также, чтобы разобраться в коралловом-симбионтов эволюции и усиление света уборки.
Каменистые кораллы (Scleractinia) являются колониальные морские беспозвоночные животные, которые выступают в качестве принимающих сложной сборки других микроорганизмов, совместно именуемые коралл holobiont 7-10. Исследования, проведенные в настоящей работе стремится использовать набор технологий передовые изображений одновременно отслеживать изменения с увеличением глубины в ткани пигментов и симбиотических зооксантелл практически здоровых кораллов принимающих. Это позволит создать необходимый сравнительный ткани клеток "базовый" через батиметрическом градиента для практически здоровых кораллов и выступать в качестве индикаторов кораллового слухLTH 10. Коралловые пигменты, называемые хроматофоры, действовать, чтобы поглотить, отражают, разброс, преломляют, преломлять или иным образом вмешиваться в падающей солнечной радиации 11. Зооксантеллы-chromatophore эндосимбиотических отношения позволило коэволюции стратегически выгодном оптимизации светособирающего и скелетных стратегий роста, а также трофические пластичности (стратегии перехода кормления обратно и вперед от автотрофность в гетеротрофией) для кораллового животного 12.
Южной части Карибского бассейна островное государство Кюрасао (ранее часть Нидерландских Антильских островов) находится примерно в 65 км к северу от Венесуэлы в субширотных Аруба-La Бланкия архипелага (рисунок 1А). 70 км южное побережье Кюрасао содержит непрерывную современный и миоцена-плиоцена-плейстоцена-голоцена древняя окантовкой коралловых рифов тракт 13,14. Среднегодовая SST на Кюрасао варьирует в пределах примерно 3 ° C ANгодно, начиная от минимальной 26 ° С в конце января до максимума 29 ° C в начале сентября, с среднегодовой температуры 27,5 ± 0,5 ºC (NOAA SST наборов данных, 2000-2010). Коралловый риф в Плайя-Калки (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), лежа рядом с северо-западной оконечности Кюрасао (Рисунок 1А), был выбран для отбора проб, потому что он был ранее хорошо изученный и Морская экосистема в этом месте купается в пресной nonpolluted морской 7,15-19. . Двух тесно связанных склерактиниевых видов кораллов, М. annularis и M faveolata, были выбраны для экспериментов и анализа в данном исследовании, потому что каждого вида: (1) экспонаты совершенно разных и непересекающиеся батиметрические распределения на рифе тракта по отношению к шельфа и связанные обстановки осадконакопления карбонат осадочные (М. диапазон annularis = 0-10 м WD; М. faveolataДиапазон = 10-20 м WD 20; Фигуры 1В, 2А, и 2В); (2) является общим коралловый риф рамки строителя всем Карибском море 21; и (3) имеет хорошо изученный экологическую, физиологические, и эволюционные отношения 22.
Выборки поле для настоящего исследования была проведена с использованием стандартных методик, ныряя с аквалангом оффшорные Плайя Калки на Кюрасао. Мелкой к глубокой воде батиметрическая трансект было установлено, что натыкался на полке, над шельфа, и в глубоководной среде передних рифов. Видимо здоровые коралловые головы Затем были выявлены для отбора проб по этому батиметрическом разреза, в том числе: (1) три индивидуальный ~ 1 м в диаметре коралловых глав М. annularis, все из которых были на 5 м глубины воды (WD); и (2) три отдельные ~ 1 м в диаметре коралловые руководители М. faveolata, все из которых были в 12 м WD. Фотосинтетически активной радиации (ФАР) измеряли как 33-36% PAR на расстоянии 5 м WD и 18-22% PAR на расстоянии 10 м WD. Отбор проб проводился в январе, когда SST было 26 ° C на глубине как 5 м и 12 м. Каждый из этих шести кораллов отбирали в трех повторах в эквивалентных пространственных положений (то есть., Около 45 ° северной широты на каждой из шести полусферических кораллов). Каждый образец состоял из 2,5 см диаметром ткани кораллов-скелет основной биопсии, что были собраны с очищенной арки удар. Три коралловые ткани-скелет биопсии пробы на стандартный аквалангом с руками в перчатках от каждого из кораллов (9 из М. annularis колонии на расстоянии 5 м WD и 9 из М. faveolata в 12 м WD). Сразу же после сбора на глубине, каждый биопсии образец керна помещали в стерильный 50 мл полипропиленовую центрифужную пробирку, завинчивающейся крышкой запечатан, и возвращается на поверхность. Морская вода сливали из каждой трубки центрифуги и каждое ядро биопсия затем погружают, хранятся и транспортируются в 4% параформальдегида.
23-30. Большинство этих исследований, используемых оптический / световой микроскопии либо флуоресценции или методов в светлом поле. Тем не менее, исследования были проведены на очень больших увеличениях с помощью сканирующего электронного серийного блока изображений лица в прошлом 31. В настоящем исследовании, модифицированный протокол SBFI была разработана для и наносили на кораллов в первый раз. Потому М. annularis и М. faveolata коралловые полипы 1-2 мм в толщину, ни один из обычных световых методов микроскопии не было бы способны проникать на всю толщину коралловых полипов ткани. Поэтому, у нас есть SBFI протокол подготовки образца, специально разработанный для коралловых образцов. Кроме того, мы специально созданных держатель Стереомикроскоп, Который моторизованные двигаться в обоих направлениях Х и Y.. Этот аппарат принимает изображения блока грани образца вместо сбора разделы с помощью регулярного микротом перед микроскопом. Мы также представила еще одну нелинейного оптического двухфотонную микроскопическую технику для изображения тех же коралловых полипов по всей толщине коралловых тканей. Это позволяет преодолеть ограничения, налагаемые SBFI в плане удаления накипи и возможностью изменения тканей морфологии и объема (усадки), которые могут быть вызваны пробоподготовки (обезвоживание) и протоколов обработки. Кроме того, профили выбросов от кораллов были спектрально решен определить свои пиковые выбросы и колебания между хроматофоров и фотосинтетического зооксантеллами. Эти результаты были оценены в контексте используемого метода и их отдельных преимуществ в отношении времени приобретения, время анализа, и способности решать мелкие детали строения без ущерба улuctural целостность коралловых ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты быть готовым к Серийный Block Face визуализации коралловых образцов
1 Preinfiltration Воск
- Расплава 3,6 г стеарина хлопьев в стеклянном стакане. Соединение хорошо на горячей плите (60-70 ° C).
- Добавить 400 мг Судан IV (для минимизации воска фоновой флуоресценции). Все хорошо перемешать и подождать, пока красный полупрозрачный решение не будет достигнуто.
- Добавить 96 мл горячей расплавленный парафин (100%) и хорошо перемешать.
1.2) Вложение Воск
- Расплава 7,2 г стеарина хлопьев в стеклянном стакане и хорошо перемешать на горячей плите (60-70 ° С).
- Добавить 0,8 г Судана IV. Все хорошо перемешать и подождать, пока красный полупрозрачный решение не будет достигнуто.
- Добавить парафиновые гранулы (162 г) и перемешать до парафин плавится полностью.
- Добавить 30 г белого гранулированного Vybar и расплавить полностью в тот же стакан; один раз растаял, перемешать.
- Свободно закрыть стеклянную бутылку с крышкой. Поместите стеклянную бутылку в 60 ° C конвекции О.В.ан сохранить ингредиенты в жидком состоянии. Выполняйте все инфильтратов в этой печи.
- Разделить общий объем 200 мл красного воска в двух стеклянных бутылках 100 мл каждого. Используйте одну аликвоту для инфильтрации, а другой для окончательной вложения.
1.3) внедрения Коралловые Ткани для серийного блока Face визуализации
- Вымойте коралловых полипов, собранные в области (SI видео 1) и сохраненные (3-6 месяцев при 4-5 ° С в параформальдегиде) в фосфатным буферным раствором (3x 5 мин) и декальцинировать когда готов для включения в образ. ДЕКАЛЬЦ полипы в растворе Excal в течение 24 часов или до, как полипы полностью лишены СаСО 3. Выдержите несколько декальцифицировали коралловых полипов, как единый блок в 25, 50, 75, и 100% этанола серии, затем 1x ксилола заменителя для обезвоживания образцов.
- Поместите обработанные полипы в разогретую 65 ° С духовке, содержащей 100% ксилола замену. Инкубируют в течение 30 мин дважды Changiнг на свежий раствор. Сориентируйте полипы таким образом, чтобы верхняя часть полипов лицом вниз и верхняя поверхность является как можно более плоскими.
- Сделать решения 2: 1, 1: 1, и 1: 2 ксилол заменой и preinfiltration воск (шаг 1.1) в 50 мл пробирки Фалкон.
- Выдержите коралловых полипов с этими тремя возрастающих концентраций preinfiltration воска, после чего 3x инкубации в 100% preinfiltration воска в течение 30-60 мин каждый раз.
- Примечание: В зависимости от толщины образцов, шаги 1.3.1-1.3.5 может быть увеличена с более длительных периодов времени.
- Перемещение образцов в встраивания воск (см шаг 1.2.6) после 3-кратным инкубации в 100% preinfiltration воска.
- Удалить вложение воск через 30 мин. Замените свежим вложения воска и продолжать инкубацию в течение минимум 4 часов при 65 ° C.
1.4) Встраивание в Красной Wax
- Сфотографируйте блок (лоток из нержавеющей стали, где белый воск помещен и на вершине которой СэмPLE помещается). Это необходимо, потому что, когда встроенный в воске, расположение образца станет невидимым, как вложение красного воска является непрозрачным.
- Поместите маленькие капли точки воска с высокой температурой плавления вокруг нового разогретой нержавеющей стали вложения форму и дайте ему остыть. Налейте небольшое объем свежерасплавленного вложения воска из второго контейнера, как указано в шаге 1.2.6.
- Установите коралловые полипы, обращенную вниз быстро над точкой белого воска, затем поместить пластиковый держатель образца в лотке из нержавеющей стали и залить более вложение воск так, чтобы воск подходит к поверхности пластиковых форм.
- Возьмите всю настройку из 65 ° C духовку и дайте ему остыть на скамейке или прохладной поверхности, пока воск полностью не затвердеет.
- Это может занять 6 часов до двух дней. Поместите блок Desiccated в холодильнике при температуре 4 ° С в защищенном от света, для длительного хранения.
1.5) на разделы в последовательной установки Блок Face
- Трим блок и сократить 1 мкм разделы, используя микротома. Не собирать разделы как они станут как порошок. Помните, мы с изображениями только блок лицо. Образец появляется, когда белый воск начинает исчезать.
- Захват изображения с гладким лицом блока, который содержит образец каждый раз раздел удален. Продолжайте, пока коралловых полипов не исчезает, как в СИ Видео 2.
- Запись / Захват изображения с монохромным камере с помощью FITC флуоресцентного фильтра, чтобы забрать авто-флуоресценции хроматофоров / коралловых полипов. Изображение 3-4 Декальцинированное Основные из каждого вида.
2 визуализации кораллы Под Двухфотонное флуоресцентной микроскопии
- Fix коралловые ядер полипов, каждый из которых содержит около 10-12 полипов около дюйма в диаметре, в 4% параформальдегиде на месте сбора (морского берега), как только они собирают под водой.
- Хранить образцы при температуре 4 ° С до визуализации. Промытые жилы помещают в йе же решение с ног на голову в крышку со стеклянным дном блюдо (толщиной 0,17 мм).
- Использование двух фотонов лазер на 780 нм возбуждения, изображения 3-4 полипы в двух разных увеличениях (цифровой зум) с использованием 10X (0,3 NA) цели. Коралловый форма полипа и высота колеблется между образцами (обычно 1-2 мм) и глубины изображения, также ограничено рабочим расстоянием изображающего объективных автора.
- Используйте режим сканирования плитки, чтобы собрать примерно 25-100 (5 х 5 или 10 х 10 плитки) изображений в фокальной плоскости в ху и 50-100 изображения через оси г с интервалом 10 или 20 мкм, на общую сумму около 5000-10000 изображения / Коралловый полип.
- Изображение 3:57 районах с полипами представлять основные и видов кораллов. ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение время сбора колеблется от 2-5 ч области / полипа.
- Храните все изображения в исходном формате данных в жестком диске системы, как LSM 5 Рендер 3D в 3D анализа изображений и рендеринга программного обеспечения.
3 3D Объем Предоставление и Visualizatioп SBFI и Двухфотонное Спектральный флуоресценции данных
- Кадрирование 2D данные, чтобы уменьшить размер файла, сосредоточив внимание на одном полипа используя квадратный инструмент обрезки в программе и собрать как единый файл TIFF (уменьшить размер файла также при сохранении файла в битном формате 8) в программном обеспечении приобретения.
- Откройте собранные файлы данных SBFI (собранные в шаге 1.5.1) или кафельные несколько Z-стеки два фотонных оптических секций (собранных в шаге 2.1.4) в программе Imaris превзойти модуль под алгоритмом громкости.
- Project данные SBFI оказанные в 3D, используя теневой проекции. Создайте режим изоповерхности где воксели порогами чтобы создать прочную структуру поверхности (SI Видео 3).
- Визуализация 3D проекции, используя алгоритм плоскости отсечения на ху, XZ и YZ ортогональных мод выявить 3D структуру и форму кораллов.
- Анимация проекции с помощью ключа модуль кадров анимации в той же программе Imaris (SI ViDEOS 3-7).
- Генерация видео файлы в 5% сжатия и генерировать кино клипы в формате AVI с помощью громкости (SI Видео 4 и 6), 3D и изоповерхности условия (SI Видео 5 и 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Специально созданных аппарат SBFI (изготовлены специально для данного исследования; Рисунок 3) произвел первые подробные 3D цифровые карты рельефа (ЦМР) внешней текстурой поверхности и морфологии М. annularis и М. faveolature коралловые полипы (Рисунок 4 и SI Видео 1-2). Это дало образы ранее не описанных сложенных лепестков кораллового ткани концентрически излучающей наружу от центра каждого (4B рисунках, 4D, и 4E) полип. Эти лепестки сложены вдоль верхней гряды тканей покрытых первичной и вторичной скелетной перегородками, с радиально внешний и нижние высот доли в конечном итоге синтеза и слияния с ценосарка тканей между полипов. 3D форма полипа и связанные с долями были хорошо сохранились, несмотря на образец ткани кораллов пережив несколько этапов высокотемпературной инфильтрации и вложения. Сложения ин Судана красителя успешно маскируется фон как непрозрачный, с черный цвет, что помог увеличить контрастность каждого образца и увеличения отношения сигнал-шум. 3D, и ортогональные проекции самолет показал распределение флуоресцентных компонентов вдоль Z-оси (фиг.4В). Были самолеты с восковыми хлопьев, что иногда затененных полипов детали поверхности, которые были удалены для ясности при создании проекции. Основным преимуществом этого метода является в выявлении внутренние детали любой толстого образца, тем самым устраняя необходимость принятия нескольких разделов и выровнять их на более позднее время. Кроме того, изображения в этой технике уже выровнены, когда собирали (4А), обеспечивая разрешение аз до 1 мкм от размера выборки до 10 мм или более (в зависимости от общего привода расстоянии держателя блока в микротоме ). Можно различать разные авто-флуоресцентный компоненты (с использованием нескольких фильтров), а также индивидуальныйзооксантеллы при большем увеличении, при условии, приведенная поле зрения является приемлемым.
ApoTome оптического секционирования флуоресцентный микроскоп показал распределение коралловых тканей клеток (Зооксантелл и хроматофоры) и структуры поверхности ткани с разрешением субмиллиметровом. Следовательно, диаметр зооксантеллы 6-13 мкм легко можно было узнать и количественно по отношению к количеству клеток на единицу объема ткани (рис 5). Приобретение двухканальный изображение с помощью флуоресценции хлорофилла (зеленого цвета) и слизь с надписью с WGB Alexa 647 (показано красным), работал лучше, чтобы оценить уровень слизи и количество зооксантеллами в пределах заданного расположения полипа (большая и малая перегородки из полипа можно рассчитать самостоятельно).
В дополнение к этим подходам микроскопа, мы также применяться TPLSM, нелинейный метод широко используется для толстых биологических образцах. Основными преимуществами TPLSM более наэлектронной фотон непрерывной волны лазеры, что: (1) возбуждение происходит только в точке фокуса, потому что сила интенсивности возбуждающего света становится в квадрат и вероятность молекулы поглощать два последовательных фотонов для возбуждения один электрон от флуорофором ограничен с глубиной резкости объектива, обеспечивая тем самым неотъемлемое confocality. и (2) как следствие, не будет никакой потери в фотона возбуждения, проникая глубже в образце, в отличие от отдельных лазеров фотонов. Кроме того, большинство образцов биологической ткани также поглощают видимый свет. Поскольку двухфотонного возбуждения по своей сути давно (в ближней инфракрасной области спектра на длине волны 780 нм), поглощение также существенно минимизированы. С другой стороны, коралловый скелет состоит из карбоната кальция едва поглощает или рассеивает двухфотонного света. Наконец, так как мы были заинтересованы в определении распределения объектов только на контурной поверхности кораллового скелета, мы нашли глубокое изображений, используя эту форму веру подходит для кораллов визуализации.
Мы попытались охарактеризовать имеющиеся спектральные подписи в М. annularis (рисунки 6-9). Здесь мы покажем, что при нм двухфотонного возбуждения 780, chromatophore авто-флуоресценции имеет пик около 500 нм, в то время как флуоресценция хлорофилла от зооксантеллами сосредоточена примерно в 675 нм (рисунок 6). Хотя расслоение этого спектральных данных (рис 6-7) также возможно с помощью алгоритма расслоение в программном обеспечении (Рисунок 8), так как существует четкое спектральное расстояние между двумя компонентами, визуализации их одновременно с помощью двух детекторов на двух полос излучения доказанных быть больше всего времени техника экономия. Это особенно верно, когда образец плиткой и отображаемого в течение всей глубине 1-2 мм ткани. Это устраняет необходимость физического срезов, что требует несколько тысяч изображений в месте и образца и полипа. Распределение о F самофлюоресцирующими хроматофоры также различны (Рисунок 9) среди двух видов коралловых протестированных. В одном случае мы наблюдали значительное увеличение хроматофоров в мелкой воде жилой коралловый М. annularis сравнению с более глубокой воде М. faveolata (фиг.9 и СИ Видео 3 и 4).
Рисунок 1 (А) Карта Кюрасао в южной части Карибского моря, показывая расположение участка исследований в Плайя Калки на далекой северо-западной подветренной побережье острова. (B) Схема сечение рифа оправе полке в Плайя-Калки на Кюрасао, показывая распределения глубине М. annularis и М. faveolata. Иль / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2 (А) В месте подводного поля фотографу на 12 м WD М. faveolata в Плайя-Калки, Кюрасао. (B) Закрыть увеличение изображения в (А) демонстрация отдельных коралловых полипов М. faveolata в дневных условиях освещения (каждый полип примерно 2 мм в диаметре, некоторые из которых втянуты, обозначенные *). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
5 дюймов "SRC =" / файлы / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3 Серийный блок-лицо изображений приборы. (А и В) специально разработаны держатель микроскопа, держит микроскоп Stereolumar при 180 ° видом на блок лицо образец, помещенный в микротоме. Когда каждая секция была удалена, блок изображения лица был захвачен с целью и 2D данные в цифровом виде хранятся. Это было сделано, пока образец не исчез в блоке. Микроскоп перемещается в х и у направлении с помощью моторизованного ходовой винт и г, регулировка производится сосредоточиться образца. Важно отметить, что, когда каждый образец 1 мкм срезы, блок движется вперед 1 мкм, таким образом, переориентировать за рамки не является необходимым. XYMOT, заказ построен ху поступательное моторизованный этап; FLS, флуоресценции источник света; MT, Microtome; MIC, Стереомикроскоп; CAM, AxioCam монохромная камера; BH, Блок держатель; BF, Блок лицообразец; Форт Лодердейл, флуоресцентная лампа пятно возбуждения света на блок лица; OBJ, микроскоп цель; HIP, панель Интерфейс пользователя. Одно изображение на размерности 1388 горизонтальных х 1040 пикселей по вертикали в монохромном режиме был собран на ху пикселя (сингл) разрешение 1,25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Серийный блок лицо изображений из кораллов М. annularis и М. faveolata собраны из Плайя-Калки, Кюрасао. Данные () Примеры установить галереей около 800 изображения отдельных 2D-изображений, полученных из полипа при разрешении в г 1 мкм. (B) В другом кораллового образца, секционирования пошел свыше 2,000 мкм в г. Изображение показывает несколько полипов и компиляцию всех 2D ломтиками и 3D-объема под теневой проекции с использованием алгоритма объем визуализации Imaris. (C) с ортогональным проекция, показывающая вид хг образца в (B), можно увидеть всю глубину образца более 2 мм и стрелки указывают черные линии, где 2D ломтики были удалены по причине плохого качества; этот образ из М. annularis. 3D объем (D), Isosurface оказания (E) и визуализация данных SBFI. (D) нескольких коралловых полипов, показывающие полип морфологию в продольном сечении на стороне и объема 3D (теневая проекция) одного полипа в середине. Секционирование и визуализация под любым углом можно в 3D (см SI видео). Е. Так воксели смазаны в 3D (D), 3D Isosurface оштукатуренную поверхность показывает контур кораллового поверхности полипа и их контекстнойдоговоренность с соседними полипов (см SI видео). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 люминесцентной микроскопии коралловых полипов. (А) Сечение из декальцинированного полипа М. faveolata выставке зооксантеллы с хлорофилла автофлуоресценции под синим светом (как показано зеленым) и слизистых карманы меченные агглютинина зародышей пшеницы (показано красным), а вошедшие в образ под красный свет. Изображение автоматически плиткой в двух каналах и сшитые и выравнивается с помощью программного обеспечения прибора. (B) Расширение окно, показанное на (А), показывая отдельные зооксантеллы (каждый зеленые круги, прибли-счете 6-8 мкм в диаметре в зеленый) и поверхностный слой слизи (красный), и слияние обоих каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6 Двухфотонное спектральная характеристика флуоресценции кораллов. Используя спектральную детектор системы LSM 710, флуоресцентные сигналы от всей видимой области спектра (419-722 нм) были отсканированы на глубину около 190 мкм. Изображение показывает интервал глубины в 5 мкм в оси х для стека г и ось у волны от 419-722 нм приобрела в 10 нм интервала (всего около 1154 изображений показал). Видны две спектральные составляющие, одна с центром в 500 нм, а второй в 650 нм. Двухфотонного лазерного exciставление длина волны 780 нм были получены профили выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7 Характеристика двух спектральных компонент. () Спектральный профиль фона (синий), аутофлюоресценция от хроматофоров (зеленый) и флуоресценции хлорофилла (красный), возбужденного в два фотона волны лазерного возбуждения нм лазера 780. Спектры выводится на показано на правой стороне многоцветных спектральных данных накладываются и псевдо-цветного в соответствии с профилем излучения. (B) Отдельные спектральные бункеров где сигналы, собранные на 10 нм интервала для получения спектров и изображение в (А). Примечание что два отдельных компонента, один с центром в примерно 500 нм (chromatophore автофлуоресцентной), а другой над 675 нм (флуоресценция хлорофилла). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8 Те же изображения в рисунках 7A и 7B, спектральные данные Unmixed с помощью программного обеспечения и их соответствующие пики выбросов / спектры. И в М. annularis и М. faveolata, спектральные компоненты очень похожи, а их вершины выбросов. Существенное отличие, однако, за счет расположения этих спектральных компонентов и их численности (рисунок 9).ghres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9. Двухфотонные флуоресценции 3D изображения из коралловых полипов из М. annularis (AD) и М. faveolata (EH). (А и Е) были обследованы, не спектрального разделения компонентов с использованием 780 нм возбуждение двухфотонного лазера, с оптическим сигналом, собранной из 450-700 нм. (B и F) были собраны с той же возбуждения (780 нм), но два детектора PMT использовались одновременно для сбора данных из двух компонентов т.е.., Один из 500-550 нм (зеленый-chromatophore автофлуоресцентной) и другой 650- 720 нм (красный-флуоресценция хлорофилла). (C и G) являются глубина закодированы изображения(B и F), красный мелкая и синий глубокие компоненты в 2D. (D и Н) YZ образы прорезать (B и F) соответственно, показывающие флуоресценция приходит только с поверхности кораллов и скелет не имеет флуоресценцию возбуждения 780 нм. Обратите внимание на существенную разницу в содержании chromatophore между двумя кораллов. М. annularis обитания (0-10 м WD) является менее глубоким, чем М. faveolata обитания (10-20 м WD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 10 Полномочия Ten иерархической пространственной структуры исследований ое экосистемы коралловых рифов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
SI Фигура выстрелов 1 экрана, показывающие шаги (AI), участвующих в создании 3D объема и изоповерхности рендеринга либо из данных SBFI или 2Photon микроскопии с использованием программного обеспечения для анализа изображений (см Материалы таблицу). (А) 2D ломтики сырой Данные в режиме среза, показывающие одну плоскость; (B) 3D объем всех 2D ломтиками; (C) создание мастер изоповерхность с интересующей области (ROI) выбранного; (D) алгоритм с фоновой вычитания выбранного; (E) пороговое значение применяется, чтобы забрать пикселей, которые представит данные; (F) центр семян точки поверхности; (G), фильтр на основе объема применяется для устранения меньший объем мусора и шума; (H) окончательный 3D к изоповерхность; (Я) ключ мастер кадра анимации создавать фильмы, как в видео СИ. Окончательные оказанные изображения показаны по объему и изоповерхности условий в видео СИ 3-7. Протокол шаги 3.1.3-3.1.5 рассматриваются следующие процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Материал / Оборудование | Компания | Каталог / Номер модели | Комментарии / Описание |
| Coral ткани Скелет | Ни один | Ни один | 2,5 см BioPсы от естественной среде обитания |
| Арка Удар Coring Устройство | CS Осборн и компании | № 149 | Для Coral коллекции биопсии |
| Параформальдегид | Электронной микроскопии наук | RT 15700 | 16% предварительно разбавлено |
| Histoclear / Safeclear II | Электронной микроскопии наук | RT 64111-04 | Нетоксичных заместитель ксилол, обезвоживания и Deparafinization |
| Ксилол и этанол | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Обезвоживание |
| Парафин | Ричард Аллен Научно | Тип H REF 8338 | Проникновение решение |
| Vybar | Свеча Maker | Ни один | Компонент красного воска |
| Стеарин | Свеча Maker | Ни один | Компонент красного воска |
| Судан IV | Фишер Химическая | S667-25 | Красный воск-Непрозрачный фон |
| Зародыши пшеницы Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | Для маркировки Coral слизь |
| Продлить Золото | Life Technologies | P36095 | Anti-Fade монтажа СМИ |
| Фтор Блюдо | Инструменты Всемирного Precision | FD-35-100 | Для визуализации двухфотонного |
| XY двигателя, приводом и контроллером | Лин Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Поступательное движение |
| Горячая Plate | Corning | DC-220 | Таяние все воск |
| Конвекционная печь | Ямато | DX-600 | Проникновение и внедрение |
| Гистологический процессор | Leica | ASP 300 | |
| Microtome | Leica | RM2055 | Одноразовые ножи |
| Стерео микроскоп | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 мм WD) Цель |
| Флуоресцентного микроскопа с ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert М 200, ApoTome я система | Визуализация тонкой части полипа: Зооксантелл |
| AxioCam камера | Carl Zeiss | MRM | Черно-белая камера 1388x1040 пикселей |
| AxioVision Software | Carl Zeiss | Версия 4.8 | Программа приобретения изображение |
| Двухфотонное Лазерная | Spectraphysics | МейТан ЭДП, импульсный лазер (70 фс) | С модулем DeepSee |
| Лазерного сканирующего микроскопа | Carl Zeiss | LSM 710 со спектральным детектором | 34канал обнаружения PMT |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 или выше | для двухфотонного и спектральной получения изображения |
| Imaris Люкс Software | Bitplane, Inc, | Версия 7.0 или выше | 3D Объем, Iso-поверхность рендеринг, Визуализация |
Таблица 1 Основные материалы, оборудование, микроскопы, и программное обеспечение, используемое в данном исследовании.
SI Видео 1. В месте подводного поля видео показывает коралловый обитания в 12 м WD М. faveolata в Плайя-Калки, Кюрасао.
SI Видео 2. Индивидуальный 2D серийный блок изображения лиц оказанную 3D изображения, показанного на Fiфигура 4E.
SI Видео 3. Isosurface 3D к серийный блок изображения лица представлены на рисунке 4E и СИ видео 1 показывает топографию коралловых полипов.
SI Видео 4. объем 3D к необработанные данные двухфотонная микроскопии изображение кораллового полипа М. faveolata. Возбуждения 780 нм и эмиссии захватили одновременно на двух ширин зон для зооксантеллами (псевдо-красного цвета, 600-700 нм) и хроматофоров (псевдо цвета зеленых, 500-550 нм).
SI Видео 5. объем 3D, в изоповерхности пятен двухфотонную микроскопии образ кораллового полипа М.faveolata. Возбуждения 780 нм и эмиссии захватили одновременно на двух ширин зон для зооксантеллами (псевдо-красного цвета, 600-700 нм) и хроматофоров (псевдо цвета зеленых, 500-550 нм).
SI Видео 6. объем 3D к необработанные данные двухфотонная микроскопии изображение кораллового полипа М. annularis. Возбуждения 780 нм и эмиссии захватили одновременно на двух ширин зон для зооксантеллами (псевдо-красного цвета, 600-700 нм) и хроматофоров (псевдо цвета зеленых, 500-550 нм).
SI Видео 7. объем 3D оказанные изоповерхности-спотов двухфотонная микроскопии изображение кораллового полипа М. annularis. Возбуждения 780 нм и эмиссии захватили одновременно на двух ширин зон для зооксантеллами (PSeudo цвета красный, 600-700 нм) и хроматофоры (псевдо цвета зеленый, 500-550 нм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Коралловый риф исследования является весьма междисциплинарный исследовательский проект, с участием анализ одновременного физических, химических и биологических явлений, которые работают в морской среде. Изучение сложных экосистем коралловых рифов Поэтому лучше завершена в течение «степеней в десять 'контекстной рамках (рисунок 10). Графические сборник показывает, что коралловые экосистемы охватывает широкий спектр пространственных измерений (10 -9 до 10 5 м). Кроме того, это упражнение показывает, что геобиологических анализирует на промежуточной длины-масштабе 1 мм-1 см являются мостом необходимо объединить поля и лабораторные анализы. Это Полномочия Ten рамках контекст для экспериментов, анализа, моделирования и синтез физических, химических и биологических параметров, которые контролируют Кюрасао экосистем коралловых рифов.
Настоящее исследование является первым, чтобы применить полностью интегрированный пакет OF FM, SBFI и методы CLSM отслеживать реакцию практически здоровых кораллов к увеличением глубины. Световая микроскопия инструменты, доступные для изображения всей ткани или толстых биологических образцов были ограничены в связи с различными оптическими ограничениями, создаваемыми самими образцов, в том числе поглощение, рассеяние и другие явления. В только в последнее десятилетие, SBFI сканирующей электронной микроскопии был использован в сверхвысоких разрешениях 31, а также легкие микроскопических изображений с помощью широкого поля на основе SBFI визуализации нескольких биологических образцов. Это включает анализ все, от мозга к целых тканей сердца и даже образцах, содержащих кости, которые были отшлифованы, отполированы, меченые, и отображаемого в то же время после каждой секции был сделан 23-29. Недавно, флуоресценции и конфокальной микроскопии выявить контуры, форма и распределение белков и пигментов в биологических образцах 32-33. Тем не менее, 3D структура отдельных коралловых полипов гаD не был ранее разрешен. Предпосылкой для SBFI с коралловыми образцов декальцинации, как карбонат кальция необходимо удалить перед оказания образцы поддающиеся инфильтрации и секционирования с помощью регулярного микротом.
Это где двухфотонная флуоресцентной микроскопии становится незаменимым для анализа биологических тканей благодаря своим уникальным явлениям двухфотонного возбуждения. Это привело к расширенной проникновения глубина 33-34 коралловых тканей в настоящем исследовании, где шаг декальцификация эффективно устранены за счет нелинейной двухфотонного возбуждения явлений 34. Кроме того, модуль предкомпенсации с двухфотонного лазера при условии, гораздо короче длительность импульса, который дополнительно улучшенную глубину проникновения. На стороне образца, так как карбонат кальция не поглощает около инфракрасный свет на 780 нм, глубина проникновения ограничено, как правило, на рабочей дистанции целью. Еще один недостаток ое декальцинации и удаление кораллового скелета является потеря структурной целостности коралловых ткани, что делает оценки объема ткани еще труднее после того, как образец прошел через несколько обезвоживания и регидратации шагов и встраивания в безводной воск. Это подчеркивает важность определения объемов коралловые ткани до и после обработки.
Конфокальной характеристика флуоресцентных белков кораллов была завершена для Great Barrier Reef кораллов и защитные спектральные свойства коррелируют с глубиной кораллового обитания 32. Тем не менее, в настоящем исследовании мы демонстрируем впервые используя два-фотонной микроскопии, что есть существенное сокращение хроматофоров везде в глубокой воде кораллы кроме рта тканей. Кроме того, различные изменения в распределении зооксантеллами по отношению к хроматофоров наблюдается по всей глубине разрезов в М. annularis, порогаэ коралловые ткани мелководные полностью покрыты хроматофоров. С разрешением предоставленной большого увеличения изображений (рисунки 8C и 8D), мы можем теперь точно количественно площадь и объем занимаемого зооксантеллами, и их отношения плотности ткани можно определить по отношению к других клеточных компонентов. Взятые вместе, интеграция SBFI и флуоресценции двухфотонная спектральных изображений в настоящем исследовании дали жизненно важные новые знания о морфологии и структуры коралловых тканей. Эти данные помогут количественно отдельные компоненты коралловых ткани, либо на индивидуальном уровне полипа или на контекстной уровень взаимодействия между колониальными полипов на всей коралловые головы. Этот контекст сейчас позволит адаптивную реакцию кораллового holobiont к изменениям в глубине уровня моря и освещенности быть количественное отслеживаются и предсказал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
