Summary
イメージング技術の統合スイートは、カリブ海サンゴMontastraeaのannularis及びM.におけるポリープの形態および組織構造を決定するために適用されているfaveolata。蛍光、シリアルブロック面、及び二光子共焦点レーザー走査顕微鏡は、葉状構造、ポリープの壁、推定色素胞および藻密度および分布を同定した。
Abstract
イメージング技術の統合スイートは、カリブ海造礁サンゴMontastraeaのannularisおよびMを含む三次元（3D）形態およびポリープ組織の細胞構造を決定するために適用されているfaveolata。これらのアプローチは、蛍光顕微鏡（FM）、シリアルブロック面イメージング（SBFI）、および二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（TPLSM）が挙げられる。 SBFIは、物理的なセクショニング後に深部組織イメージングを提供します。それ以上2mmの組織深さに組織表面テクスチャと3D可視化を詳述する。組織細胞構造の相補FMとTPLSM収率は、超高解像度の画像。結果は、きた：（1）個別のサンゴのポリープの外壁に、以前に報告されていない葉状組織形態を特定し、（2）色素胞および藻類様渦鞭毛藻褐虫藻の内部共生の3次元分布と組織の密度の第1面のマップを作成しました。分光吸収エンドウ500 nmおよび675 nmでksとは、それぞれ、ことを示唆しているM. annularisとM. faveolataはクロロフィル色素胞と同様のタイプが含まれています。しかし、M. annularisとM.組織密度及びこれらの重要な細胞成分の3次元分布に有意な相違を示すfaveolata。イメージング方法に焦点を当てこの研究は、SBFIを脱灰サンゴ組織の大ミリメートル規模サンプルの分析に非常に有用であることを示す。無料のFMおよびTPLSMはnondecalcifiedサンゴの組織試料中の細胞分布と密度の微妙なサブミリ規模な変更を明らかにした。 TPLSM技術が得られる：（1）低侵襲性試料調製、（2）優れた光学セクショニング能、及び（3）最小の光吸収及び散乱が、依然として深部組織のイメージングを可能にしつつ。
Introduction
地球温暖化および付随する環境変化を直接、熱帯の海洋サンゴ1-4の健康と分布に影響を与えている。複数の影響は、サンゴの白化や感染症5-6の出現など、観察されています。しかし、これらの環境の脅威に対する将来のサンゴ応答のより正確な予測が組織学的「ベースライン」は、「外見上健康」サンゴのための組織形態や細胞組成および分布を定義する、確立されることが必要になります。ターンでは、サンゴはその後、定量的に比較することができ、「影響を受ける」。 「健康な応答」、環境勾配を越え測ることができるようにさらに、このベースラインは、環境条件の多様な条件下で明らかに健康なサンゴのために確立されるべきである。このベースラインを確立に向けた最初のステップとして、高解像度の3D研究がどのように明らかに健康なサンゴのポリープ組織から行われてきた形態および細胞組成は、太陽光の放射照度での水深の増加（WD）及び添付減少に応答します。結果は、サンゴ適応のより包括的なメカニズムの理解を確立すること、ならびにサンゴ共生生物の進化への洞察と集光の増強を得るために使用することができる。
ストーニーサンゴ（ イシサンゴ ） をまとめサンゴは 7-10 holobiontと呼ばれる他の微生物の複雑な集合体にホストを果たしている植民地の海洋無脊椎動物の動物である。本研究で行わ研究では、同時に、組織の顔料および明らかに健康なホストサンゴの共生藻の高まり水深での変更を追跡するために、最先端のイメージング技術のスイートを使用しようとしています。これはサンゴょんの指標として明らかに健康なサンゴや行為に対して海底地形勾配を越え必要な比較の組織細胞「ベースライン」を確立しますLTH 10。 胞と呼ばれるサンゴ顔料は、吸収反映し、散乱、屈折、回折、またはその他入射太陽放射線11に干渉するように作用する。褐虫藻-色素胞内共生関係は、サンゴの動物12のための戦略的に有利な光捕集最適化と骨格成長戦略だけでなく、栄養の可塑性（栄養要求から従属栄養に前後送り戦略をシフト）の共進化を可能にした。
キュラソー南部のカリブ海の島国（オランダ領アンティル諸島の旧一部）アルバ·ラBlanquilla列島（ 図1A）トレンド東西以内に約65キロ北のベネズエラにある。キュラソーの70キロ長い南海岸は、連続モダンで新世-鮮新-更新世、完新世の古代フリンジサンゴ礁管13,14が含まれています。キュラソーで毎年恒例のSST平均は約3℃ANを変えるnually、27.5±0.5ºC（NOAA水温データセット2000-2010年）の年平均気温と1月下旬に26℃の最小値から9月上旬に29℃の最高に及ぶ。それは、以前はよく研究されてとしているため、キュラソー（ 図1A）の北西端の近くに横たわって、サンプリングのために選択されたプラヤカルキでサンゴ礁（12°22'31.63 "N、69°09'29.62" W）この場所での海洋生態系は、新鮮な非汚染海水7,15-19を浴びている。 。二つの密接に関連サンゴサンゴ種、 結核annularisとM faveolataは 、この研究での実験や分析のために選択したそれぞれの種のため、（1）棚ブレークとに関してサンゴ礁管に展示明確に異なるとオーバーラップしない海底地形分布関連した炭酸塩堆積堆積環境（M. annularis範囲= 0〜10メートルWD、M. faveolata範囲= 10〜20メートルWD 20; 図1B、2A、および2B）。 （2）カリブ海21全体で共通のサンゴ礁のフレームワークビルダーです。及び（3）よく研究された生態学的、生理学的、および進化的関係22を有している。
本研究のフィールドのサンプリングがオフショアキュラソープラヤカルキの標準スキューバダイビング技術を用いて行った。浅い対深海海底地形のトランセクトは棚ブレークオーバー、及び深海フォアサンゴ礁環境に、棚に偶然出会ったことが設立されました。 （1）3の個別Mの〜1メートル、直径サンゴヘッド：どうやら、健康なサンゴヘッドがその後を含め、この海底地形トランセクトに沿ってサンプリングのために同定された5メートルの水の深さ（WD）にあったそのすべてがannularis; Mの（2）は、3つの個別の〜1メートル、直径珊瑚faveolataは 、そのすべてが12メートルWDにあった。光合成有効放射（PAR）は、33から36までパーセントのPとして測定した10メートルWDで5メートル、WDと百分の18から22までの額面でのAR。 SSTは5メートルと12メートルの両方の水の深さで26℃のときのサンプリング1月に実施した。これらの6つのサンゴヘッドのそれぞれは、同等の空間的位置（6半球状のサンゴヘッドのそれぞれにすなわち 、約45°北緯）で三重にサンプリングした。各個別のサンプルを洗浄アーチパンチで採取した直径2.5cmサンゴ組織スケルトンコア生検で構成されていた。三サンゴ組織の骨格の生検は、サンゴのヘッドのそれぞれから手袋をはめた手で、標準的なスキューバでサンプリングされた（9 Mから12メートルのWDでのM. faveolataから5メートルWDと9位のコロニーをannularis）。直ちに深さで収集すると、各生検コアサンプルを密閉スクリュートップ、無菌の50mlポリプロピレン遠心管に入れ、表面に戻った。海水は、各遠心分離管からデカントし、各コア生検は、その後、浸漬保存し、4％パラホルムアルデヒド中で搬送した。
23-30無傷の骨を、全脳および全心臓、ヒト組織を含む、生物学的サンプルの広い範囲で無傷のマウス胚、ゼブラフィッシュ胚および動物試料の複数のタイプを行っていた。これらの研究の大部分は、蛍光または明視野いずれかの技術を有する光/光顕微鏡を利用した。しかし、研究は、過去31における走査型電子シリアルブロック顔画像を用いた超高倍率で行われている。本研究では、修飾SBFIプロトコルがために開発された初めてサンゴに適用した。 M.ので、 annularisとM. faveolataサンゴのポリープは、厚さ1〜2mmであり、日常的光顕微鏡技術のいずれも、サンゴのポリープ組織の厚さ全体を貫通することが可能でないであろう。そこで、具体的にはサンゴのサンプルのために設計されSBFI試料調製プロトコルを有している。さらに、当社は、カスタム実体顕微鏡ホルダーを設計したxおよびyの両方向に移動するように電動化されている。この装置ではなく、顕微鏡の前に定期的なミクロトームを使用してセクションを集めるよりも、サンプルのブロック面の画像を取ります。また、サンゴの組織の厚さ全体にわたってイメージに同じサンゴのポリープを別の非線形光学二光子顕微鏡技術を導入しました。これは、脱灰および試料調製（脱水）および処理プロトコルによって誘導され得る組織形態および量（収縮）の変化の可能性の点でSBFIによって課される制限を克服する。さらに、サンゴからの発光プロファイルは、スペクトル的に色素胞と褐虫藻の光合成の間にそれらのピークの排出量および変形を識別するために解決されました。これらの結果は、使用される方法の文脈及び取得時間に関して各自の長所、分析時間、とstrを損なうことなく、微細な構造の詳細を解決する能力で評価したサンゴ組織のuctural整合性。
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Protocol
注：試薬シリアルブロックフェイスイメージングサンゴのサンプルのために準備する
1 Preinfiltrationワックス
- ガラスビーカー中でステアリンフレーク3.6gのメルト。ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。
- スーダンIVの400 mgの追加（ワックスバックグラウンド蛍光を最小限にするため）。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。
- 96ミリリットルホット溶融パラフィン（100％）を加え、よく混ぜる。
1.2）埋め込みワックス
- ガラスビーカーにステアリンフレーク7.2gの溶融し、ホットプレート（60〜70℃）でよく混ぜる。
- スーダンIVの0.8グラムを追加します。よく混ぜ、赤い半透明の溶液が得られるまで待つ。
- パラフィン顆粒（162グラム）を追加し、パラフィンが完全に溶けるまで混ぜる。
- 白い粒状VYBARの30グラムを加え、同じビーカーに完全に溶融。溶けたら、混ぜる。
- 緩く蓋をガラスボトルを閉じます。 60℃の対流OVにガラス瓶を置きエンは、液体状態で成分を維持する。このオーブン内のすべての浸潤を実施する。
- 各100mlの二枚のガラスボトルに200mlの赤いワックスの総容量を分割します。最終的な埋め込みのために1浸潤分量やその他を使用してください。
1.3）シリアルブロックフェイスイメージング用埋め込みコーラル組織
- リン酸緩衝生理食塩水（3×5分）でサンゴのポリープフィールド（SIビデオ1）に回収し、（パラホルムアルデヒド中で4〜5℃で3〜6ヶ月）を記憶を洗浄したときに画像化することができる状態に脱灰。 24時間以上のポリープは、 炭酸カルシウムを全く欠いているようになるまでExCal溶液中のポリープを脱灰。サンプルを脱水する1倍キシレン代替が続く、25、50、75、および100％エタノール系に単一のブロックなど、いくつかの脱灰サンゴのポリープをインキュベートする。
- 100％のキシレン代替品を含有する予熱した65℃のオーブン内で処理ポリープを置きます。チャンギ二回30分間インキュベートする新鮮な溶液にngの。ポリープの上部が下方に面しており、上面はできるだけ平坦であるような方法で、ポリープを方向付ける。
- 1,1：1,1：2の溶液を作る2キシレン代用し、50mlファルコンチューブ内preinfiltrationワックス（ステップ1.1）。
- 30〜60分ごとに時間を100％のpreinfiltrationワックス中3倍インキュベートしpreinfiltrationワックスのこれら三つの濃度を増加させ、サンゴのポリープをインキュベートする。
- 注：試料の厚さに応じて、ステップは1.3.1-1.3.5より長い期間を増加させることができる。
- 100％preinfiltrationワックス中3倍のインキュベーションの後（ステップ1.2.6を参照）ワックスを埋め込むにサンプルを移動します。
- 30分後に埋め込むワックスを削除します。新鮮な埋め込みワックスで交換して、65℃で4時間の最小インキュベーションを続ける。
1.4）赤ワックスに埋め込み
- （ステンレス白ろうが配置されるトレイとサムの上にブロックを撮影PLE）が配置されます。一度ワックスに埋め込ま埋め込む赤いワックスが不透明であるように、サンプルの位置が不可視になるために必要です。
- 金型を埋め込む新しい予熱したステンレス鋼を中心に高融点ワックスの小滴を置き、冷却します。ステップ1.2.6で述べたように、第2の容器から新鮮に溶け埋め込むワックスを少量を注ぐ。
- ワックスは、プラスチック金型の表面まで来るように位置白蝋ドットの上に迅速に下向きにサンゴポリープは、次にステンレス鋼トレイにプラスチック製の試料ホルダを配置し、さらに埋め込みワックスを注ぐ。
- 65℃のオーブンの中から全体のセットアップを取り、ワックスが完全に硬化するまで、それがベンチや冷たい表面上で冷まします。
- これは一日か二日に6時間までかかる場合があります。長期保存のため、光から保護し、4℃で冷蔵庫内で乾燥さのブロックを、配置する。
1.5）シリアルブロックフェイスのセットアップでセクショニング
- Trはブロックイムとミクロトームを使用して1μmのセクションをカット。彼らが粉のようになるようにセクションを収集することはありません。私たちが唯一のブロック面を画像化していることを覚えておいてください。白ろうが消え始めるとサンプルが表示されます。
- サンプルのセクションが削除されるたびに含まれている滑らかなブロック面の画像を取り込む。サンゴポリープはSIのビデオ2のように消えるまで続けます。
- 録音/色素胞/サンゴポリープの自家蛍光をピックアップして、FITC蛍光フィルターを使用して白黒カメラで画像をキャプチャします。それぞれの種からの画像3-4脱灰のコアを。
二光子蛍光顕微鏡下では2イメージングサンゴ
- とすぐに、彼らは水の下で収穫されるように、それぞれがコレクション（海岸）の部位で4％パラホルムアルデヒド中で、直径約インチの周り10〜12ポリープを含む、サンゴポリープコアを修正しました。
- イメージングまで、4℃でサンプルを保管してください。洗浄されたコアは、目に配置されます逆さまにカバーガラスボトムディッシュでの電子と同じ溶液（0.17ミリメートルの厚さ）。
- 10X（0.3 NA）対物レンズを用いて780nmで励起、画像2の異なる倍率（デジタルズーム）で3〜4ポリープで2光子レーザーを使用した。形状および高さは試料（1〜2 mm）とし、撮像深度との間で変化するサンゴポリープはまた、結像対物レンズの作動距離によって制限される。
- XYでの焦点面あたりの画像と50〜100の画像は/ 5,000〜10,000の画像を中心に、合計10または20ミクロン間隔でのz軸を約25〜100（5×5または10×10のタイル）を収集するタイルスキャンモードを使用してくださいサンゴポリープ。
- コアとサンゴ種を表すためのイメージ三から四ポリープエリア。注：画像取得時間は2-5時間/ポリープエリアとの間で変化する。
- LSM 5は、3D画像解析およびレンダリングソフトウェアで、3Dレンダリングなどのシステムのハードディスクに、生データ形式ですべての画像を保存してください。
3次元ボリュームレンダリングとVisualizatioSBFIのnおよび二光子分光蛍光データ
- 収集ソフトウェア（8ビットフォーマットでファイルを保存することにより、ファイルサイズを小さくする）プログラム正方形トリミングツールを使用して、単一のポリープに着目してファイルサイズを小さくし、単一のTIFFファイルとしてコンパイルする2Dデータをトリミング。
- Imarisがボリュームアルゴリズムの下にモジュールを突破プログラム内SBFIデータの組み立てファイル（ステップ1.5.1収集）または（ステップ2.1.4収集）2光子光学切片のタイル張りの複数のz-スタックを開きます。
- 影の投影を使用して3DでレンダリングSBFIデータを投影。ボクセルは、固体表面パターン（SIビデオ3）を作成するために閾値処理された等値面モードを作成します。
- サンゴの3D構造と形状を明らかにするためにxz平面、XYでのクリッピング平面のアルゴリズムを使用して3D突起とyz平面の直交モードを可視化する。
- 同じImarisプログラム（SI Viには 、キーフレームアニメーションモジュールを使用して予測をアニメーションDEOS 3-7）。
- 5％の圧縮でビデオファイルを生成し、ボリュームを使用してのAVI形式のムービークリップを生成する（SIビデオ4および6）、3Dおよび等値面のモダリティ（SIビデオ5,7）。
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Representative Results
（具体的には、本研究のために製造され、 図3）、カスタム設計されたSBFI装置は、Mの外側表面の質感と形態の最初の詳細な3Dデジタル標高地図（DEMの）を生じたannularisとM. faveolatureサンゴのポリープ（ 図4とSIビデオ1-2）。これは同心円状に各ポリープ（ 図4B、4D、および4E）の中心から外側に放射するサンゴの組織の以前に未記載積み重ねローブの画像が得られた。これらのローブが最外周と最標高ローブは、最終的に合成し、ポリープの間で共肉組織との合併で、組織で覆われた一次および二次骨格セプタムの最上尾根に沿って積層されている。 3Dポリープ形状と関連したローブが十分に高温浸潤および包埋のいくつかのステップを経たサンゴ組織試料にもかかわらず、保存した。 additio黒色各試料のコントラストを最大にし、信号対雑音比を増加させるのに役立ったとスーダン染料のnが成功し、不透明なバックグラウンドをマスクする。 3次元直交平面図は、z軸（ 図4B）に沿った蛍光成分の分布を示した。時には予測を作成するときに分かりやすくするために削除されたポリープの表面の詳細を、隠さワックスフレークと平面がありました。この技術の主な利点は、複数のセクションを取り、後でそれらを整列させる必要がなくなり、したがって、任意の厚さのサンプルの内部の詳細を明らかにしている。最大10mm以上のサンプルサイズから1μmまでののz分解能を提供する、（ 図4A）を収集するとき、さらに、この手法で画像が既に整列され（ミクロトームブロックホルダの総駆動距離に応じて）。これは、異なる自己蛍光（複数のフィルタを使用して）コンポーネント、ならびに個体などを識別することができる藻は、より高い倍率で、視野の減少分野が許容提供される。
余線分光学切片の蛍光顕微鏡は、サブミリメートルの分解能でサンゴ組織細胞（藻および色素胞）および表面組織構造の分布を明らかにした。したがって、6-13ミクロンの直径の藻を容易に認識し、組織容積当たりの細胞数に対して（ 図5）を用いて定量することができる。クロロフィル蛍光（緑）、WGBアレクサ647（赤で表示）で標識した粘液を用いたデュアルチャネル画像の取得は、ポリープ（メジャーとマイナーの与えられた位置内粘液のレベルと、褐虫藻の数を定量化するために最善を働いたポリープのセプタム）が独立して計算することができた。
これらの顕微鏡のアプローチに加えて、私たちもTPLSM、広く厚い生物学的サンプルに使用非線形手法を適用している。上の上のTPLSMの主な利点励起光強度のパワーの二乗になり、フルオロフォアからの1つの電子を励起するつの連続した光子を吸収する分子の機会が限られているので、（1）励起は焦点のポイントでのみ発生し、連続波レーザーであることである電子光子対物レンズの被写界深度に、このように固有の共焦点性を提供する。試料中に深く貫通し、（2）結果として単一光子レーザーとは対照的に、励起光子の損失がないであろう。また、ほとんどの生物学的組織サンプルはまた、可視光を吸収する。二光子励起（780 nmの近赤外線で）本質的に長いので、吸収が実質的に最小化される。一方、炭酸カルシウムからなるサンゴ骨格がかろうじて二光子光を吸収または散乱する。私たちが唯一のサンゴ骨格の輪郭表面上のオブジェクトの分布を決定することに興味を持ったので、最後に、私たちは、このモダリティ版を使用して、より深いイメージングを発見サンゴのイメージングに適しyの。
私たちは、Mで使用可能なスペクトルシグネチャを特徴づけることを試みてきたannularis（ 図6-9）。ここでは、藻からクロロフィル蛍光を約675nmで（ 図6）を中心としつつ、780nmの二光子励起の下で、色素胞の自己蛍光は、500nmの付近にピークを有することを示す。 2つのコンポーネント間の明確なスペクトル距離があるので、このスペクトルデータのアンミキシング（ 図6-7）を同時に証明した2つの発光バンドの2つの検出器を使用して画像化する、また、ソフトウェアにおけるアンミキシングアルゴリズム（ 図8）で可能ではあるが最も時間の節約技術である。サンプルがタイル張り組織の全体の約1〜2mm径の深さの上に結像されるときに特に当てはまる。これは場所およびサンプルやポリープ当たり数千の画像を必要とする物理的な切片、する必要がなくなります。配布O F自動蛍光色素胞はまた、試験した2つのサンゴ種間の異なる（ 図9）である。あるケースでは、浅い水に生息サンゴMの色素胞の有意な増加を観察深い水M.に比べannularis faveolata（ 図9とSIビデオ3,4）。
島のはるか北西の風下の海岸にプラヤカルキでの調査地の位置を示す南部のカリブ海でのキュラソーの図1（A）のマップ 。 （B）キュラソープラヤカルキでサンゴ礁縁の棚の概略断面図、Mの水深分布を示すannularisとM. faveolata。ジル/ ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Mの12メートルWDでその場水中フィールド写真で 、図2（A）プラヤカルキ、キュラソーでfaveolata。（B）Mの個別のサンゴのポリープを示す（A）に画像を拡大してクローズアップ昼間の照明条件でのfaveolata（各ポリープは*を付して後退するそのうちのいくつかは、直径約2ミリメートル、、です）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
5インチ "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "幅=" 500 "/>
図3シリアルブロックフェイスイメージング計装 。 （AおよびB）、カスタム設計された顕微鏡用ホルダー、ミクロトームに配置された試料のブロック面に対向180°Stereolumar顕微鏡を保持する。各セクションが除去されたとき、ブロック顔画像が対物レンズで撮影した2次元データをデジタル的に保存した。サンプルはブロック内に消失するまでこれが行われていた。顕微鏡は、電動リードスクリューを使用して、xおよびy方向に移動し、zは、調整は、試料の焦点を合わせるようになっている。それは、それぞれ1μmのサンプルを切断したときに留意することが重要であるフォワードブロック移動1μm程度なので、範囲を再フォーカスする必要はありません。 XYMOT、カスタムは、x-y並進電動ステージを建て、 FLS、蛍光光源; MT、ミクロトーム;総務省、実体顕微鏡。 CAM、Axiocamモノクロカメラ。 BH、ブロックホルダと、 BFのブロック面サンプル; FLL、ブロック面上の蛍光灯励起スポット; OBJ、顕微鏡の対物レンズ; HIP、ヒューマンインタフェースパネル。モノクロモードで1,040のx 1388水平垂直画素の寸法で1つの画像が1.25μmでのxyピクセル（シングル）分解能で収集した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンゴMの図4のシリアルブロック面イメージングannularisとM. zは、1ミクロンの解像度でポリープから得られた各2D画像の約800像を示すfaveolataプラヤカルキ、キュラソーから収集。（A）サンプル·データ·セットのギャラリー。 （B）別のサンゴのサンプルでは、切片は2,00の上にうまくいったzは0以下である。画像は、Imarisボリューム可視化アルゴリズムを使用して、シャドウの投影の下で3Dボリュームへのすべての2Dスライスの複数のポリープやコンパイルを見せている。 （B）におけるサンプルのxz図を示し、（C）直交投影は、人は2ミリメートルの上に、試料の深さ全体を見ることができ、矢印は、2Dスライスが低品質のために削除された黒い線を示し、このイメージは、Mからのものであるannularis。 3Dボリューム（D）、等値面のレンダリング（E）およびSBFIデータの可視化。 （D）は中央の単一のポリープの縦側の部分と3Dボリューム（シャドウの投影）にポリープの形態を示す複数のサンゴのポリープ。任意の角度での断面化と可視化が3Dで可能です（SIのビデオを参照してください）。 E.ボクセルは、3D（D）にファジーであるため、3Dレンダリングされた等値面表面はサンゴポリープ表面の輪郭とその文脈を示している隣接ポリープとの取り決め（SIビデオを見てください）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンゴのポリープの図5蛍光顕微鏡。Mの脱灰ポリープの（A）の断面図faveolata（緑色で表示）の青色光の下でクロロフィル自家蛍光と褐虫藻と赤色光の下で撮像されたように（赤で表示）コムギ胚芽凝集素で標識した粘膜のポケットを示す。画像は自動的に二つのチャンネルのタイル張りとステッチと機器ソフトウェアを使用して位置合わせされる。 （B）（A）に示した箱の拡大、個別の藻（それぞれ緑色の円を示し、approximately 6-8緑直径程度）と表面粘液層（赤）と、両チャンネルのマージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
サンゴの蛍光図6二光子分光特性評価。LSM 710システムのスペクトル検出器を使用して、全可視スペクトル（419から722ナノメートル）からの蛍光シグナルは、約190ミクロンの深さにわたって走査した。画像は、zスタックのx軸が5μm深さ間隔を示し、y軸は、10nm間隔（1154周りのイメージを示した合計）で取得されたnmの419から722波長である。一つは、2のスペクトル成分、一つは500nmから650nmの第二に中心を見ることができます。二光子レーザーEXCI780nmのテーション波長を放出プロファイルを得るために使用された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
つのスペクトル成分（A）の図7キャラ背景のスペクトルプロファイル（青）色素胞から、自己蛍光（緑色）および780nmレーザの2光子レーザ励起波長によって励起されたクロロフィル蛍光（赤色）。スペクトルは、マルチスペクトルデータの右側に示す導出重ね放出プロファイルに従って擬似着色。 （B）信号はスペクトルと（A）の画像を導出することを10nm間隔で収集される個別のスペクトルビン。ノート二つの異なるコンポーネント、約500nm（色素胞の自家蛍光）と他の675以上の波長（クロロフィル蛍光）を中心とする1という。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7A及び図7Bに同じ画像8図は、スペクトルデータは、ソフトウェアおよびそれらの対応する発光ピーク/スペクトルを用いて混合されていない。M.両方でannularisとM. faveolata、スペクトル成分は、同様に、それらの発光ピークは非常に類似している。有意差が、しかし、（ 図9を参照）、これらのスペクトル成分とその豊富さの場所によるものである。ghres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Mからサ ンゴのポリープの図9二光子蛍光3D画像annularis（AD）およびM. faveolata（EH）。（AおよびE）は、450〜700ナノメートルから収集された光信号を、二光子レーザーの780nmの励起を使用してコンポーネントのnoスペクトル分離して画像化した。 （BおよびF）は同じ励起（780 nm）を用いて収集したが、二つのPMT検出器は、2つのコンポーネントからデータを収集するために同時に使用された、すなわち 、500〜550ナノメートル（緑色素胞の自己蛍光）および他の650〜から1つ720nmの（赤クロロフィル蛍光）。 （CおよびG）の深さ符号化画像である（BおよびF）は 、赤は浅いと青が2Dで最も深い成分である。 （DおよびH）は、蛍光がサンゴの表面からだけ来ていると骨格は780 nmの励起でのあらゆる蛍光を持っていない示し、それぞれ（BとF）を介して、カットのYZイメージです。 2サンゴの間に色素胞の内容に実質的な違いに注意してください。 M. annularis生息地（0〜10メートルWD）がMよりも浅く、 faveolata生息地（10〜20メートルWD）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10 Oの研究のうち10階層空間構造のパワーズFサンゴ礁の生態系。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SBFIデータや画像解析ソフトウェアを用いて2Photon顕微鏡法のいずれかからレンダリング3Dボリュームと、等値面の作成 に含まれるステップ（AI）を示すSI図1のスクリーンショットは、（材料表を参照）。（A）生の2Dスライス単一の平面を示すスライスモードでのデータ; （B）全ての2Dスライスの3Dボリューム; （C）関心領域（ROI）を選択の領域との等値面作成ウィザード; （D）選択されたバックグラウンド減算でアルゴリズム; （E）は 、閾値はrepresenピクセルを拾うために適用データをT; （F）面の中央のシード点; （G）ボリュームベースのフィルタが破片やノイズの少ない体積を排除するために適用される。 （H）、最終的な3Dレンダリングされた等値面; （I）キーフレームアニメーションウィザードは、SIのビデオのようにムービーを作成します。最終的なレンダリングされた画像は、SIビデオ3-7の両方のボリュームと、等値面のモダリティに示されている。プロトコルは、3.1.3-3.1.5、これらの手順をカバーして繰り返します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 材質/機器 | 会社 | カタログ/モデル番号 | コメント/説明 |
| コーラルティッシュスケルトン | なし | なし | 2.5センチメートルBIOP自然の生息地からSY |
| アーチパンチコアリングデバイス | CSオズボーン·カンパニー | 第149号 | サンゴの生検採取のために |
| パラホルムアルデヒド | 電子顕微鏡学 | RT 15700 | 16％は、事前希釈 |
| Histoclear / Safeclear II | 電子顕微鏡学 | RT 64111から04 | キシレン、脱水やDeparafinizationに対して非毒性の代替 |
| キシレンとエタノール | フィッシャー·サイエンティフィック | フィッシャー·サイエンティフィック | 脱水 |
| パラフィンワックス | リチャード·アレン·サイエンティフィック | タイプH REFは8338 | 浸透液 |
| VYBAR | キャンドルメーカー | なし | レッドワックスの成分 |
| ステアリン | キャンドルメーカー | なし | レッドワックスの成分 |
| スーダンIV | フィッシャーケミカル | S667-25 | レッドワックス不透明な背景 |
| 小麦胚芽凝集素（WGA） | ライフテクノロジーズ | W32466 | サンゴ粘液を標識するための |
| 長引かゴールド | ライフテクノロジーズ | P36095 | アンチフェードマウントメディア |
| フッ素ディッシュ | 世界精密機器 | FD-35〜100 | 二光子イメージングのため |
| XYモーター、ドライバとコントローラ | 林エンジニアリング | 211-13-01R0、R325、R256-RO | XY並進運動 |
| ホットプレート | コーニング | DC-220 | すべてのワックスの融解 |
| 対流式オーブン | 大和 | DX-600 | 浸透と埋め込み |
| ティッシュプロセッサ | ライカ | ASP 300 | |
| ミクロトーム | ライカ | RM2055 | 使い捨てナイフ |
| ステレオ顕微鏡 | カールツァイス | Stereolumar V 12 | 1.5倍（30ミリメートルWD）目的 |
| 余線分と蛍光顕微鏡 | カールツァイス | AXIOVERT M 200、余線分Iシステム | ポリープのイメージング薄いセクション：褐虫藻 |
| Axiocamカメラ | カールツァイス | MRM | モノクロカメラ1388x1040ピクセル |
| Axiovisionソフトウェア | カールツァイス | バージョン4.8 | 画像取得プログラム |
| 二光子レーザー | Spectraphysics | マイタイEHP、パルスレーザー（70 fs）を | DeepSeeのモジュールを使用 |
| レーザー走査顕微鏡 | カールツァイス | スペクトル検出器を用いてLSM 710 | 34チャンネルのPMT検出 |
| 禅ソフトウェア | カールツァイス | 2010以上 | 二光子分光画像取得のための |
| Imaris Suiteソフトウェア | ビットプレーン社、 | バージョン7.0以上 | 3Dボリューム、等値面レンダリング、ビジュア |
本研究で用いた表1鍵材料、装置、顕微鏡、およびソフトウェア。
SIビデオ1。 その場水中フィールドの映像ではMの12メートルWDでサンゴの生息地を示すプラヤカルキ、キュラソーでfaveolata。
SIビデオ2。 Fi回線に示す3Dレンダリングされた画像の個別の2Dシリアルブロックの顔画像グレの4E。
SIビデオ3。等値面の3Dレンダリングされたシリアルブロックされた顔画像は、サンゴポリープの地形を示す図4EとSIビデオ1に示す。
SIビデオ4。サンゴポリープM.の3Dボリュームレンダリングされた生データを二光子顕微鏡像faveolata。励起は780nmで二つのバンド褐虫藻のための幅（疑似色の赤、600-700 nm）であり、色素胞（疑似色の緑、500〜550 nm）を同時に捕捉した放出である。
SIビデオ5。サンゴポリープM.の等値面スポット二光子顕微鏡画像でレンダリングされた3Dボリュームfaveolata。励起は780nmで二つのバンド褐虫藻のための幅（疑似色の赤、600-700 nm）であり、色素胞（疑似色の緑、500〜550 nm）を同時に捕捉した放出である。
SI映像6。サンゴポリープM.の3Dボリュームレンダリングされた生データを二光子顕微鏡像annularis。励起は780nmで二つのバンド褐虫藻のための幅（疑似色の赤、600-700 nm）であり、色素胞（疑似色の緑、500〜550 nm）を同時に捕捉した放出である。
SIビデオ7。サンゴポリープM.の3Dボリュームレンダリング等値面スポット二光子顕微鏡像annularis。励起は780 nmおよび褐虫藻のための2つの帯域幅で同時に捕捉される放出（psですeudo色の赤、600-700 nm）であり、色素胞（疑似色の緑、500〜550 nm）を。
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Discussion
サンゴ礁研究は同時物理的、化学的、および海洋環境で動作する生物学的現象の分析を含む、高度に学際的な研究努力である。複雑なサンゴ礁生態系の研究は、そのための最良のコンテキストフレームワーク（ 図10）「10の累乗」で終了する。このグラフィックコンパイルはサンゴ生態系が空間次元（10 -9 5〜10メートル）の広い範囲をカバーすることを示している。また、この演習はgeobiologicalがフィールドを結合し、実験室分析するために必要なブリッジである1ミリメートル-1cmの中間の長さスケールで解析することを示している。テンフレームワークのこのパワーズは、実験のためのコンテキストである分析し、モデリング、物理的、化学的合成、およびキュラソーサンゴ礁生態系を制御する生物学的パラメーター。
本研究は、完全に統合されたスイートoを適用する最初のものですF、FM、SBFIおよびCLSM技術が増加し、水深に見かけ上健康なサンゴの反応を追跡する。画像全体の組織または厚い生物学的サンプルが利用可能な光学顕微鏡ツールは、吸収、散乱、および他の現象を含むサンプル自体がもたらす光学的な制約、さまざまに限られていた。ただ、最後の10年以内に、SBFI走査電子顕微鏡は、いくつかの生物学的サンプルの広視野ベースSBFIイメージングを用いて、超高解像度の31だけでなく、光顕微鏡イメージングで使用した。これは、脳から心臓全体組織と、地面、研磨したラベルされた骨を含む偶数サンプルにすべての分析が含まれており、各セクションは23〜29とした後に、同時に画像化されています。最近では、蛍光および共焦点顕微鏡は、生物学的サンプル32-33に輪郭、形状、およびタンパク質および顔料の分布を明らかにするために使用した。しかし、個別のサンゴのポリープヘクタールの立体構造dは以前に解決されていません。炭酸カルシウムが浸潤に適したサンプルをレンダリングし、定期的なミクロトームを用いて切片化前に除去しなければならないようにサンゴのサンプルを用いたSBFIための前提条件は、脱灰です。
二光子蛍光顕微鏡は、そのユニークな二光子励起現象に起因する生物学的組織の分析のために必須となるところである。これは脱灰工程が効果的非線形2光子励起現象34に排除された本研究におけるサンゴの組織の拡張深さ浸透33-34につながった。また、二光子レーザーによる事前補償モジュールは、はるかに短いパルス幅、さらに改善された浸透深さを提供した。炭酸カルシウムは、780 nmの近赤外光を吸収しないので、サンプル側に、深さの浸透は、対物レンズの作動距離によって典型的に制限される。さらに別の欠点は、OFの脱灰とサンゴ骨格の除去は、試料が、複数の脱水および再水和のステップを経て、水を含まないワックスに包埋した後に組織体積推定値がさらに困難になり、サンゴ組織の構造的完全性の喪失である。これにより、処理の前および後の両方サンゴ組織体積を決定することの重要性を強調している。
サンゴの蛍光タンパク質の共焦点特徴付けは、グレートバリアリーフのサンゴのために完了し、保護スペクトル特性は、サンゴの生息地32の深さと相関している。しかし、本研究でわれわれは、口腔組織を除い深海サンゴでどこでも胞の実質的な減少があることを二光子顕微鏡を用いて初めて実証する。また、色素胞に対する褐虫藻の分布の明確な変化がMに奥行きトランセクトまたがっ観察されているannularis、機種では電子浅海サンゴ組織を完全に色素胞で覆われている。高倍率画像（ 図8C及び8D）によって提供される解像度で、今正確に藻によって取り込ま面積および体積を定量化することができ、かつそれらの組織密度比は、他の細胞成分に対して決定することができる。まとめると、本研究におけるSBFIの統合と二光子蛍光スペクトルイメージングは、サンゴの組織の形態や構造に極めて重要な新しい洞察が得られている。このデータは、個別のポリープレベルまたは全体サンゴの頭の上に植民地ポリープとの間の相互作用の文脈レベルのいずれかで、サンゴの組織の各成分を定量化するのに役立ちます。このコンテキストは現在、定量的に追跡し、予測される海面の水深や照度の変化に対するサンゴholobiontの適応応答を可能にするであろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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