Summary
一个集成的成像技术套件已经被应用于确定息肉形态学和组织结构在加勒比海珊瑚Montastraea annularis和M. faveolata。荧光，串行块面，和双光子激光扫描共聚焦显微术已经确定叶形结构，息肉墙壁，和估计的色素细胞和虫黄藻密度和分布。
Abstract
一个集成的成像技术套件已经被应用来确定三维（3D）的形态学和细胞息肉组织结构，包括加勒比礁珊瑚Montastraea annularis和M. faveolata。这些方法包括荧光显微技术（FM），串行块面成像（SBFI），和双光子激光扫描共聚焦显微镜（TPLSM）。 SBFI提供物理切片后深层组织成像;它详细说明了组织表面纹理和三维可视化到组织的深度超过2毫米。组织细胞结构的互补性调频和TPLSM产量的超高分辨率图像。结果：（1）确定的个别珊瑚虫的外壁和先前未报告叶形组织的形态（2）创建的色素细胞和藻类状藻虫黄内共生体的三维分布和组织密度的第一表面上的地图。光谱吸收豌豆500 nm和675 nm的KS，分别提示M. annularis和M。 faveolata包含相似类型的叶绿素和色素细胞的。然而，M annularis和M。 faveolata呈现的组织密度，对这些关键细胞成分的三维分布显著差异。本研究着重于影像学方法表明SBFI是对脱钙珊瑚组织大型毫米级样品的分析非常有用。免费FM和TPLSM揭示nondecalcified珊瑚组织样本中的细胞分布和密度微妙的亚毫米尺度的变化。该TPLSM技术能提供：（1）微创样品制备，（2）优良的光学切片的能力，以及（3）最小的光的吸收和散射，同时仍允许深部组织成像。
Introduction
全球变暖和相应的环境变化都直接影响热带海洋珊瑚1-4的健康和分布。多重影响正在被观察到，包括珊瑚白化和传染病5-6的出现。然而，未来的珊瑚应对这些环境威胁更准确的预测将需要进行组织学“基线”成立，它定义了组织形态和细胞的组成和分布“看起来健康”的珊瑚。反过来，“影响”珊瑚然后可以定量比较。此外，该基线应建立在外表健康的珊瑚在各种环境条件下，使“健康反应”也可以跨越环境梯度来衡量。由于对建立这一基础的第一步，高分辨率3D已开展研究如何看起来健康的珊瑚虫组织形态和细胞成分响应增加水深（WD）和随附的跌幅在阳光辐照度。结果可以用来确定珊瑚适应更全面的机械理解，以及深入了解珊瑚共生演进和捕光增强。
石珊瑚（ 石珊瑚 ）是殖民地的海洋无脊椎动物中发挥主机到复杂的组合等微生物，统称为珊瑚holobiont 7-10。在本研究中所进行的研究旨在利用一套先进的成像技术，同时跟踪随水深组织颜料和看起来健康的宿主珊瑚共生的虫黄藻的变化。这将建立所需要的比较组织细胞的“基线”跨越水深梯度看起来健康的珊瑚，并作为珊瑚老天指标LTH 10。珊瑚色素，称为色素细胞 ，起到吸收，反射，散射，折射，衍射，或与入射太阳辐射11以其他方式干扰。虫黄藻，色素细胞内共生关系，使中高屋建瓴捕光优化和骨骼成长战略的协同进化，以及营养的可塑性（移喂养策略回来的往复从自养到异养）的珊瑚动物12。
库拉索岛南部的加勒比海岛国（荷属安的列斯以前部分）位于委内瑞拉以北约为65公里，东西走向的阿鲁巴岛香格里拉Blanquilla群岛（ 图1A）内。库拉索岛的70公里长的南海岸包含一个连续的现代化和中新世-上新世-更新世-全新世古岸珊瑚礁道13,14。年平均海温的变化库拉索岛约3℃的nually，从一月下旬最低26℃，最高29℃，在九月初，有27.5±0.5ºC的年平均温度（NOAA海温资料集2000-2010）。珊瑚礁的Playa Kalki（12°22'31.63“N，69°09'29.62”W），躺在库拉索（ 图1A）的西北尖端，被选为抽样，因为它之前已经充分研究和在这个位置上的海洋生态系统正沐浴在清新无污染海水中7,15-19。 。两个密切相关的石珊瑚物种，M. annularis和M faveolata，被选择用于实验和分析在本研究中，因为每个物种：（1）相对于所述货架断和上礁道呈现明显不同的和不重叠的等深线分布相关的碳酸盐沉积的沉积环境（M. annularis范围= 0-10米的WD; 米faveolata范围= 10-20米WD 20; 图1B，2A和2B）; （2）在整个加勒比海21一 个共同的珊瑚礁框架构建;和（3）具有充分研究的生态，生理和进化关系22。
现场取样本研究采用离岸滩Kalki库拉索岛的标准水肺潜水技术进行的。浅到深的水中测深断面成立跨架子跑了，过了保质突破，并进入深水区前礁环境。显然，健康的珊瑚头，然后确定了采样沿着这条测深断面，其中包括：（1）三个人约1米直径的珊瑚M的头annularis，所有这些都是以5m水深度（WD）; （2）三个独立的约1米直径的珊瑚M的头所有这些faveolata，是在12米WD。光合有效辐射（PAR）的测定为33-36％的PAR为5m的WD和18-22％的PAR以10米的WD。采样是在1月进行，当海温为26℃时的水深均5米和12米每六珊瑚头进行采样，一式三份，在同等空间位置（ 即约45°北纬每六个半球状珊瑚头）。每个单独的样本包括收集与清洗拱冲，一个直径为2.5厘米的珊瑚组织构架核心活检。三珊瑚组织，骨骼活检取样标准潜水用戴手套的手从每个珊瑚头（从9 米annularis为5m的WD殖民地，从9 米faveolata在12米WD）。后立即收集在深度，每个活检核心样品置于无菌50毫升聚丙烯离心管中，螺旋盖密封，并返回到表面。海水从每个离心管中倾出，每个核心活检后，浸渍，储存，并在4％多聚甲醛输送。
23-30的进行。这些研究大多利用光/光镜带任何荧光或明场技术。然而，研究已经在利用扫描电子串行块面成像，在过去的31超高放大倍率进行。在本研究中，修饰SBFI协议已被开发用于与施加到珊瑚首次。由于M。 annularis和M。 faveolata珊瑚虫是1-2毫米的厚度，没有任何的常规光显微技术将能够穿透珊瑚息肉组织的整个厚度。因此，我们有专门为珊瑚样本设计SBFI样品制备协议。此外，我们的定制设计了立体支架，该机动化地在X和Y两个方向上移动。该装置采用的样本的块面的图像，而不是使用常规的切片在显微镜的前收集的部分。我们还介绍了另一种非线性光学双光子显微技术将图像的同一珊瑚虫整个珊瑚组织的整个厚度。这克服了由SBFI在脱钙的术语，并且可以由样品制备（脱水）和处理协议来诱导组织的形态和容积（收缩）的变化的可能性，所施加的限制。此外，从珊瑚排放剖面，光谱分辨识别色素细胞和虫黄藻光合作用的高峰排放量和变化。这些结果在使用该方法的情况下和其有关的采集时间个别的优点，分析时间，并解决精细结构细节不损害str中的能力进行了评价珊瑚组织uctural完整性。
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Protocol
被珊瑚样品的连续块面成像试剂准备：注意
1 Preinfiltration蜡
- 熔融3.6克硬脂薄片在玻璃烧杯中。在热板（60-70℃）拌匀。
- 添加400毫克苏丹红四号的（最小化蜡背景荧光）。搅拌均匀，等到红色半透明的解决方案来实现的。
- 新增96毫升热熔融石蜡（100％），搅拌均匀。
1.2）嵌入蜡
- 熔体7.2克硬脂精片的玻璃烧杯中搅拌均匀的热板（60-70℃）。
- 添加0.8克苏丹四。搅拌均匀，等到红色半透明的解决方案来实现的。
- 添加石蜡粒（161克），搅拌至融化石蜡完全。
- 加入30克白色粒状VYBAR并在相同的烧杯中完全熔化;一旦融化，混匀。
- 松散关闭有盖的玻璃瓶。将玻璃瓶在60℃对流OV烯以保持各组分在液体状态。开展这一炉的所有渗透。
- 分裂200毫升红蜡的总体积中，以两片玻璃瓶每次100毫升。使用一个等分试样进行渗透，另一个用于最终嵌入。
1.3）嵌入珊瑚组织的串行块面成像
- （在4-5℃，在多聚甲醛3-6个月）在磷酸盐缓冲盐水（3×5分钟）洗涤收集在字段（SI视频1），并存储在珊瑚虫和脱钙当准备进行成像。除垢在ExCal解决方案息肉24小时，或者直到为息肉是完全没有的CaCO 3。培育若干脱钙珊瑚虫为单块的25，50，75，和100％的乙醇系列，其次是1X二甲苯替代品脱水的样品。
- 将处理过的息肉含100％二甲苯代替预热65℃的烘箱。樟宜孵育30分钟两次ng到新鲜的解决方案。定向成这样的息肉的息肉的顶端朝下，顶表面是尽可能平坦。
- 使2解决方案：1，1:1和1:2二甲苯替代品和preinfiltration蜡（步骤1.1）在50毫升猎鹰管。
- 孵育珊瑚虫与这三个浓度增加preinfiltration蜡中，随后3次温育在100％preinfiltration蜡，每次30-60分钟。
- 注意：根据样品的厚度，步骤1.3.1-1.3.5可以随时间较长。
- 将样品包埋蜡（见步骤1.2.6）在100％preinfiltration蜡3×孵育后。
- 30分钟后，取出嵌入蜡。更换新鲜嵌入蜡，继续培养至少4小时在65℃。
1.4）在红蜡嵌入
- 拍摄所述块（不锈钢托盘，其中的白色蜡放置并在其顶部的SAMPLE放置）。这是必要的，因为一旦嵌在蜡中，样品的位置将变得不可见的嵌入红蜡是不透明的。
- 放置小滴的高熔点蜡围绕新的预热的不锈钢包埋模具并使其冷却。如步骤1.2.6声明倒入少量从第二个容器新鲜融化的石蜡包埋的。
- 位置朝下在白蜡点很快的珊瑚虫，然后放置一个塑料的样品架的不锈钢托盘上，倒更嵌入蜡，使得蜡过来对塑料模具的表面上。
- 以整个安装了65℃烘箱中，并允许它在长凳或阴凉表面冷却，直到蜡完全变硬。
- 这可能需要6小时，最多两天。放置在4℃下干燥处理的冰箱挡，避光，长期储存。
1.5）切片的串行块面设置
- TR即时通讯块切成1微米的部分用切片机。不收的部分，因为它们会变成粉末。请记住，我们只是成像的块面。样品在白色蜡开始消失出现。
- 捕捉到光滑的块面，其中包含的样本部分被删除，每次的图像。继续下去，直到珊瑚虫消失在SI视频2。
- 用FITC标记的荧光滤镜拿起自动荧光色素细胞/珊瑚虫的录制/撷取用黑白摄像机的图像。图片来自每个品种3-4脱钙核心。
2，成像珊瑚在双光子荧光显微镜
- 修复珊瑚虫核心，以收集（海边）网站每个包含大约10-12息肉直径约一英寸，在4％多聚甲醛，只要它们在水中收获。
- 保持样品在4°C，直到成像。洗涤芯被放置在第ê同一个解决方案中的玻璃盖底部盘倒挂（0.17毫米厚）。
- 利用双光子激光在使用10X（0.3 NA）的物镜780 nm激发，像3-4息肉两种不同的放大倍率（数码变焦）。珊瑚息肉形状和高度的样品（通常为1-2毫米），该成像深度之间的差异也只限于通过成像物镜的工作距离。
- 使用瓦片扫描模式收集约25-100（5×5或10×10瓦）到z轴中的xy每焦平面图像和50-100的图像10或20微米的间隔，总数约为5,000-10,000的图像/珊瑚虫。
- 图片三时五十七息肉领域，代表了核心和珊瑚的物种。注：2-5小时/息肉区域之间的图像采集时间不同。
- 存储原始数据格式的所有图像在系统的硬盘作为LSM 5渲染3D在3D图像的分析和渲染软件。
3，三维体绘制与可视化ÑSBFI和双光子荧光光谱数据
- 裁剪二维数据通过专注于一个单一的息肉用在程序中广场裁剪工具，以减少文件大小和编译成一个单一的TIFF文件（减小文件的大小也通过保存在8位格式的文件）的采集软件。
- 在程序中了Imaris超越模块下的体积算法打开SBFI数据的汇编文件（收集步骤1.5.1）或平铺多个z栈的双光子光学部分（收集步骤2.1.4）。
- 项目中使用了一层阴影投射在3D渲染的SBFI数据。创造一个体素是阈值化创造了坚实的表面图案（SI视频3）的等值面模式。
- 使用可视化的剪取平面算法在XY，XZ的3D投影和YZ正交模式，揭示珊瑚三维结构和形状。
- 在相同了Imaris程序使用关键帧动画模块的动画投影（SI六DEOS 3-7）。
- 生成的视频文件，在5％的压缩和使用量生成AVI格式的影片剪辑（SI影片4和6），三维等值面和方式（SI视频5和7）。
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Representative Results
定制设计的SBFI设备（专门针对本研究制造; 图3）产生的第一个详细的三维数字高程外表面质感的米和形态的地图（数字高程模型） annularis和M。 faveolature珊瑚虫（ 图4和SI视频1-2）。此得到的珊瑚组织同心地从每个息肉（ 图4B，4D和4E）的中心向外辐射的先前未描述的堆叠凸起的图像。这些瓣沿堆叠组织覆盖中小学骨骼隔的最高山脊，与径向最外侧和最下层的高度叶最终合成和息肉之间的共肉组织合并。三维息肉形状和关联瓣被保存完好，尽管通过若干步骤的高温渗透和嵌入有消失的珊瑚组织样本。在additioÑ苏丹染料的成功掩蔽的背景为不透明的，与黑颜色具有有助于最大化各样品的对比度和提高信号噪声比。三维和正交平面的观点表明沿z轴（ 图4B）的荧光成分的分布。有飞机用蜡片，有时掩盖息肉表面细节，这在创建预测时，被拆除的清晰度。该技术的主要优点是在揭示任何厚的样品的内部细节，因而无需采取多个部分并对齐它们在以后的时间。此外，当收集的（ 图4A），从达到10毫米或更大的样本大小，提供高达1微米AZ分辨率在该技术中的图像已对准的（取决于该块保持器中的切片机的总行驶距离）。它可以识别不同的自体荧光部件（使用多个过滤器），以及个人虫黄以较高的放大倍率，所提供的视图的缩小字段是可以接受的。
该ApoTome光学切片荧光显微镜发现珊瑚的组织细胞（虫黄藻和色素细胞）和表面组织结构，在亚毫米分辨率的分布情况。因此，在6-13微米直径虫黄藻可以容易地识别和量化，相对于每组织体积的细胞数（ 图5）。利用叶绿素荧光（绿色）和标记有WGB的Alexa 647的粘液的双通道图像采集（以红色显示），制作最好量化粘液内的息肉的给定位置的水平和虫黄藻的数量（主要和次要息肉隔，可以单独计算）。
除了这些显微镜的方法，我们还应用TPLSM，非线性技术广泛用于厚的生物样品。 TPLSM以上的主要优点电子光子连续波激光器是：（1）激发仅仅发生在焦点的点，因为激发光强度的功率变得平方和分子的机会吸收连续两个光子激发一个电子从所述荧光团是有限到物镜的景深，从而提供了一种固有的共焦。和（2）其结果不会有损失的激发光子的同时穿透更深的样品，相对于单光子激光器。此外，大多数生物组织样品也吸收可见光。由于双光子激发固有地长（在780 nm的近红外），则吸收也基本上最小化。另一方面，珊瑚骨架碳酸钙组成几乎没有吸收或散射的双光子光。最后，由于我们感兴趣的是确定只在珊瑚骨骼的轮廓表面物体的分布，我们发现使用这种方式更深入版成像Ÿ适合珊瑚的成像。
我们已经试图在分枝的可用光谱特征表征annularis（ 图6-9）。这里，我们表明，780nm的双光子激发下，色素细胞的自发荧光具有约500纳米的峰，而来自共生藻叶绿素荧光的中心在大约675纳米（ 图6）。而这个光谱数据（ 图6-7），去混合，也可以用软件中的一个去混合算法（ 图8），由于这两种组分之间存在明显的频谱距离，成像他们同时使用两个检测器在证明2发射带是最节省时间的技术。这一点尤其是当样品平铺拍摄，并在组织的整个1-2毫米的深度。这消除了对物理切片，这需要几个每个位置与样品和息肉千图像。分布Ø F自动荧光色素细胞也是明显的（ 图9）测试的两种珊瑚物种之间。在一个案例中，我们观察到色素细胞在较浅水居住的珊瑚M的显著增加annularis相比，深水M。 faveolata（ 图9和SI画3和4）。
图1（A）的地图库拉索岛南部加勒比海 ，显示岛内的远西北部背风海岸研究现场的Playa Kalki的位置。 （ 二）珊瑚礁镶边货架的Playa Kalki库拉索岛的横截面示意图，显示米的水深分布annularis和M。 faveolata。尔斯/ ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2（a） 在原位的水下现场照片在12米WD M的faveolata的Playa Kalki，库拉索岛（B）关闭了图像的放大在（a）显示M的个体珊瑚虫faveolata在白天光照条件下（每息肉大约为2毫米的直径，其中一些被收回，记为*）。 请点击这里查看该图的放大版本。
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图3串行块面成像仪器 。 （A和B）的定制设计的显微镜保持器，保持Stereolumar显微镜在180℃面向样品放置在切片机的块面。当被删除的每个部分，该块脸图像被捕获的目标和2D数据以数字方式存储。这样做，直到在块中的样品消失。在显微镜被移动在x和使用的机动导螺杆和Z Y方向，进行调整，以聚焦样品。要注意的是，当每1微米的样品切片，块移动1微米前进，所以再聚焦范围是很重要的是没有必要的。 XYMOT，定制XY平移机动阶段; FLS，荧光光源;吨，切片;麦克风，体视显微镜; CAM，Axiocam黑白摄像机; BH座架;高炉，块面的样品; FLL，在块面荧光灯激发点; OBJ，显微镜物镜;髋关节，人机接口面板。在单色模式下1388（水平）×1040（垂直）像素的尺寸一个图像采集在XY像素（单）号决议的1.25微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
图4串行块面珊瑚M的影像annularis和M。 faveolata距离Playa Kalki，库拉索。收集（一 ）样本数据集画廊展示在Z 1微米的分辨率从息肉获得独立的2D图像约800图像。 （二 ）在另一个珊瑚样本，切片就超过2,000微米Z轴。图像阴影下的投影显示多发性息肉所有2D片和编译到一个3D体积使用了Imaris量可视化算法。 （C）的正交投影示出了样品中的（B）的xz视图，可以看到在样品的整个深度超过2mm，而箭头表示，其中由于质量差除去二维切片的黑线;这个形象是从M。 annularis。 3D体积（D），等值面绘制（E）和可视化SBFI数据。 （D）多个珊瑚虫示出在上侧和中间的单个息肉的三维体积（阴影投射）纵截面的息肉形态学。切片和可视化在任何角度，可以在三维（见SI视频 ）。 E.由于体素是模糊的三维（D）所示 ，在三维等值面呈现的表面显示珊瑚息肉表面和其上下文的轮廓与相邻的息肉（见SI视频 ）的安排。 请点击这里查看该图的放大版本。
图5荧光珊瑚虫的显微镜。（A）M的脱钙息肉的横截面faveolata表现出与虫黄藻在蓝光下的自发荧光的叶绿素（绿色显示）和标记麦胚凝集素（显示为红色）粘膜口袋在红光下的成像。该图像被自动平铺在两个信道和缝合和使用仪器的软件对齐。 （ 二）扩大了框（A）所示，显示个别虫黄藻（每个绿色的圆圈，approxi的三方共同6-8微米，直径为绿色）和表面粘液层（红色），和两个通道的合并。 请点击这里查看该图的放大版本。
图从珊瑚荧光的6 -双光子光谱表征。使用LSM 710系统的光谱检测器，从整个可见光谱（419-722纳米）的荧光信号进行扫描，约190微米的深度。该图像示出了深度间隔在5μm的X轴为Z轴堆叠和y轴是波长在10nm的间隔（共围绕1154的图像显示）获取的波长从419-722。可以看到这两个频谱分量，1为中心在500nm和第二650nm处。双光子激光EXCI780纳米波长的塔季翁来获得排放曲线。 请点击这里查看该图的放大版本。
两个频谱分量的图7特性：（A）的背景（蓝色）的频谱轮廓，从色素细胞（绿色）和叶绿素荧光（红色）通过780nm的激光的双光子激光激发波长激发自体荧光。光谱导出显示在右侧的多色光谱数据的叠加和伪色的按照发射信息。 （B）在该信号被收集在10纳米间隔导出的光谱和在（A）中的图像的每个谱箱。注这两个不同的组成部分，一是集中在大约500纳米（色素细胞自发荧光）和其他超过675海里（叶绿素荧光）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图8在图7A和7B中相同的图像，谱数据未混合使用的软件和它们相应的发射峰/光谱。在这两种分枝annularis和M。 faveolata，频谱分量是非常相似的，以及它们的发射峰。该显著差异，但是，是由于这些频谱成分和其丰度的位置（参见图9）。ghres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图9双光子荧光3D从M.珊瑚虫的图片annularis（AD）和M。 faveolata（EH）（A和E）进行成像以使用双光子激光的780nm的激发组分的无光谱分离，从450-700纳米采集的光信号。 （B和F），收集具有相同的励磁（780毫微米），但有两个光电倍增管检测器同时被用来收集从两个部件中的数据，即 ，一从500-550纳米（绿色色素细胞的自发荧光）和其他650- 720纳米（红色叶绿素荧光）。 （C和G）的深度图像编码（B和F），红色是浅的蓝色是2D最深的组成部分。 （D和 H）的切口，通过分别YZ图（B和F）中 ，示出了荧光，从珊瑚的表面只有到来和骨架不具有在780nm的激发任何荧光。注意，在这两个珊瑚之间色素细胞含量显着不同。 分枝annularis栖息地（0-10米WD）小于M。浅faveolata栖息地（10-20米WD）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图10的研究O十大层次空间结构的权力˚F珊瑚礁生态系统。 请点击这里查看该图的放大版本。
SI图1的屏幕截图显示参与创建三维体积和等值面无论从SBFI资料或使用图像分析软件2Photon显微镜呈现的步骤（AI）（见资料表）。（一）原料的2D片在片模式下的数据呈现出单一的平面; （B）所有的二维切片的三维体积; （ 三）与选定的感兴趣区域（ROI）的区域中的等值面创建向导; （D）的算法选择的背景减除; （ 五）阈值应用到拿起像素的代表中吨的数据; （六）中央种子点的表面; （G）的体积基于应用滤波器，以消除碎屑和噪音较小的体积; （H）呈现的等值面上的最终三维; （ 一）关键帧动画向导创建的电影，在SI的影片。最终渲染图像示于的SI画3-7两卷和等值面的方式。该协议的步骤3.1.3-3.1.5介绍了这些程序。 请点击这里查看该图的放大版本。
| 材料/设备 | 公司 | 目录/型号 | 评论/说明 |
| 珊瑚骨骼组织 | 无 | 无 | 2.5厘米BIOP从自然栖息地SY |
| 凯旋门冲床取芯设备 | CS奥斯本和公司 | 149号 | 珊瑚活检集合 |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学 | RT 15700 | 16％预稀释 |
| Histoclear / Safeclear二 | 电子显微镜科学 | RT 64111-04 | 无毒的替代品二甲苯，脱水和Deparafinization |
| 二甲苯，乙醇 | 飞世尔科技 | 飞世尔科技 | 脱水 |
| 石蜡 | 理查德·艾伦科学 | H型对照8338 | 渗透液 |
| VYBAR | 该蜡烛制造商 | 无 | 红蜡的成分 |
| 硬脂 | 该蜡烛制造商 | 无 | 红蜡的成分 |
| 苏丹红四号 | 费舍尔化工 | S667-25 | 红蜡，不透明的背景 |
| 麦胚凝集素（WGA） | Life Technologies公司 | W32466 | 用于标记珊瑚粘液 |
| 延长黄金 | Life Technologies公司 | P36095 | 防褪色的安装介质 |
| 氟菜 | 世界精密仪器 | FD-35-100 | 对于双光子成像 |
| XY电机，驱动器和控制器 | 林工程 | 211-13-01R0，R325，R256-RO | XY平移运动 |
| 热板 | 康宁 | DC-220 | 熔蜡全部 |
| 对流烤箱 | 大和 | DX-600 | 渗透和嵌入 |
| 组织处理器 | 徕卡 | ASP 300 | |
| 切片机 | 徕卡 | RM2055 | 一次性刀 |
| 体视显微镜 | 卡尔蔡司 | Stereolumar V 12 | 1.5倍（30毫米WD）目标 |
| 荧光显微镜ApoTome | 卡尔蔡司 | Axiovert M 200，ApoTome I系统 | 成像的息肉薄款：虫黄藻 |
| Axiocam相机 | 卡尔蔡司 | MRM | 黑白摄像机1388x1040像素 |
| 的AxioVision软件 | 卡尔蔡司 | 版本4.8 | 图像采集程序 |
| 双光子激光 | Spectraphysics | 茅台酒EHP，脉冲激光（70 FS） | 随着DeepSee模块 |
| 激光扫描显微镜 | 卡尔蔡司 | LSM 710与光谱检测 | 34通道光电倍增管检测 |
| 禅宗软件 | 卡尔蔡司 | 2010或以上 | 对于双光子和光谱图像采集 |
| 了Imaris Suite软件 | 位平面公司， | 版本7.0或以上 | 三维体积，异面绘制，可视化 |
表1中的关键材料，设备，显微镜，和软件在本研究中使用。
SI视频1。 原位的水下现场视频显示珊瑚栖息地12米WD M的faveolata的Playa Kalki，库拉索岛。
SI视频2。在网络显示的3D渲染图像的单个二维连续块的人脸图像gure 4E。
SI视频3。等值面3D渲染序列块面部图像呈现在图4E和SI视频1显示了珊瑚虫的形貌。
SI视频4。的珊瑚虫M的三维体积渲染的原始数据，双光子显微镜图像faveolata。激发为780nm并且同时捕获两个频带宽度为虫黄（伪色的红色，600〜700纳米）和色素细胞（伪色的绿色，500〜550纳米）的辐射。
SI视频5。在等值面斑3D体积呈现的珊瑚虫M的双光子显微镜图像faveolata。激发为780nm并且同时捕获两个频带宽度为虫黄（伪色的红色，600〜700纳米）和色素细胞（伪色的绿色，500〜550纳米）的辐射。
SI视频6。的珊瑚虫M的三维体积渲染的原始数据，双光子显微镜图像annularis。激发为780nm并且同时捕获两个频带宽度为虫黄（伪色的红色，600〜700纳米）和色素细胞（伪色的绿色，500〜550纳米）的辐射。
SI视频7。 3D体绘制等值面斑双光子显微镜的珊瑚虫M的图像annularis。激发为780nm，并在两个带的宽度为虫黄（ps的同时捕获的发射eudo色红，600〜700纳米）和色素细胞（伪色绿，500〜550纳米）。
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Discussion
珊瑚礁研究是一个高度跨学科的研究工作，包括分析，同时物理，化学和生物现象工作在海洋环境。复杂的珊瑚礁生态系统的研究中上下文框架（ 图10）中的“十国”，因此最好的完成。此图编制说明，珊瑚生态系统涵盖了广泛的空间尺寸（10-9至10 5米）。此外，这次演习表明地球生物学在中间长度比例为1毫米1厘米分析是结合现场和实验室分析所需的桥梁。十大框架这是权力的背景下进行的实验，分析，建模和综合的物理，化学，以及控制库拉索岛珊瑚礁生态系统的生物参数。
本研究是首次应用完全集成套件Ø˚F调频，SBFI和激光共聚焦显微镜技术来跟踪表面健康的珊瑚，以增加水深的响应。可将图像的全部组织或厚的生物样品光学显微镜工具已经因各种各样的由样品本身，它包括吸收，散射，以及其他现象所造成的光学条件的限制。在刚刚过去的十年中，SBFI扫描电子显微镜使用几种生物样品的基于宽视场成像SBFI用于超高分辨率31以及光显微成像。这包括了从脑到整个心脏组织甚至含有骨骼进行研磨，抛光，标记的样品的分析，并成像在之后的每个部分被制成23-29在同一时间。最近，荧光和共聚焦显微镜用于揭示的轮廓，形状，以及蛋白质和颜料分配生物样品32-33中。然而，个别的珊瑚虫公顷的三维结构ð以前没有解决。珊瑚样品SBFI前提是脱钙，如碳酸钙，必须使服从渗透的样本，并利用常规切片机切片之前被删除。
这是其中的双光子荧光显微镜变为必不可少的生物组织的分析，由于其独特的双光子激发的现象。这导致了珊瑚组织在本研究中，其中脱钙步骤被有效地消除了扩展深度渗透33-34由于非线性双光子激发的现象进行34。此外，用双光子激光的预补偿模块提供更短的脉冲宽度，其还改善了渗透深度。在样品上侧，由于碳酸钙不会在780nm处吸收的近红外光，穿透深度是由物镜的工作距离通常限制。还有一个缺点Ø˚F脱钙和去除珊瑚骨架是的珊瑚组织，这使组织体积的估计更为困难后的样品已经通过多个脱水和再水合步骤消失，在不含水的蜡包埋的结构完整性的丧失。这强调前和处理后确定的珊瑚组织体积的重要性。
珊瑚荧光蛋白的共焦特性已结束对大堡礁珊瑚和保护的光谱特性已经被关联以珊瑚栖息地32的深度。然而，在本研究中，我们表现出的第一次使用双光子显微镜，有一个显着减少色素细胞的无处不在深水珊瑚除了在口腔组织。此外，不同的变化，虫黄相分布的色素细胞已穿过深度断面观察到M。 annularis，wherE中的浅水珊瑚组织被完全覆盖色素细胞。与由高倍率成像（ 图8C和图8D）中提供的分辨率，现在我们可以精确地量化由共生藻所占用的面积和体积，以及它们的组织密度比可以相对于其它细胞组分来确定。两者合计，SBFI的整合和双光子荧光光谱成像在本研究中已经取得了非常重要的新的见解的珊瑚组织的形态和结构。这个数据将帮助量化珊瑚组织的各个部件，无论是在单个息肉水平或在殖民息肉之间相互作用对整个珊瑚头的上下文级别。这种情况下，现在将允许珊瑚holobiont对海平面变化的水深和光照的适应性反应进行量化跟踪和预测。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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