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Environment

Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude

doi: 10.3791/51824 Published: September 5, 2014

Summary

Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewandt, um Polypen Morphologie und Gewebestruktur in der Karibik Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Fluoreszenz, Serienblock Gesicht und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen haben gelappten Struktur, Polypen Wände, und die geschätzte Chromatophoren und Zooxanthellen Dichten und Verteilungen identifiziert.

Abstract

Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewendet, um die dreidimensionale (3D) Morphologie und Zellstruktur der Polyp Gewebe, die die Karibik Riff Gebäude Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Diese Ansätze sind Fluoreszenzmikroskopie (FM), serielle Blockfläche Bildgebung (SBFI) und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen (TPLSM). SBFI bietet tiefe Gewebe-Bildgebung nach körperlicher Schnitte; es beschreibt die Gewebeoberfläche Textur und 3D-Visualisierung, um Gewebetiefen von mehr als 2 mm. Ergänzende FM und TPLSM Ausbeute ultra-hochauflösende Bilder von Gewebezellstruktur. Ergebnisse: (1) bisher nicht gemeldet gelappten Gewebe identifiziert Morphologien an der Außenwand der einzelnen Korallenpolypen und (2) hat die ersten Oberflächenkarten der 3D-Verteilung und Gewebedichte von Chromatophoren und Algen-wie Dinoflagellaten Zooxanthellen Endosymbionten. Spektrale Absorptions Erbseks von 500 nm und 675 nm, legen nahe, dass M. annularis und M. faveolata enthalten ähnliche Arten von Chlorophyll und Chromatophoren. Allerdings, M. annularis und M. faveolata signifikante Unterschiede in der Gewebedichte und 3D-Verteilung dieser Schlüssel zellulären Komponenten. Diese Studie mit Schwerpunkt auf bildgebenden Verfahren zeigt, dass SBFI ist äußerst nützlich für die Analyse großer mm-Skala Proben entkalkt Korallengewebe. Kostenlose FM und TPLSM zeigen subtile Submillimeter Skala Veränderungen der zellulären Verteilung und Dichte in nondecalcified Korallen Gewebeproben. Die Technik erlaubt TPLSM: (1) minimal-invasive Probenvorbereitung, (2) überlegene optische Schnitte Fähigkeit, und (3) minimale Lichtabsorption und Streuung, während immer noch erlaubt tiefe Gewebe-Bildgebung.

Introduction

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Die globale Erwärmung und begleitenden Umweltveränderungen werden direkt, die die Gesundheit und die Verteilung der tropischen Meereskorallen 1-4. Mehreren Stößen eingehalten werden, einschließlich der Korallenbleiche und die Entstehung von Infektionskrankheiten 5-6. Allerdings werden genauere Vorhersage der Zukunft Korallen Reaktion auf diese Umweltbedrohungen erfordern, dass eine histologische "Baseline" eingerichtet werden, die Gewebemorphologie und Zellzusammensetzung und Verteilung für "scheinbar gesunden" Korallen definiert. Im Gegenzug "belastet" Korallen können dann quantitativ verglichen werden. Außerdem sollte diese Basislinie für die scheinbar gesunden Korallen unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen festgelegt werden, so dass "gesunde Reaktion" kann auch über Umwelt Gradienten gemessen werden. Als ersten Schritt in Richtung Etablierung dieser Grundlinie, hat eine hochauflösende 3D-Studie, wie scheinbar gesunden Korallenpolyp Gewebe durchgeführt wordenMorphologie und zelluläre Zusammensetzung reagiert auf Anstieg der Wassertiefe (WD) und begleitende Abnahme der Sonneneinstrahlung Bestrahlungsstärke. Ergebnisse können dann verwendet werden, um ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen Korallen Anpassung zu schaffen, sowie einen Einblick in die Korallen-Symbionten Entwicklung und die Verbesserung der Lichtsammel zu gewinnen.

Steinkorallen (Scleractinia) sind Kolonialmarinewirbellose Tiere, die Gastgeber für eine komplexe Ansammlung von anderen Mikroorganismen, die gemeinsam als die Korallen holobiont 7-10 bezeichnet spielen. Die Forschung in der vorliegenden Studie durchgeführt, soll eine Reihe von innovativen Imaging-Technologien nutzen, um gleichzeitig zu verfolgen Änderungen mit zunehmender Wassertiefe in den Gewebe Pigmente und symbiotischen Zooxanthellen von scheinbar gesunden Wirtskorallen. Dadurch werden die erforderlichen vergleichenden Gewebezelle "Baseline" über eine bathymetrischen Gradienten für scheinbar gesunde Korallen und als Indikatoren von Korallen hea etablierenlth 10. Coral Pigmente, genannt Chromatophoren, zu handeln, um absorbieren, reflektieren, streuen, brechen, beugen, oder auf andere Weise mit einfallenden Sonnenstrahlung 11 stören. Die Zooxanthellen-Chromatophoren endosymbiontischen Beziehung hat die Koevolution von strategisch vorteilhafte Lichtsammel Optimierung und Skelettwachstumsstrategien sowie trophische Plastizität (Verschiebung Fütterungsstrategien hin-und her, um aus Autotrophie Heterotrophie) für die Korallen Tier 12 freigegeben.

Die südliche Karibik-Insel Nation von Curaçao (früher Teil der Niederländischen Antillen) liegt etwa 65 km nördlich von Venezuela in der Ost-West verlaufenden Aruba-La Blanquilla Archipel (Abbildung 1A). Die 70 km lange Südküste von Curaçao beinhaltet eine kontinuierliche moderne und Miozän-Pliozän-Pleistozän-Holozän alten Korallenriff-Darm-Trakt 13,14. Die durchschnittliche Jahres SST auf Curaçao variiert etwa 3 ° C einnually, von einem Minimum von 26 ° C im Ende Januar zu einem Maximum von 29 ° C im Anfang September mit einer Jahresdurchschnittstemperatur von 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Das Korallenriff an der Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), in der Nähe der nordwestlichen Spitze der Curaçao (Abbildung 1A) liegen, wurde für die Probenahme gewählt, weil es vorher gut untersuchte und das war marine Ökosystem an diesem Standort wird in frischem Meerwasser nonpolluted 7,15-19 gebadet. . Zwei eng verwandte Arten Steinkoralle, M. annularis und M faveolata wurden für Experimente und Analysen in dieser Studie ausgewählt, da jede Spezies: (1) zeigt deutlich unterschiedliche und nicht überlappende bathymetrische Distributionen auf dem Riff-Darm-Trakt in Bezug auf die Schelfkante und die verbunden Carbonat Sedimentablagerungsräume (M. annularis Bereich = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; 1B, 2A, 2B und); (2) ist ein gemeinsames Korallenriff Rahmen Bauer in der ganzen Karibik 21; und (3) gut untersuchten ökologischen, physiologischen und evolutionären Beziehungen 22.

Feld Probenahme für die vorliegende Studie wurde unter Verwendung von Standardtechniken Tauchen Playa Kalki Offshore auf Curaçao durchgeführt. Ein flacher zu tiefen Wasser bathymetrische Transekt wurde gegründet, die sich über dem Regal lief, über die Schelfkante, und in die tiefen Wasser Vordergrund Riff-Umgebungen. (1) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M.: scheinbar gesunden Korallen wurden dann für die Probenahme entlang dieser bathymetrische Transekt einschließlich identifiziert, annularis, von denen alle in 5 m Wassertiefe (WD); und (2) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M. faveolata, von denen alle bei 12 m WD. Photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) wurde als 33-36% P gemessenAR bei 5 m WD und 18-22% PAR 10 m WD. Probenahme wurde im Januar durchgeführt, wenn der SST betrug 26 ° C bei den Wassertiefen sowohl der 5 m und 12 m. Jede dieser sechs Korallen wurde in dreifacher Ausfertigung bei äquivalenten Raumpositionen abgetastet (dh., Etwa 45 ° nördlicher Breite auf jeder der sechs halbkugelförmigen Korallenköpfen). Jede einzelne Probe bestand aus einer 2,5 cm Durchmesser Korallengewebe-Skelett Stanzbiopsie, die mit einem Schlag gereinigt Bogen gesammelt wurde. Drei Korallengewebe-Skelett-Biopsien wurden auf Standard-SCUBA mit Handschuhen aus jeder der Korallen abgetastet (9 von M. annularis Kolonien in 5 m WD und 9 von M. faveolata bei 12 m WD). Unmittelbar nach Sammlung der Tiefe wurde jede Biopsie Kernprobe in ein steriles 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, mit Schraubverschluss verschlossen und wieder an die Oberfläche. Das Meerwasser wurde aus jedem Zentrifugenröhrchen dekantiert und jeder Kern-Biopsie wurde dann eingetaucht, gespeichert und in 4% Paraformaldehyd transportiert.

23-30 durchgeführt. Die meisten dieser Studien genutzt optisch / Lichtmikroskopie mit entweder Fluoreszenz oder Hellfeld-Techniken. Studien haben jedoch bei ultra-hohen Vergrößerungen mit Rasterelektronen-Serienblock Gesicht Bildgebung in der Vergangenheit 31 durchgeführt worden. In der vorliegenden Studie wurde eine modifizierte SBFI Protokoll entwickelt worden und Korallen zum ersten Mal angewendet. Da M. annularis und M. faveolata Korallenpolypen sind 1-2 mm in der Dicke, würde keine der Routine Lichtmikroskopie-Techniken der Lage sein, zu durchdringen die gesamte Dicke der Korallenpolypen Gewebe. Deshalb haben wir SBFI Probenvorbereitung Protokoll speziell für Korallenproben konzipiert. Darüber hinaus haben wir kunden ein Stereomikroskop Halter entwickelt, Die motorisiert ist, in beiden Richtungen x und y zu bewegen. Diese Vorrichtung nimmt Bilder der Blockseitenfläche der Probe zu sammeln, anstatt die Abschnitte unter Verwendung eines Mikrotoms in regelmäßigen vor dem Mikroskop. Wir führten auch eine andere nichtlineare optische Zwei-Photonen-mikroskopische Technik, um Bild die gleichen Korallenpolypen über die gesamte Dicke der Korallengewebe. Dies überwindet die Beschränkungen von SBFI in Bezug Entkalkung und der Möglichkeit von Veränderungen der Gewebemorphologie und des Volumens (Schrumpfung), die durch die Probenvorbereitung (Dehydratation) und Verarbeitungsprotokolle induziert werden können auferlegt. Außerdem wurden die Emissionsprofile von den Korallen spektral aufgelöst, ihre Spitzenemissionen und Variationen zwischen den Chromatophoren und der photosynthetischen Zooxanthellen identifizieren. Diese Ergebnisse wurden im Rahmen der verwendeten Methode und ihre individuellen Vorteile in Bezug auf Akquisitionszeit, Analysezeit, und die Fähigkeit, feine Strukturdetails, ohne Kompromisse zu lösen str bewertetuctural Integrität des Korallengewebe.

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Protocol

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HINWEIS: Reagenzien für Serienblockfläche Imaging von Coral Proben vorbereitet werden

1. Preinfiltration Wax

  1. Schmelzen 3,6 g STEARIN Flocken in einem Becherglas. Gut mischen auf einer heißen Platte (60-70 ° C).
  2. Geben Sie 400 mg des Sudan IV (Wachs Hintergrundfluoreszenz zu minimieren). Gut mischen und warten, bis ein rot transparent Lösung erreicht wird.
  3. 96 ml heißem hinzufügen geschmolzenem Paraffin (100%) und gut mischen.

1.2) Embedding Wax

  1. Schmelzen 7,2 g STEARIN Flocken in ein Becherglas geben und gut mischen auf einer heißen Platte (60-70 ° C).
  2. Fügen Sie 0,8 g Sudan IV. Gut mischen und warten, bis ein rot transparent Lösung erreicht wird.
  3. Fügen Paraffin-Granulat (162 g) und mischen, bis Paraffin vollständig schmilzt.
  4. Fügen Sie 30 g weißes, körniges Vybar und Schmelze vollständig im selben Becher; einmal geschmolzen, zu mischen.
  5. Lose schließen Sie die Glasflasche mit einem Deckel. Legen Sie die Glasflasche in einem 60 ° C Umluft oven, um die Zutaten in einem flüssigen Zustand zu halten. Führen Sie alle Infiltrationen in diesem Ofen.
  6. Teilen Sie die Gesamtmenge der 200 ml rotem Wachs in zwei Glasflaschen von je 100 ml. Verwenden Sie eine aliquote Menge für die Infiltration und die andere für die endgültige Einbettung.

1.3) Embedding Coral Gewebe für Serial Blockfläche Imaging

  1. Waschen Sie die Korallenpolypen im Feld (SI Video 1) gesammelt und gespeichert (3-6 Monate bei 4-5 ° C in Para) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (3x 5 min) und zu entkalken, wenn bereit, abgebildet werden. Entkalken die Polypen in Excal Lösung für 24 Stunden oder bis, wie die Polypen sind völlig frei von CaCO 3. Inkubieren mehrere entkalkt Korallenpolypen als ein einzelner Block in einer 25, 50, 75 und 100% Ethanol-Serie, gefolgt von 1x Xylolersatz, um die Proben zu entwässern.
  2. Platzieren der verarbeiteten Polypen in einem vorgeheizten Ofen 65 ° C, die 100% Xylol-Ersatz. Inkubation für 30 min zweimal von Changing bis frische Lösung. Richten Sie die Polypen in der Weise, dass die Spitze der Polypen nach unten zeigt und die Oberseite so flach wie möglich ist.
  3. Machen Lösungen von 2: 1, 1: 1 und 1: 2 Xylolersatz und preinfiltration Wachs (Schritt 1.1) in 50 ml Falcon-Röhrchen.
  4. Inkubieren Korallenpolypen mit diesen drei steigenden Konzentrationen von preinfiltration Wachs, gefolgt von 3x Inkubation in 100% preinfiltration Wachs für 30-60 min jeder Zeit.
  5. Hinweis: Je nach der Dicke der Proben, Schritte 1.3.1-1.3.5 könnte mit längeren Zeitraum erhöht werden.
  6. Bewegen Sie die Proben auf die Einbettung Wachs (siehe Schritt 1.2.6) nach 3x Inkubation in 100% preinfiltration Wachs.
  7. Entfernen Sie die Einbettung Wachs nach 30 min. Ersetzen Sie mit frischen Einbettung Wachs und weiterhin Inkubation für mindestens 4 h bei 65 ° C.

1.4) Einbettung in rotem Wachs

  1. Fotografieren Sie den Block (das Edelstahlblech wo das weiße Wachs gelegt und oben auf dem die samweise platziert ist). Dies ist notwendig, denn wenn in dem Wachs eingebettet, wird die Lage der Probe unsichtbar wie die Einbettungs rotem Wachs undurchsichtig ist.
  2. Legen Sie kleine Tropfen hohen Schmelzpunkt Wachs um den neuen vorgeheizten Edelstahl Einbettung Form und lassen Sie ihn abkühlen. Gießen Sie eine kleine Menge von frisch geschmolzenem Wachs Einbettung von zweiten Behälter, wie in Schritt 1.2.6 angegeben.
  3. Positionieren Sie den Korallenpolypen schnell nach unten über dem weißen Wachs Punkt, dann ein Kunststoffprobenhalter auf das Edelstahlblech gießen und mehr Einbettung Wachs, so dass das Wachs kommt bis an die Oberfläche der Kunststoffform.
  4. Nehmen Sie die gesamte Einrichtung von 65 ° C im Ofen und lassen Sie es auf einer Bank oder einem kühlen Oberfläche abkühlen, bis das Wachs komplett aushärtet.
  5. Das kann dauern 6 Stunden bis zu zwei Tage. Legen Sie den Block in einem Kühlschrank bei 4 ° C getrocknet, vor Licht geschützt, zur Langzeitlagerung.

1.5) Schnitte an der seriellen Blockfläche einrichten

  1. Trim der Block und geschnitten 1 um Abschnitte mit Hilfe eines Mikrotoms. Sammeln Sie nicht die Abschnitte, wie sie wie Pulver zu werden. Denken Sie daran, wir sind bildgebende nur die Blockfläche. Die Probe wird angezeigt, wenn das weiße Wachs beginnt zu verschwinden.
  2. Machen Sie Bilder von der glatten Blockfläche, die die Probe jedes Mal ein Abschnitt entfernt enthält. Fortfahren, bis die Korallen Polypen verschwindet wie in SI Video 2.
  3. Record / Erfassen Sie die Bilder mit einem Monochrom-Kamera mit einem fluoreszierenden FITC-Filter zu holen die Autofluoreszenz der Chromatophoren / Korallenpolypen. Bild 3-4 entkalkt Kerne aus einzelnen Arten.

2. Imaging Korallen unter zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie

  1. Fix Korallenpolyp Kerne, die jeweils etwa 10-12 Polypen etwa einen Zentimeter im Durchmesser, in 4% Para am Ort der Sammlung (Küste), sobald sie unter Wasser geerntet.
  2. Halten Proben bei 4 ° C bis zur Bildgebung. Gewaschen Kerne werden in th platzierte gleiche Lösung auf den Kopf in einem Deckglas Bodenschale (0,17 mm dick).
  3. Mit Hilfe eines Zwei-Photonen-Laser bei 780 nm Anregung, Bild 3-4 Polypen bei zwei unterschiedlichen Vergrößerungen (Digitalzoom) mit einem 10-fach (0,3 NA) Ziel. Die Korallenpolyp Form und Höhe variiert zwischen den Proben (in der Regel 1-2 mm) und der Abbildungstiefe auch von den Arbeitsabstand des Abbildungsobjektivs beschränkt.
  4. Verwenden Sie die Kachel-Scan-Modus auf etwa 25-100 (5 x 5 oder 10 x 10 Fliesen) mit 10 oder 20 um Intervall sammeln Bilder pro Brennebene in xy und 50-100 Bilder durch die z-Achse, in Höhe von rund 5.000-10.000 images / Korallenpolypen.
  5. Bild drei vor vier Polypen Bereichen einen Kern und Korallenarten darstellen. HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit variiert zwischen 2-5 h / Polypen-Bereich.
  6. Speichern Sie alle Bilder im RAW-Datenformat auf der Festplatte des Systems als LSM 5. Render 3D in einem 3D-Bildanalyse und Rendering-Software.

3. 3D Volume Rendering und Visualization der SBFI und Zwei-Photonen-Fluoreszenzdaten Spectral

  1. Schneiden Sie das 2D-Daten, um die Dateigröße durch die Konzentration auf einen einzigen Polypen mit dem Quadrat Zuschneidetool im Programm reduzieren und kompilieren als einzelne TIFF-Datei (auch eine Verringerung der Dateigröße durch Speichern der Datei in 8-Bit-Format) in der Erfassungssoftware.
  2. Öffnen Sie die Dateien zusammengefügt der SBFI Daten (in Schritt 1.5.1 gesammelt) oder die Fliesen mehrere z-Stapel von Zwei-Photonen-optische Schnitte (in Schritt 2.1.4 gesammelt) im Programm Imaris Surpass Modul unter Volumen-Algorithmus.
  3. Projekt Das SBFI Daten in 3D mit einem Schattenprojektion gemacht. Neues isosurface Modus, in dem die Voxel Schwellenwert, um eine feste Oberflächenmuster (SI Video 3) erstellen.
  4. Visualisierung der 3D-Projektionen mit einem Clipping-Ebene Algorithmus bei XY, XZ und YZ orthogonalen Modi, um 3D-Struktur und Form der Korallen zu offenbaren.
  5. Animieren Sie die Projektionen mit einem Keyframe-Animation-Modul in der gleichen Imaris Programm (SI ViDEOS 3-7).
  6. Video-Dateien zu erzeugen, bei 5% Kompression und erzeugen eine Film-Clips im AVI-Format mit Volumen (SI Videos 4 und 6), 3D und Isosurface Modalitäten (SI Videos 5 und 7).

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Representative Results

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Ein kundenspezifisches SBFI Gerät (speziell für die vorliegende Studie hergestellt; Abbildung 3) produzierte die ersten detaillierten 3D-Karten mit plastischer Höhen (DHM) der äußeren Oberflächenstruktur und die Morphologie des M. annularis und M. faveolature Korallenpolypen (Abbildung 4 und SI Videos 1-2). Dies ergab Bilder von bisher nicht beschriebene gestapelt Lappen Korallengewebe konzentrisch nach außen strahlenförmig von der Mitte jeder Polyp (4B, 4D und 4E). Diese Lappen sind entlang der obersten Grat der Gewebe bedeckt primären und sekundären Skelett Septen gestapelt, wobei die radial äußersten und untersten Höhen Lappen schließlich die Synthese und die Fusion mit Coenosarc Gewebe zwischen Polypen. Die 3D-Polypen Form und die damit verbundenen Lappen wurden gut erhalten trotz der Korallengewebe Probe, die in mehreren Schritten von Hochtemperatur-Infiltration und Einbettung gegangen. Die zusätzn der Sudan Farbstoff erfolgreich maskiert den Hintergrund als undurchsichtig, mit der schwarzen Farbe mit dazu beigetragen, um den Kontrast zu jeder Probe optimieren und die Signal-zu-Rausch-Verhältnis. 3D und orthogonale Flächenansichten zeigen die Verteilung der Fluoreszenzkomponenten entlang der z-Achse (Figur 4B). Es gab Flugzeuge mit Wachs Flocken, die manchmal verdeckt Polypen Oberflächendetails, die der Übersichtlichkeit halber entfernt wurden bei der Erstellung von Projektionen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist offenbart in internen Details eines dicken Probe, wodurch die Notwendigkeit, mehrere Teile zu nehmen und richten sie zu einem späteren Zeitpunkt. Ferner werden die Bilder in dieser Technik bereits ausgerichtet, wenn gesammelt (4A), Bereitstellen az Auflösung von bis zu 1 um aus einer Probengröße von bis zu 10 mm oder mehr (abhängig von der Gesamtantriebsabstand des Blockhalters im Mikrotom ). Es ist möglich, unterschiedliche Autofluoreszenzkomponenten (unter Verwendung mehrerer Filter) als auch einzelne diskriminierenZooxanthellen bei höherer Vergrößerung, vorausgesetzt, die reduzierte Sichtfeld ist akzeptabel.

Die ApoTome optische Schnitte Fluoreszenzmikroskop zeigte die Verteilung der Korallengewebe Zellen (Zooxanthellen und Chromatophoren) und Oberflächengewebestruktur bei einer Auflösung im Submillimeterbereich. Daher könnte die 6-13 um Durchmesser zooxanthellae leicht erkannt und in Bezug auf die Anzahl der Zellen pro Gewebevolumen (5) quantifiziert werden. Die Dual-Channel-Bildaufnahme mit der Chlorophyll-Fluoreszenz (grün) und den Schleim mit WGB Alexa 647 markiert (rot dargestellt), am besten funktioniert, um das Niveau von Schleim und die Anzahl der Zooxanthellen innerhalb einer bestimmten Lage des Polypen zu quantifizieren (Dur und Moll Septen von Polypen könnte unabhängig berechnet werden).

Neben diesen Ansätzen Mikroskop haben wir auch angewendet TPLSM, eine nichtlineare Technik weithin für dicke biologische Proben verwendet. Die wesentlichen Vorteile gegenüber auf TPLSME-Photon Dauerstrichlaser ist, dass: (1) Anregungs tritt nur an dem Punkt des Fokus, weil die Leistung des Anregungslichtintensität im Quadrat, und die Wahrscheinlichkeit eines Moleküls an zwei aufeinanderfolgenden Photonen zu absorbieren, um ein Elektron von dem Fluorophor anzuregen begrenzt um die Tiefenschärfe des Objektivs, wodurch eine inhärente Konfokalität. und (2) als eine Folge wird es keinen Verlust eines Anregungsphotonen, während tiefer in der Probe, im Gegensatz zu Einzelphotonenlaser. Zudem sind die meisten biologischen Gewebeproben nehmen auch sichtbares Licht. Da der Zwei-Photonen-Anregung ist inhärent lange (in der Nähe von Infrarot bei 780 nm) wird die Absorption auch wesentlich minimiert. Auf der anderen Seite, das Korallenskelett aus Kalziumkarbonat kaum absorbiert oder streut das Zwei-Photonen-Licht. Schließlich, da wir uns interessiert Bestimmung der Verteilung der Gegenstände nur von der profilierten Oberfläche der Korallenskelett, fanden wir tiefer Bildgebung mit diesen ver Modalitäty geeignet für Korallen-Bildgebung.

Wir haben versucht, die verfügbaren spektralen Signaturen in M. kenn annularis (Abbildungen 6-9). Hier zeigen wir, dass unter 780 nm Zwei-Photonen-Anregung hat der chromatophore Autofluoreszenz ein Peak um 500 nm, während die Chlorophyllfluoreszenz von zooxanthellae wird bei etwa 675 nm (6) zentriert ist. Während Entmischung dieser spektralen Daten (Abbildungen 6-7) ist auch möglich, mit einer Entmischung Algorithmus in der Software (8), da es eine eindeutige spektrale Abstand zwischen den beiden Komponenten, Imaging sie gleichzeitig mit zwei Detektoren an zwei Emissionsbanden nachgewiesen zu zeitsparende Technik sein. Dies gilt insbesondere, wenn die Probe gefliest und über eine gesamte 1-2 mm Tiefe des Gewebes abgebildet. Dies beseitigt die Notwendigkeit für physikalische Schnitte, die mehrere tausend Bildern pro Lage und Probe und Polypen erfordert. Die Verteilung o f Autofluoreszenz Chromatophoren ist auch deutlich (Abbildung 9) unter den beiden getesteten Korallenarten. In einem Fall, einen signifikanten Anstieg der Chromatophoren in den flacheren Wasser-Wohnung Korallen M. beobachteten wir annularis Vergleich zu tieferen Wasser M. faveolata (Abbildung 9 und SI-Videos 3 und 4).

Figur 1
Abbildung 1. (A) Karte von Curaçao in der südlichen Karibik, zeigt den Standort der Studie an der Playa Kalki Website auf der anderen nordwestlichen Küste Lee der Insel. (B) Schematischer Querschnitt des Riffs umrandeten Regal an der Playa Kalki auf Curaçao, welche die Wassertiefe Verteilungen von M. annularis und M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. (A) In-situ-Unterwasser-Fotografie, die am Feld 12 m WD von M. an der Playa Kalki faveolata, Curaçao. (B) Nahaufnahme Vergrößerung des Bildes in (A), die die einzelnen Korallenpolypen von M. faveolata in Tageslichtbedingungen (jeder Polyp ist ca. 2 mm im Durchmesser, von denen einige zurückgezogen, mit * gekennzeichnet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. Die Serienblock-face-Bildgebung Instrumentierung. (A und B) Die kundenspezifischen Objekthalter hält die Stereolumar Mikroskop bei 180 ° gegenüber der Blockfläche der Probe in dem Mikrotom platziert. Wenn jeder Abschnitt entfernt worden war, wurde der Block Gesichtsbild mit dem Ziel erfasst, und die 2D-Daten digital gespeichert wurde. Dies wurde durchgeführt, bis die Probe verschwand in dem Block. Das Mikroskop in x und y-Richtung mit Hilfe eines motorisierten Spindel und der Z bewegt wird, wird eine Einstellung vorgenommen, um die Probe zu konzentrieren. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn jeder 1 um Probe wird geschnitten, die Block 1 bewegt sich um vorwärts, so konzentrieren des Anwendungsbereichs ist nicht erforderlich. XYMOT, Maßarbeit xy translationale Motortisch; FLS, Fluoreszenzlichtquelle; MT, Mikrotom; MIC, Stereomikroskop; CAM, Axiocam Monochrom-Kamera; BH, Blockhalter; BF, Block Gesichtdie Probe; FLL, Leuchtstofflichtanregung Fleck auf der Blockfläche; OBJ, Mikroskopobjektiv; HIP, Human Interface Panel. Ein Bild in der Dimension von 1.388 x 1.040 horizontalen vertikalen Pixel in Monochrom-Modus wurde bei einer xy Pixel (single) Auflösung von 1,25 um gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. Serienblockfläche Bildgebung der Korallen M. annularis und M. faveolata von Playa Kalki, Curaçao. gesammelt (A) Beispieldatensatz Galerie zeigt rund 800 Bilder von einzelnen 2D-Bilder aus einem Polyp erhalten bei einer Auflösung von 1 um z. (B) In einem anderen Beispiel Korallen, ging die Schnitte deutlich über 2,000 um in z. Das Bild zeigt mehrere Polypen und Zusammenstellung aller in 2D-Schichten zu einem 3D-Volumen unter Schattenprojektion mit Hilfe der Volumenvisualisierung Imaris Algorithmus. (C) orthogonalen Projektion zeigt eine XZ-Ansicht der Probe in (B), kann man die gesamte Tiefe der Probe über 2 mm zu sehen und die Pfeile die schwarzen Linien, wo wurden 2D-Schichten aufgrund der schlechten Qualität entfernt; Dieses Bild wird von M. annularis. 3D-Volumen (D), Isosurface Rendering (E) und Visualisierung der Daten SBFI. (D) Mehrkorallenpolypen, die die Morphologie Polypen im Längsschnitt auf der Seite und dem 3D-Volumen (Schattenprojektion) eines einzelnen Polypen in der Mitte. Schnitte und Visualisierung in einem beliebigen Winkel ist möglich in 3D (siehe SI Video). E. Da Voxel Fuzzy in 3D (D), die 3D-gerenderten Isosurface Oberfläche zeigt die Kontur des Korallenpolyp Oberfläche und ihrer kontextuellenAnordnung mit benachbarten Polypen (siehe SI Video). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Die Fluoreszenzmikroskopie von Korallenpolypen. (A) Querschnitt eines entkalkten Polypen von M. faveolata ausstellenden Zooxanthellen mit Chlorophyll Autofluoreszenz unter blauem Licht (in grün dargestellt) und Schleimhauttaschen mit Weizenkeim-Agglutinin (rot) gekennzeichnet, wie unter Rotlicht abgebildet. Das Bild wird automatisch in zwei Kanälen gefliest und genäht und mit der Geräte-Software ausgerichtet. (B) Die Erweiterung der in (A) nicht angezeigt, die einzelne Zooxanthellen (jeweils grünen Kreisen, Angleifähr 6-8 um im Durchmesser in grün) und der Oberfläche Schleimschicht (rot) und die Zusammenführung der beiden Kanäle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Zwei-Photonen-Fluoreszenz-spektrale Charakterisierung von Korallen. Verwendung der spektralen Detektor des LSM 710 Systems wurden Fluoreszenzsignale aus dem gesamten sichtbaren Spektrum (419-722 nm) über eine Tiefe von etwa 190 um abgetastet. Das Bild zeigt das Tiefenintervall auf 5 um x-Achse zur Z-Stapel und die y-Achse die Wellenlänge 419 bis 722 nm bei 10 nm-Intervall (insgesamt rund 1.154 Bilder zeigten) erworben. Man kann die zwei spektralen Komponenten, eine zentriert bei 500 nm und die zweite bei 650 nm zu sehen. Eine Zwei-Photonen-Laser-EXCItation Wellenlänge von 780 nm wurde verwendet, um die Emissionsprofile zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7: Charakterisierung der beiden spektralen Komponenten. (A) die spektrale Profil der Hintergrund (blau), Autofluoreszenz von Chromatophoren (grün) und Chlorophyll-Fluoreszenz (rot) durch die Zwei-Photonen-Laser-Anregungswellenlänge von 780 nm Laser angeregt. Die Spektren abgeleitet auf der rechten Seite der Mehrfarben-Spektraldaten gezeigt überlagert und pseudo-farbig nach dem Emissionsprofil. (B) die einzelnen Spektrallinien Behältern, wo die Signale bei 10 nm Intervall gesammelt, um die Spektren und das Bild (A) ableiten. Hinweis dass die zwei verschiedene Komponenten, eine bei ca. 500 nm (Chromatophoren-Autofluoreszenz) und der andere über 675 nm (Chlorophyll-Fluoreszenz) zentriert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 8
Abbildung 8. Die gleichen Bilder in den 7A und 7B, unvermischt spektralen Daten mit Hilfe der Software und die entsprechenden Emissionsspitzen / Spektren. Sowohl M. annularis und M. faveolata sind die spektralen Komponenten sehr ähnlich sind, wie auch ihre Emissionsspitzen. Der wesentliche Unterschied ist jedoch, aufgrund der Lage dieser spektralen Komponenten und deren Häufigkeit (siehe Abbildung 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 9
Abbildung 9. Zwei-Photonen-Fluoreszenz-3D-Bilder von Korallenpolypen von M. annularis (AD) und M. faveolata (EH). (A und E) wurden ohne spektrale Trennung der Komponenten mit 780 nm Anregung der Zwei-Photonen-Laser bebildert, mit der 450 bis 700 nm gesammelt optischen Signals. (B und F) wurden mit der gleichen Anregung (780 nm) gesammelt, aber zwei PMT-Detektoren gleichzeitig verwendet werden, um die Daten aus beiden Komponenten zu sammeln, dh., Eine 500 bis 550 nm (grün-chromatophore Autofluoreszenz) und anderer 650- 720 nm (rot-Chlorophyll-Fluoreszenz). (C und G) sind Tiefe codierten Bilder(B und F), ist rot und Blau ist flachsten tiefsten Bauteilen in 2D. (D und H) sind Bilder der yz Schnitt durch (B und F), die jeweils, welche die Fluoreszenz nur von der Oberfläche der Korallen kommen und das Skelett keine Fluoreszenz bei 780 nm Anregung aufweisen. Beachten Sie die wesentlichen Unterschiede in Chromatophoren-Inhalt zwischen den beiden Korallen. Der M. annularis Lebensraum (0-10 m WD) ist flacher als der M. faveolata Lebensraum (10-20 m WD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10
Abbildung 10. Die Powers of Ten hierarchische räumliche Struktur von Studien of Korallenriff-Ökosysteme. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung S1
SI Abbildung 1. Screenshots, die die Schritte (AI) bei der Erstellung von 3D-Volumen-Rendering und isosurface entweder aus den Daten oder der SBFI 2Photon Mikroskopie mit der Bildanalyse-Software beteiligt (siehe Materialien Tabelle). (A) die 2D-Scheiben rohen Daten im Slice-Modus, die eine einzige Ebene; (B) 3D-Volumen aller 2D-Slices; (C) der Assistent isosurface Schöpfung mit einer Region of Interest (ROI) ausgewählt; (D) ein Algorithmus mit einer Subtraktion des Hinter ausgewählt; (E) ein Schwellenwert angewendet zu holen die Pixel, die Vertret die Daten; (F) Zentrum Samen Punkte der Oberfläche; (G) eine Volumenbasierte Filter wird angewendet, um kleinere Volumen von Schmutz und Rauschen zu beseitigen; (H) die endgültige 3D gerendert isosurface; (I) Keyframe-Animation-Assistenten, um die Filme in den SI-Videos zu erstellen. Die endgültigen gerenderten Bilder werden in beiden Volumen und isosurface Modalitäten in den SI Videos 3-7 gezeigt. Die Protokollschritte 3.1.3-3.1.5 deckt diese Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Material / Ausrüstung Firma Katalog / Modellnummer Kommentare / Beschreibung
Korallengewebe Skeleton Keiner Keiner 2,5 cm Biopsy von natürlichen Lebensraum
Arch Schlag Entkernervorrichtung CS Osborne und Gesellschaft Nr. 149 Für Coral Biopsie Sammlung
Para Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Vorverdünnte
Histoclear / Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Nicht-toxische Alternative zu Xylol, Dehydration und Deparafinization
Xylol und Ethanol Fisher Scientific Fisher Scientific Austrocknung
Paraffin-Wachs Richard Allen Scientific Typ H REF 8338 Infiltrationslösung
Vybar Die Kerzen-Hersteller Keiner Komponente von Red Wax
Stearin Die Kerzen-Hersteller Keiner Komponente von Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wachs-undurchsichtigen Hintergrund
Weizen (WGA) Life Technologies W32466 Zur Markierung von Korallenschleim
Prolong Gold- Life Technologies P36095 Anti-verblassen Montage Medien
Fluor Geschirr World Precision Instruments FD-35-100 Zwei-Photonen-Imaging
XY Motor, Treiber und Controller Lin Technik 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translationsbewegung
Hot Plate Corning DC-220 Schmelzen alle Wachs
Konvektion-Ofen Yamato DX-600 Infiltration und Einbettung
Gewebe-Prozessor Leica ASP 300
Mikrotom Leica RM2055 Einweg-Messer
Stereo-Mikroskop Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Ziel
Fluoreszenz-Mikroskop mit ApoTome Carl Zeiss Axiovert 200 M, ApoTome I System Abbilden Dünnschnitt eines Polypen: Zooxanthellen
Axiocam Kamera Carl Zeiss MRm Monochrom-Kamera 1388x1040 Pixel
AxioVision Software Carl Zeiss Version 4.8 Bildaufnahme-Programm
Zwei-Photonen-Laser Spectra Maitai EHP, gepulster Laser (70 fs) Mit DeepSee Modul
Laser Scanning Mikroskop Carl Zeiss LSM 710 mit Spectral-Detektor 34Kanal PMT-Detektion
Zen Software Carl Zeiss 2010 oder über für Zwei-Photonen-und spektrale Bildaufnahme
Imaris Suite Software Bitebene, Inc., Version 7.0 oder höher 3D-Volumen, Iso-Oberflächen-Rendering, Visualisierung

Tabelle 1. Schlüsselmaterialien, Geräte, Mikroskope und Software in dieser Studie verwendet.

SI Video 1. In-situ-Unterwasser-Video zeigt den Bereich Korallenlebensraum bei 12 m WD von M. an der Playa Kalki faveolata, Curaçao.

SI Video 2. Individuelle 2D-Serienblock Gesichtsbilder der in Fi gezeigt 3D gerenderten Bildgurieren 4E.

SI Video. 3 Isosurface 3D-Bild gerendert Serienblockfläche in 4E und SI-Video 1 vorgestellt, die die Topographie der Korallenpolypen.

SI Video 4. 3D-Volumen gemacht Rohdaten Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild des Korallenpolyp M. faveolata. Die Anregung von 780 nm und die Emission gleichzeitig mit zwei Bandbreiten für zooxanthellae (pseudo-gefärbt rot, 600-700 nm) und Chromatophoren (pseudo-grün, 500-550 nm) erfasst.

SI Video 5. 3D-Volumen in Isosurface-Spots Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild des Korallenpolyp M. gemachtfaveolata. Die Anregung von 780 nm und die Emission gleichzeitig mit zwei Bandbreiten für zooxanthellae (pseudo-gefärbt rot, 600-700 nm) und Chromatophoren (pseudo-grün, 500-550 nm) erfasst.

SI Video 6. 3D-Volumen gemacht Rohdaten Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild des Korallenpolyp M. annularis. Die Anregung von 780 nm und die Emission gleichzeitig mit zwei Bandbreiten für zooxanthellae (pseudo-gefärbt rot, 600-700 nm) und Chromatophoren (pseudo-grün, 500-550 nm) erfasst.

SI Video 7. 3D-Volumen gemacht Isosurface-Spots Zwei-Photonen-Mikroskopie Bild des Korallenpolyp M. annularis. Die Anregung von 780 nm und die Emission gleichzeitig mit zwei Bandbreiten für zooxanthellae (ps fangenEudo farbig rot, 600-700 nm) und Chromatophoren (pseudo-grün, 500-550 nm).

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Discussion

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Korallenriff Forschung ist ein interdisziplinäres Forschungsanstrengungen, mit der gleichzeitigen Analyse physikalischen, chemischen und biologischen Phänomene, die in der Meeresumwelt betrieben werden. Die Studie von komplexen Korallenriff-Ökosysteme ist daher am besten innerhalb von ein "Powers of Ten" kontextuellen Rahmen (Abbildung 10) abgeschlossen. Diese Grafik zeigt, dass die Zusammenstellung Korallen Ökosystem umfasst eine breite Palette von Raumdimensionen (10 -9 bis 10 5 m). Darüber hinaus veranschaulicht, dass diese Übung geobiologische analysiert in einem Zwischenlängenskala von 1 mm-1 cm sind die Brücke zu Feld zu kombinieren und Laboranalysen erforderlich. Diese Powers of Ten Rahmen ist der Kontext für die Experimente, Analysen, Modellierung und Synthese der physikalischen, chemischen und biologischen Parameter, die Curaçao Korallenriff-Ökosysteme zu steuern.

Die vorliegende Studie ist die erste, die vollständig integrierte Suite o geltenf FM, SBFI und CLSM Techniken, um die Reaktion der scheinbar gesunden Korallen zunehmender Wassertiefe zu verfolgen. Lichtmikroskopie-Tools zur Verfügung, um Bild gesamte Gewebe oder dicke biologischen Proben auf eine Vielzahl von optischen Einschränkungen durch die Proben selbst, die Absorption, Streuung und anderen Phänomenen umfassen gestellt beschränkt. Innerhalb von nur den letzten zehn Jahren wurde SBFI Rasterelektronenmikroskopie bei ultra-hohen Auflösungen 31 sowie lichtmikroskopische Bildgebung mit Weitfeld-basierte Bildgebung SBFI von mehreren biologischen Proben verwendet. Dies hat Analysen der alles von Gehirn zu ganzen Herzen Gewebe und sogar Proben, die Knochen, die geschliffen, poliert waren, beschriftet enthalten, und zur gleichen Zeit nach jedem Abschnitt wurde 23-29 gemacht abgebildet. Kürzlich wurden Fluoreszenz und konfokale Mikroskopie verwendet, um die Konturen, Form und Verteilung der Proteine ​​und Pigmente, die in biologischen Proben 32-33 zeigen. Allerdings ist die 3D-Struktur von einzelnen Korallenpolypen had bisher nicht gelöst worden. Voraussetzung für SBFI mit Korallen Proben Entkalkung, wie das Calciumcarbonat müssen vor dem Rendern der Proben zugänglich Infiltration und Schneiden mit einem normalen Mikrotoms entfernt werden.

Dies ist in dem Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie wird zur Analyse von biologischen Geweben unverzichtbar wegen seiner einzigartigen Zweiphotonenanregung Phänomene. Dies führte zu längeren Eindringtiefe 33-34 der Korallengewebe in der vorliegenden Studie, wo die Entkalkung Schritt wurde effektiv eliminiert aufgrund der nichtlinearen Zweiphotonenanregung Phänomene 34. Darüber hinaus ist die Vorkompensation Modul mit der Zwei-Photonen-Laser bereitgestellt wird viel kürzere Pulsbreite, die zusätzlich verbesserte Eindringtiefe. Auf der Seite der Probe, da Calciumcarbonat nicht die Licht im nahen Infrarot bei 780 nm zu absorbieren, ist Eindringtiefe typischerweise durch den Arbeitsabstand des Objektivs begrenzt. Noch ein weiterer Nachteil of Entkalkung und die Entfernung von Korallenskelett ist der Verlust der strukturellen Integrität des Korallengewebes, die Gewebevolumen Schätzungen noch schwieriger macht, nachdem die Probe durch mehrfache Dehydratisierung und Rehydratisierung Schritte gegangen und Einbettung in wasserfreien Wachs. Dies unterstreicht die Bedeutung der Bestimmung Korallengewebe Volumina vor und nach der Verarbeitung.

Das konfokale Charakterisierung von fluoreszierenden Proteinen von Korallen für Great Barrier Reef Korallen abgeschlossen und die Schutzspektralen Eigenschaften haben mit der Tiefe der Korallen Lebensraum 32 korreliert. Jedoch in der vorliegenden Studie zeigen wir zum ersten Mal mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, dass es eine erhebliche Reduzierung der Chromatophoren überall im Tiefwasserkorallen, außer in den Mund Gewebe. Darüber hinaus hat die deutliche Veränderungen in der Verteilung der Zooxanthellen in Bezug auf die Chromatophoren in Tiefe Transekte in M. beobachtet annularis, where die Flachwasser-Korallengewebe vollständig mit Chromatophoren bedeckt. Mit der Auflösung durch die hohe Vergrößerung Bildgebung (8C und 8D) vorgesehen ist, können wir jetzt genau zu quantifizieren, die Fläche und das Volumen durch die Zooxanthellen genommen, und ihre Gewebedichte Verhältnisse können in Bezug auf andere Zellbestandteile bestimmt werden. Zusammengenommen haben die Integration der SBFI-und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Spectral Imaging in der vorliegenden Studie von entscheidender Bedeutung, neue Einblicke in die Morphologie und Struktur der Korallengewebe ergab. Diese Daten werden helfen, die einzelnen Komponenten des Korallengewebe zu quantifizieren, entweder an den einzelnen Polypen Ebene oder auf der Ebene der Kontextwechselspiel zwischen Kolonial Polypen auf eine ganze Korallen Kopf. Dieser Kontext wird nun ermöglichen die adaptive Reaktion der Korallen holobiont zu Veränderungen des Meeresspiegels Wassertiefe und Bestrahlungsstärke, um quantitative verfolgt und vorhergesagt.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

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References

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Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude
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Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

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