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Environment

मल्टीमॉडल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तरीके कैरेबियन रीफ भवन मूंगों में नाकड़ा ऊतक आकृति विज्ञान और संरचना प्रकट

doi: 10.3791/51824 Published: September 5, 2014

Summary

इमेजिंग तकनीक का एक एकीकृत सुइट कैरेबियन कोरल Montastraea annularis और एम में नाकड़ा आकृति विज्ञान और ऊतक संरचना का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया है faveolata. प्रतिदीप्ति, धारावाहिक ब्लॉक चेहरा, और दो photon लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग lobate संरचना, नाकड़ा दीवारों, और अनुमान chromatophore और zooxanthellae घनत्व और वितरण की पहचान की है.

Abstract

इमेजिंग तकनीक का एक एकीकृत सुइट कैरेबियन चट्टान निर्माण कोरल Montastraea annularis और एम जिसमें तीन आयामी (3 डी) आकारिकी और नाकड़ा ऊतकों के सेलुलर संरचना का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया है faveolata. इन तरीकों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एफएम), धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग (SBFI), और दो photon लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (TPLSM) शामिल हैं. SBFI शारीरिक सेक्शनिंग के बाद गहरी ऊतक इमेजिंग प्रदान करता है; यह अधिक से अधिक 2 मिमी के ऊतक गहराई में ऊतक सतह बनावट और 3 डी दृश्य का विवरण. ऊतक सेलुलर संरचना के पूरक एफएम और TPLSM उपज अति उच्च संकल्प छवियों. परिणाम है: (1) बाहरी व्यक्ति प्रवाल जंतु की दीवार और पर पहले से unreported lobate ऊतक morphologies पहचान (2) chromatophores और शैवाल की तरह dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts की 3 डी वितरण और ऊतक घनत्व के पहले सतह नक्शे बनाया. स्पेक्ट्रल अवशोषण मटर500 एनएम और 675 एनएम का KS, क्रमशः, सुझाव है कि एम annularis और एम faveolata क्लोरोफिल और chromatophores के समान प्रकार के होते हैं. हालांकि, एम annularis और एम ऊतक घनत्व और इन महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों के 3 डी वितरण में काफी अंतर दिखा रहे faveolata. इमेजिंग तरीकों पर ध्यान केंद्रित इस अध्ययन SBFI decalcified मूंगा ऊतकों की बड़ी मिमी पैमाने पर नमूनों के विश्लेषण के लिए बेहद उपयोगी है कि इंगित करता है. मानार्थ एफएम और TPLSM nondecalcified मूंगा ऊतकों के नमूनों में सेलुलर वितरण और घनत्व में सूक्ष्म submillimeter पैमाने पर परिवर्तन प्रकट करते हैं. TPLSM तकनीक देता है: (1) न्यूनतम इनवेसिव नमूना तैयार करने, (2) बेहतर ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, और (3) न्यूनतम प्रकाश अवशोषण और बिखरने, अभी भी गहरी ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है.

Introduction

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ग्लोबल वार्मिंग और साथ पर्यावरण परिवर्तन सीधे उष्णकटिबंधीय समुद्री कोरल 1-4 स्वास्थ्य और वितरण को प्रभावित कर रहे हैं. एकाधिक प्रभावों कोरल विरंजन और संक्रामक रोगों 5-6 के उद्भव सहित मनाया जा रहा है. हालांकि, इन पर्यावरणीय खतरों के भविष्य मूंगा प्रतिक्रिया की अधिक सटीक भविष्यवाणी एक ऊतकीय "आधारभूत" "जाहिरा तौर पर स्वस्थ" कोरल के लिए ऊतक आकारिकी और सेल संरचना और वितरण को परिभाषित करता है, जो स्थापित किया है कि आवश्यकता होगी. बदले में, कोरल तो मात्रात्मक तुलना की जा सकती "प्रभावित". "स्वस्थ प्रतिक्रिया" भी पर्यावरण ढ़ाल भर लगाया जा सकता है कि इतने इसके अलावा, इस आधार रेखा, पर्यावरण की स्थिति की एक किस्म के तहत जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल के लिए स्थापित किया जाना चाहिए. इस आधारभूत स्थापित करने की ओर एक प्रारंभिक कदम के रूप में, एक उच्च संकल्प 3 डी अध्ययन कैसे जाहिरा तौर पर स्वस्थ मूंगा नाकड़ा ऊतक का कार्य शुरू कर दिया गया हैआकृति विज्ञान और सेलुलर संरचना सूर्य के प्रकाश विकिरण में पानी की गहराई में वृद्धि (DD) और साथ घटने का जवाब. परिणाम तो मूंगा अनुकूलन के एक अधिक व्यापक यंत्रवत समझने की स्थापना के लिए, साथ ही प्रवाल-symbiont विकास में अंतर्दृष्टि और प्रकाश कटाई की वृद्धि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

पथरीले कोरल (Scleractinia) सामूहिक मूंगा 7-10 holobiont के रूप में निर्दिष्ट अन्य सूक्ष्मजीवों की एक जटिल संयोजन, के लिए मेजबान खेलने कि औपनिवेशिक मरीन पशुओं invertebrate हैं. वर्तमान अध्ययन में किए गए शोध में एक साथ ऊतक पिगमेंट में बढ़ रही पानी की गहराई और जाहिरा तौर पर स्वस्थ मेजबान मूंगों की सहजीवी zooxanthellae साथ परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीकों के एक कमरे का उपयोग करना चाहता है. इस मूंगा hea के संकेतक के रूप में जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल और अभिनय के लिए एक bathymetric ढाल भर में आवश्यक तुलनात्मक ऊतक सेल "आधारभूत" स्थापित करेगाLTH 10. कोरल पिगमेंट, कहा जाता chromatophores, अवशोषित प्रतिबिंबित, बिखराव, अपवर्तित, टुकड़े करना, या अन्यथा घटना सौर विकिरण 11 के साथ हस्तक्षेप करने के लिए काम करते हैं. zooxanthellae-chromatophore एंडोसिम्बायोटक संबंध मूंगा पशु 12 के लिए रणनीतिक रूप से लाभप्रद प्रकाश कटाई अनुकूलन और कंकाल विकास रणनीतियों के coevolution, साथ ही पौष्टिकता प्लास्टिसिटी (स्थानांतरण खिला रणनीतियों autotrophy heterotrophy करने से पीछे और आगे) सक्षम है.

कुराकाओ के दक्षिणी कैरेबियन द्वीप राष्ट्र (नीदरलैंड एंटिल्स के पूर्व भाग) अरूबा ला Blanquilla द्वीपसमूह (चित्रा 1 ए) trending पूरब पश्चिम के भीतर लगभग 65 किमी उत्तर में वेनेजुएला की है. कुराकाओ से 70 किमी लंबी दक्षिणी तट एक आधुनिक सतत और मिओसिन-प्लिओसीन-प्लीस्टोसीन-होलोसने प्राचीन किनारे की तरफ कोरल रीफ पथ 13,14 शामिल हैं. कुराकाओ लगभग 3 डिग्री सेल्सियस एक भिन्न होता है पर वार्षिक एसएसटी मीनnually, 27.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस के एक औसत वार्षिक तापमान के साथ, सितंबर के शुरू में 29 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम करने के लिए देर से जनवरी में 26 डिग्री सेल्सियस की एक न्यूनतम से लेकर (NOAA एसएसटी डाटा 2000-2010, सेट). यह पहले से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि कुराकाओ (चित्रा 1 ए) के उत्तर पश्चिमी सिरे के पास पड़ी प्लाया कल्कि पर कोरल रीफ (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" डब्ल्यू),, नमूना लेने के लिए चुना गया था इस स्थान पर समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र ताजा nonpolluted समुद्री जल 7,15-19 में नहाया है. . दो निकट से संबंधित scleractinian कोरल प्रजातियों, एम annularis और एम faveolata, इस अध्ययन में प्रयोग और विश्लेषण के लिए चुने गए प्रत्येक प्रजाति क्योंकि: (1) शेल्फ को तोड़ने और सम्मान के साथ चट्टान पथ पर प्रदर्शन अलग अलग और nonoverlapping bathymetric वितरण जुड़े कार्बोनेट तलछटी depositional वातावरण (एम annularis रेंज = 0-10 मीटर WD; एम faveolataरेंज = 10-20 मीटर WD 20; आंकड़े 1 बी, 2 ए, और 2 बी); (2) कैरेबियन सागर 21 भर में एक आम कोरल रीफ ढांचे बिल्डर है; और (3) अच्छी तरह से अध्ययन पारिस्थितिक, शारीरिक, और विकासवादी रिश्तों 22 है.

वर्तमान अध्ययन के लिए फील्ड नमूने अपतटीय कुराकाओ पर प्लाया कल्कि के मानक स्कूबा डाइविंग तकनीक का उपयोग किया गया था. एक उथले करने वाली गहरे पानी bathymetric आड़ा काट शेल्फ तोड़ने पर, शेल्फ भर में भाग गया है कि स्थापित है, और गहरे पानी सामने चट्टान के वातावरण में किया गया था. (1) तीन व्यक्ति एम के ~ 1 मीटर व्यास मूंगा प्रमुखों: जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल सिर तो सहित इस bathymetric आड़ा काट साथ नमूना लेने के लिए पहचान की गई 5 मीटर पानी की गहराई (MD) में थे, जो सभी के annularis,; एम के और (2) तीन व्यक्ति ~ 1 मीटर व्यास मूंगा सिर faveolata, जो सभी के लिए 12 मीटर WD पर थे. Photosynthetically सक्रिय विकिरण (बराबर) 33-36% पी के रूप में मापा गया था5 मीटर WD पर ए.आर. और 10 मीटर WD में 18-22% बराबर. एसएसटी 5 मीटर और 12 मीटर दोनों की पानी की गहराई में 26 डिग्री सेल्सियस था जब सैम्पलिंग जनवरी में आयोजित किया गया. इन छह मूंगा प्रमुखों की प्रत्येक (, यानी. छह अर्धगोल मूंगा प्रमुखों में से प्रत्येक पर लगभग 45 डिग्री उत्तर अक्षांश) समकक्ष स्थानिक पदों पर तीन प्रतियों में नमूना था. प्रत्येक व्यक्ति नमूना एक साफ कट्टर पंच के साथ एकत्र किया गया था कि एक 2.5 सेमी व्यास मूंगा ऊतक कंकाल कोर बायोप्सी शामिल थे. तीन मूंगा ऊतक कंकाल बायोप्सी मूंगा प्रमुखों में से प्रत्येक से दस्ताने हाथ के साथ मानक वृक्ष पर जांचा गया (एम से 9 5 मीटर WD पर कालोनियों annularis और एम से 9 से 12 मीटर WD पर faveolata). तुरंत गहराई में संग्रह करने पर, प्रत्येक बायोप्सी कोर नमूना एक बाँझ 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया था, पेंच शीर्ष सील, और सतह पर लौट आए. समुद्र के पानी से प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब से decanted किया गया था और प्रत्येक कोर बायोप्सी तो, डूबे संग्रहीत, और 4% paraformaldehyde में ले जाया गया था.

23-30 के साथ पशु नमूनों की कई प्रकार सहित जैविक नमूने, की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रदर्शन किया गया है. प्रतिदीप्ति या उज्ज्वल क्षेत्र तकनीकों के साथ या तो ऑप्टिकल / प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग इन अध्ययनों के अधिकांश. हालांकि, अध्ययन पिछले 31 में स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग का उपयोग अति उच्च आवर्धन पर आयोजित किया गया है. वर्तमान अध्ययन में, एक संशोधित SBFI प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया है और पहली बार के लिए कोरल के लिए आवेदन किया. एम क्योंकि annularis और एम faveolata प्रवाल जंतु मोटाई में 1-2 मिमी, दिनचर्या प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक से कोई मूंगा नाकड़ा ऊतकों की पूरी मोटाई मर्मज्ञ करने में सक्षम हो जाएगा. इसलिए, हम विशेष रूप से प्रवाल के नमूने के लिए बनाया गया SBFI नमूना तैयार प्रोटोकॉल है. इसके अलावा, हम कस्टम एक stereomicroscope धारक तैयार की है, एक्स और वाई दिशाओं दोनों में स्थानांतरित करने के लिए मोटर चालित है. इस तंत्र बल्कि खुर्दबीन के सामने एक नियमित सूक्ष्म उपयोग कर वर्गों का संग्रह से नमूने के ब्लॉक चेहरे की छवियों लेता है. हम भी मूंगा ऊतकों की पूरी मोटाई भर में छवि को एक ही प्रवाल जंतु एक और nonlinear ऑप्टिकल दो photon सूक्ष्म तकनीक की शुरुआत की. इस विकैल्सीकरण की शर्तें और नमूना तैयार (निर्जलीकरण) और प्रसंस्करण प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है कि ऊतक आकारिकी और मात्रा (सिकुड़) में परिवर्तन की संभावना में SBFI द्वारा लगाया सीमाओं पर काबू. इसके अलावा, कोरल से उत्सर्जन प्रोफाइल के प्रेतसंबंधी chromatophores और संश्लेषक zooxanthellae के बीच अपने चरम उत्सर्जन और विविधताओं की पहचान करने का संकल्प लिया गया. इन परिणामों के प्रयोग विधि के संदर्भ और अधिग्रहण के समय के बारे में अपने व्यक्तिगत लाभ, विश्लेषण समय, और Str समझौता किए बिना ठीक संरचनात्मक विवरण को हल करने की क्षमता में मूल्यांकन किया गयामूंगा ऊतक के uctural अखंडता.

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Protocol

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नोट: अभिकर्मकों कोरल नमूने के सीरियल ब्लॉक अंकित इमेजिंग के लिए तैयार रहना

1 Preinfiltration वैक्स

  1. एक गिलास बीकर में स्टियेरिन गुच्छे की 3.6 ग्राम पिघला. एक गर्म प्लेट (60-70 डिग्री सेल्सियस) पर अच्छी तरह से मिलाएं.
  2. सूडान चतुर्थ के 400 मिलीग्राम जोड़ें (मोम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम करने के लिए). अच्छी तरह मिक्स और एक लाल पारभासी समाधान हासिल की है जब तक प्रतीक्षा करें.
  3. 96 मिलीलीटर गर्म पिघला हुआ आयल (100%) जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.

1.2) एम्बेडिंग वैक्स

  1. एक गिलास बीकर में स्टियेरिन गुच्छे की 7.2 ग्राम पिघला और एक गर्म थाली पर अच्छी तरह मिक्स (60-70 डिग्री सेल्सियस).
  2. सूडान चतुर्थ की 0.8 ग्राम जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और एक लाल पारभासी समाधान हासिल की है जब तक प्रतीक्षा करें.
  3. आयल कणिकाओं (162 ग्राम) जोड़ें और आयल पूरी तरह पिघला देता है जब तक मिश्रण.
  4. सफेद दानेदार Vybar की 30 ग्राम जोड़ें और एक ही बीकर में पूरी तरह से पिघल; पिघल जाने के बाद, मिश्रण.
  5. शिथिल एक ढक्कन के साथ कांच की बोतल बंद करें. एक 60 डिग्री सेल्सियस संवहन ओवर में कांच की बोतल रखेंएन एक तरल अवस्था में सामग्री रखने के लिए. इस ओवन में सब घुसपैठ बाहर ले.
  6. 100 मिलीलीटर प्रत्येक के दो कांच की बोतलों में 200 मिली लाल मोम की कुल मात्रा भाजित. एक घुसपैठ के लिए विभाज्य और अंतिम embedding के लिए अन्य का उपयोग करें.

1.3) सीरियल ब्लॉक अंकित इमेजिंग के लिए एम्बेडिंग कोरल टिश्यूज

  1. फॉस्फेट बफर खारा में (3x 5 मिनट) (paraformaldehyde में 4-5 डिग्री सेल्सियस पर 3-6 महीने) मूंगा क्षेत्र (एसआई वीडियो 1) में एकत्र और संग्रहित जंतु को धोकर तैयार हो imaged जब decalcify. 24 घंटे के लिए या जंतु Caco 3 की पूरी तरह से रहित हैं के रूप में जब तक ExCal समाधान में जंतु Decalcify. नमूने निर्जलीकरण 1x XYLENE स्थानापन्न के द्वारा पीछा किया, एक 25, 50, 75, और 100% इथेनॉल श्रृंखला में एक ही ब्लॉक के रूप में कई decalcified प्रवाल जंतु सेते हैं.
  2. 100% XYLENE स्थानापन्न युक्त एक preheated 65 डिग्री सेल्सियस ओवन में संसाधित जंतु रखें. चांगी से दो बार 30 मिनट के लिए सेतेताजा समाधान के लिए एनजी. जंतु के शीर्ष नीचे चेहरे और ऊपर की सतह के रूप में संभव के रूप में फ्लैट है कि इस तरह से जंतु पूरबी.
  3. 1, 1: 1, और 1: 2 के समाधान बनाओ 2 XYLENE विकल्प और 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में preinfiltration मोम (1.1 कदम).
  4. 30-60 मिनट प्रत्येक समय के लिए 100% preinfiltration मोम में 3x ऊष्मायन द्वारा पीछा preinfiltration मोम के इन तीन बढ़ती सांद्रता के साथ प्रवाल जंतु सेते हैं.
  5. नोट: नमूनों की मोटाई पर निर्भर करता है, कदम 1.3.1-1.3.5 समय की लंबी अवधि के साथ बढ़ाया जा सकता है.
  6. मोम एम्बेड करने के लिए नमूने ले जाएँ 100% preinfiltration मोम में 3x ऊष्मायन के बाद (चरण 1.2.6 देखें).
  7. 30 मिनट के बाद एम्बेड मोम निकालें. ताजा एम्बेड मोम के साथ बदलें और 65 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए ऊष्मायन जारी है.

1.4) लाल वैक्स में एम्बेड

  1. ब्लॉक (सफेद मोम रखा और शीर्ष पर है जहां स्टेनलेस स्टील ट्रे तस्वीर जिनमें से सैममिसाल) रखा गया है. एक बार मोम में एम्बेडेड यह आवश्यक है क्योंकि, नमूना के स्थान एम्बेड लाल मोम अपारदर्शी है के रूप में अदृश्य हो जाएगा.
  2. नई preheated स्टेनलेस स्टील एम्बेड ढालना आसपास उच्च गलनांक मोम की जगह छोटी बूंदें और इसे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. कदम 1.2.6 में कहा गया है दूसरा कंटेनर से हौसले से पिघल एम्बेड मोम की एक छोटी मात्रा डालो.
  3. सफेद मोम डॉट अधिक जल्दी से नीचे का सामना करना पड़ मूंगा नाकड़ा स्थिति, फिर स्टेनलेस स्टील ट्रे पर एक प्लास्टिक का नमूना धारक जगह और मोम प्लास्टिक मोल्ड की सतह के ऊपर आता है कि इतनी अधिक एम्बेड मोम डालना.
  4. 65 डिग्री सेल्सियस ओवन से बाहर पूरे सेटअप लो और मोम पूरी तरह से मज़बूत बनाता है जब तक यह एक बेंच या एक शांत सतह पर शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. यह या दो दिन के लिए 6 घंटे तक का समय लग सकता है. लंबी अवधि के भंडारण के लिए प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में desiccated ब्लॉक, रखें.

1.5) सीरियल ब्लॉक अंकित सेटअप में सेक्शनिंग

  1. त्रावणकोरब्लॉक im और एक सूक्ष्म का उपयोग 1 माइक्रोन वर्गों में कटौती. वे पाउडर की तरह हो जाएगा के रूप में वर्गों एकत्र नहीं है. हम केवल ब्लॉक चेहरा इमेजिंग रहे हैं, याद रखें. सफेद मोम गायब करने के लिए शुरू होता है जब नमूना दिखाई देता है.
  2. नमूना एक अनुभाग निकाल दिया जाता है हर बार होता है, जो चिकनी ब्लॉक चेहरे की छवियों पर कब्जा. मूंगा नाकड़ा एसआई वीडियो 2 के रूप में गायब हो जाता है जब तक जारी रखें.
  3. रिकॉर्ड / chromatophores / मूंगा नाकड़ा के ऑटो प्रतिदीप्ति लेने के लिए एक FITC फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग कर एक मोनोक्रोम कैमरा के साथ छवियों पर कब्जा. छवि प्रत्येक प्रजाति से 3-4 decalcified कोर.

2 इमेजिंग मूंगों के तहत दो फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. जैसे ही वे पानी के नीचे काटा जाता है के रूप में प्रत्येक संग्रह (समुद्र तट) की साइट पर 4% paraformaldehyde में, व्यास में एक इंच के बारे में चारों ओर 10-12 जंतु युक्त, मूंगा नाकड़ा कोर ठीक करें.
  2. इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें. धोया कोर वीं में रखा जाता हैउल्टा एक कवर गिलास नीचे डिश में ई एक ही समाधान (0.17 मिमी मोटी).
  3. एक 10X (0.3 एनए) उद्देश्य का उपयोग 780 एनएम उत्तेजना, छवि दो अलग आवर्धन (डिजिटल ज़ूम) पर 3-4 जंतु पर एक दो फोटॉन लेजर का उपयोग. मूंगा नाकड़ा आकार और ऊंचाई भी इमेजिंग उद्देश्य के काम दूरी द्वारा सीमित है नमूने (आमतौर पर 1-2 मिमी) और इमेजिंग गहराई के बीच होती है.
  4. आसपास 5,000-10,000 छवियों योग, 10 या 20 माइक्रोन अंतराल पर z अक्ष के माध्यम से XY में फोकल हवाई जहाज़ प्रति छवियों और 50-100 छवियों लगभग 25-100 (5 एक्स 5 या 10 x 10 टाइल) एकत्र करने के लिए टाइल स्कैन मोड का उपयोग करें / मूंगा नाकड़ा.
  5. चार नाकड़ा क्षेत्रों के लिए छवि तीन एक कोर और कोरल प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए. नोट: छवि अधिग्रहण के समय 2-5 घंटे / नाकड़ा क्षेत्र के बीच होती है.
  6. एल एस एम 5 एक 3 डी छवि विश्लेषण और प्रतिपादन सॉफ्टवेयर में 3 डी रूप में प्रस्तुत करना सिस्टम के हार्ड डिस्क में कच्चे डेटा प्रारूप में सभी छवियों की दुकान.

3 3 डी मात्रा प्रतिपादन और VisualizatioSBFI के एन और दो photon स्पेक्ट्रल प्रतिदीप्ति डेटा

  1. कार्यक्रम में वर्ग फसल उपकरण का उपयोग कर एक भी नाकड़ा पर ध्यान केंद्रित करके फ़ाइल आकार को कम करने और संकलन एक भी झगड़ा फ़ाइल के रूप में अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में (8 बिट प्रारूप में फाइल सहेजकर भी फ़ाइल आकार को कम) के लिए 2 डी डेटा फसल.
  2. Imaris मात्रा एल्गोरिथ्म के तहत मॉड्यूल पार कार्यक्रम में SBFI डेटा के इकट्ठे फाइलें (चरण 1.5.1 में एकत्र) या (चरण 2.1.4 में एकत्र) दो फोटॉन ऑप्टिकल वर्गों की टाइलों कई Z-ढेर खोलें.
  3. एक छाया प्रक्षेपण का उपयोग कर 3 डी में गाया SBFI डेटा परियोजना. Voxels एक ठोस सतह पैटर्न (एसआई वीडियो 3) बनाने के लिए thresholded कर रहे हैं, जहां एक isosurface मोड बनाएँ.
  4. कोरल के 3 डी संरचना और आकार प्रकट करने XZ, XY में एक कतरन विमान एल्गोरिथ्म का उपयोग कर 3 डी अनुमानों, और yz orthogonal मोड कल्पना.
  5. एक ही Imaris कार्यक्रम में एक महत्वपूर्ण फ्रेम एनीमेशन मॉड्यूल का उपयोग कर अनुमानों चेतन (एसआई वीआईDEOs 3-7).
  6. 5% संपीड़न पर वीडियो फाइल उत्पन्न और मात्रा का उपयोग AVI प्रारूप में एक फिल्म क्लिप उत्पन्न (एसआई वीडियो 4 और 6), 3 डी और Isosurface तौर तरीकों (एसआई वीडियो 5 और 7).

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Representative Results

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(वर्तमान अध्ययन के लिए विशेष रूप से निर्मित, चित्रा 3) एक कस्टम डिजाइन SBFI तंत्र एम की बाहरी सतह बनावट और आकृति विज्ञान के पहले विस्तृत 3 डी डिजिटल ऊंचाई नक्शे (Dems) का उत्पादन annularis और एम faveolature प्रवाल जंतु (चित्रा 4 और एसआई वीडियो 1-2). इस समकेंद्रिकतापूर्वक प्रत्येक नाकड़ा (आंकड़े 4 बी, 4D, और 4E) के केन्द्र से बाहर की ओर radiating मूंगा ऊतक के पहले undescribed खड़ी पालियों की छवियों झुकेंगे. इन पालियों त्रिज्यात सबसे बाहरी और सब से नीचा ऊंचाई पालियों अंततः synthesizing और जंतु के बीच coenosarc ऊतकों के साथ विलय के साथ, ऊतक से ढके प्राथमिक और माध्यमिक कंकाल सेप्टा के ऊपरवाला रिज साथ खड़ी दिखती हैं. मूंगा ऊतक नमूना उच्च तापमान घुसपैठ और एम्बेडिंग के कई चरणों के माध्यम से चला होने के बावजूद 3 डी नाकड़ा आकार और जुड़े पालियों में अच्छी तरह से संरक्षित किया गया. additioकाले रंग प्रत्येक नमूने के विपरीत अधिकतम और संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए मदद की होने के साथ सूडान डाई के एन सफलतापूर्वक, अपारदर्शी पृष्ठभूमि नकाबपोश. 3 डी और orthogonal विमान दृश्य Z-अक्ष (चित्रा 4 बी) के साथ फ्लोरोसेंट घटकों का वितरण दिखाया. कभी कभी अनुमानों बनाते समय स्पष्टता के लिए हटा दिया गया जो नाकड़ा सतह विस्तार, छिप कि मोम के गुच्छे के साथ विमानों थे. इस तकनीक का प्रमुख लाभ इस प्रकार कई वर्गों लेते हैं और बाद में उन्हें पंक्ति को दूर करने की जरूरत है, किसी भी मोटी नमूना के आंतरिक विवरण का खुलासा करने में है. अप करने के लिए 10 मिमी या उससे अधिक का एक नमूना आकार से अप करने के लिए 1 माइक्रोन की AZ संकल्प प्रदान, (चित्रा -4 ए) एकत्र जब इसके अलावा, इस तकनीक में छवियों पहले से ही जुड़ रहे हैं (सूक्ष्म में ब्लॉक धारक की कुल ड्राइव की दूरी पर निर्भर करता है ). यह अलग ऑटो फ्लोरोसेंट (एकाधिक फिल्टर का उपयोग) के घटक के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत रूप से भेदभाव के लिए संभव हैzooxanthellae उच्च बढ़ाई, देखने के लिए कम क्षेत्र स्वीकार्य है प्रदान की.

Apotome ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्रतिदीप्ति खुर्दबीन एक submillimeter संकल्प पर मूंगा ऊतकों की कोशिकाओं (zooxanthellae और chromatophores) और सतह ऊतक संरचना के वितरण का पता चला. इसलिए, 6-13 माइक्रोन व्यास zooxanthellae आसानी से मान्यता प्राप्त है और ऊतक मात्रा प्रति कोशिकाओं की संख्या के संबंध में (चित्रा 5) के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति (हरा) और WGB एलेक्सा 647 के साथ लेबल बलगम का उपयोग कर दोहरी चैनल छवि अधिग्रहण (लाल रंग में दिखाया गया है), नाकड़ा के किसी स्थान के भीतर बलगम का स्तर और zooxanthellae की संख्या यों सबसे अच्छा काम किया है (बड़ी और छोटी नाकड़ा के सेप्टा) स्वतंत्र रूप से गणना की जा सकती है.

इन माइक्रोस्कोप दृष्टिकोण के अलावा, हम भी TPLSM, व्यापक रूप से मोटी जैविक नमूने के लिए इस्तेमाल एक nonlinear तकनीक आवेदन किया है. पर अधिक TPLSM के बड़े फायदेई फोटॉन निरंतर तरंग लेज़रों कि इस प्रकार हैं: उत्तेजना प्रकाश तीव्रता की शक्ति चुकता हो जाता है और फ्लोरोफोरे सीमित है से लगातार दो फोटॉनों अवशोषित करने के लिए एक अणु का मौका एक इलेक्ट्रॉन उत्तेजित क्योंकि (1) उत्तेजना ध्यान के बिंदु पर ही होती है उद्देश्य के क्षेत्र की गहराई के लिए, इस प्रकार एक अंतर्निहित confocality प्रदान करते हैं. एक फोटान लेज़रों के लिए विरोध के रूप में, नमूना में गहरी मर्मज्ञ, जबकि और (2) एक परिणाम के रूप में एक उत्तेजना फोटोन का कोई नुकसान नहीं होगा. इसके अलावा, सबसे जैविक ऊतक के नमूने भी दृश्य प्रकाश को अवशोषित. दो photon उत्तेजना (780 एनएम के पास अवरक्त में) स्वाभाविक लंबा है, अवशोषण भी काफी कम है. दूसरी ओर, कैल्शियम कार्बोनेट से बना मूंगा कंकाल मुश्किल से अवशोषित या दो photon प्रकाश scatters. हम केवल कोरल कंकाल की contoured सतह पर वस्तुओं के वितरण का निर्धारण करने में रुचि रखते थे क्योंकि अंत में, हम इस साधन देखें उपयोग कर गहरी इमेजिंग पायामूंगा इमेजिंग के लिए उपयुक्त वाई.

हम एम में उपलब्ध वर्णक्रमीय हस्ताक्षर चिह्नित करने का प्रयास किया है annularis (आंकड़े 6-9). यहाँ हम zooxanthellae से क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति लगभग 675 एनएम (चित्रा 6) पर केंद्रित है, जबकि 780 एनएम दो photon उत्तेजना के तहत, chromatophore ऑटो प्रतिदीप्ति, 500 एनएम के आसपास एक चोटी है कि दिखा. दोनों घटकों के बीच एक स्पष्ट वर्णक्रमीय दूरी एक साथ साबित कर दो उत्सर्जन बैंड में दो डिटेक्टरों का उपयोग कर उन्हें इमेजिंग, के बाद से वहाँ इस वर्णक्रमीय डेटा (6-7 आंकड़े) के unmixing, सॉफ्टवेयर में एक unmixing एल्गोरिथ्म के साथ भी (चित्रा 8) संभव है सबसे अधिक समय की बचत तकनीक हो. नमूना टाइलों और ऊतकों की एक पूरी 1-2 मिमी गहराई पर imaged है जब यह विशेष रूप से सच है. यह स्थान और नमूना और नाकड़ा प्रति कई हजार छवियों की आवश्यकता है जो शारीरिक सेक्शनिंग, के लिए की आवश्यकता समाप्त. वितरण ओ एफ ऑटो फ्लोरोसेंट chromatophores भी परीक्षण दो कोरल प्रजातियों के बीच अलग (9 चित्रा) है. एक मामले में, हम प्रवाल एम निवास shallower पानी में chromatophores की एक महत्वपूर्ण वृद्धि मनाया गहरे पानी एम की तुलना annularis faveolata (9 चित्रा और एसआई वीडियो 3 और 4).

चित्रा 1
द्वीप के सुदूर पश्चिमोत्तर हवा तट पर प्लाया कल्कि पर अध्ययन स्थल के स्थान दिखा दक्षिणी कैरेबियन सागर में कुराकाओ चित्रा 1 (ए) का नक्शा,. (बी) कुराकाओ पर प्लाया कल्कि पर चट्टान-rimmed शेल्फ के योजनाबद्ध पार अनुभाग, एम के पानी की गहराई वितरण दिखा annularis और एम faveolata. Iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
एम की 12 मीटर WD पर सीटू पानी के भीतर क्षेत्र तस्वीर में चित्रा 2 (ए) प्लाया कल्कि, कुराकाओ. (बी) में faveolata एम के व्यक्तिगत प्रवाल जंतु दिखा (ए) में छवि का इज़ाफ़ा बंद दिन के समय प्रकाश व्यवस्था की स्थिति में faveolata (प्रत्येक नाकड़ा लगभग * द्वारा, मुकर चिह्नित हैं, जिनमें से कुछ व्यास में 2 मिमी, है). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

5in "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 3 धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग इंस्ट्रूमेंटेशन. (ए और बी) कस्टम डिजाइन खुर्दबीन धारक, सूक्ष्म में रखा नमूना के ब्लॉक चेहरे का सामना कर 180 डिग्री पर Stereolumar माइक्रोस्कोप रखती है. प्रत्येक खंड को हटा दिया गया था, ब्लॉक चेहरा छवि उद्देश्य से कब्जा कर लिया था और 2 डी डाटा डिजिटल रूप से जमा हो गया था. नमूना ब्लॉक में गायब हो गया जब तक यह किया गया था. माइक्रोस्कोप एक्स और एक मोटर चालित नेतृत्व पेंच और जेड का उपयोग Y दिशा में ले जाया जाता है, समायोजन नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए किया जाता है. यह प्रत्येक 1 माइक्रोन नमूना sectioned है जब, ब्लॉक 1 माइक्रोन आगे बढ़ता रहता है, इसलिए दायरे से refocus कि नोट करना महत्वपूर्ण है आवश्यक नहीं है. XYMOT, कस्टम XY translational मोटर चालित मंच बनाया; FLS, प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत; मीट्रिक टन, सूक्ष्म; एमआईसी, stereomicroscope; सीएएम, AxioCam मोनोक्रोम कैमरा; बिहार, ब्लॉक धारक; बीएफ, के ब्लॉक चेहरानमूना; FLL, ब्लॉक चेहरे पर फ्लोरोसेंट प्रकाश उत्तेजना स्थान; OBJ, खुर्दबीन उद्देश्य; हिप, मानवीय पैनल. मोनोक्रोम मोड में 1,388 क्षैतिज एक्स 1,040 ऊर्ध्वाधर पिक्सल के आयाम में एक छवि एक XY पिक्सेल 1.25 माइक्रोन के (एकल) के प्रस्ताव पर एकत्र किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
कोरल एम के 4 चित्र सीरियल ब्लॉक चेहरा इमेजिंग annularis और एम प्लाया कल्कि, कुराकाओ. से एकत्र faveolata (ए) नमूना डेटा Z में 1 माइक्रोन संकल्प पर एक नाकड़ा से प्राप्त व्यक्ति 2 डी छवियों के चारों ओर 800 चित्र दिखा गैलरी निर्धारित किया है. एक और प्रवाल नमूना (ख), सेक्शनिंग 2,00 से अधिक अच्छी तरह से चला गयाZ में 0 माइक्रोन. छवि Imaris मात्रा दृश्य कलन विधि का उपयोग छाया प्रक्षेपण के तहत एक 3 डी मात्रा में सभी 2 डी स्लाइस के कई जंतु और संकलन दिखा रहा है. (बी) में नमूना की एक XZ देखने दिखा (सी) विषयेतर प्रक्षेपण, एक 2 मिमी से अधिक नमूने की पूरी गहराई से देख सकते हैं और तीर 2D स्लाइस खराब गुणवत्ता की वजह से हटा दिया गया जहां काले लाइनों से संकेत मिलता है; इस छवि एम से है annularis. SBFI डेटा की 3 डी की मात्रा (डी), Isosurface प्रतिपादन (ई) और दृश्य. (डी) की ओर और बीच में एक भी नाकड़ा के 3 डी की मात्रा (छाया प्रक्षेपण) पर अनुदैर्ध्य अनुभाग में नाकड़ा आकारिकी दिखा एकाधिक प्रवाल जंतु. किसी भी कोण पर सेक्शनिंग और दृश्य 3 डी में संभव है (एसआई वीडियो देखें). Voxels 3 डी (डी) में फजी चूंकि ई, 3 डी Isosurface प्रदान की सतह मूंगा नाकड़ा सतह और उनके प्रासंगिक के समोच्च से पता चलता हैआसन्न जंतु (एसआई वीडियो देखें) के साथ व्यवस्था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
प्रवाल जंतु की चित्रा 5 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी. (ए) एम की एक decalcified नाकड़ा के पार अनुभाग faveolata (हरे रंग में दिखाया गया है) नीले प्रकाश के तहत क्लोरोफिल autofluorescence साथ zooxanthellae और लाल बत्ती के तहत imaged के रूप में (लाल रंग में दिखाया गया है) गेहूं के बीज agglutinin साथ लेबल mucosal जेब का प्रदर्शन. छवि स्वतः दो चैनलों में टाइलों और सिले और साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गठबंधन किया है. (बी) वृद्धि अनुमानित, (प्रत्येक हरी हलकों व्यक्ति zooxanthellae दिखा (ए) में दिखाया गया बॉक्स, कीmately 6-8 हरी में व्यास में माइक्रोन) और सतह बलगम परत (लाल), और दोनों चैनलों के विलय. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा मूंगों से प्रतिदीप्ति के 6 दो photon वर्णक्रमीय लक्षण वर्णन. एल एस एम 710 प्रणाली की स्पेक्ट्रल डिटेक्टर का उपयोग, पूरे दृश्य स्पेक्ट्रम (419-722 एनएम) से प्रतिदीप्ति संकेतों के आसपास 190 मीटर की गहराई पर स्कैन किया गया. छवि Z ढेर के लिए एक्स अक्ष में 5 माइक्रोन पर गहराई अंतराल से पता चलता है और वाई अक्ष 10 एनएम अंतराल (1154 के आसपास छवियों से पता चला कुल) पर हासिल एनएम 419-722 तरंग दैर्ध्य है. एक दो वर्णक्रमीय घटकों, एक 500 एनएम और 650 एनएम पर दूसरे पर केन्द्रित देख सकते हैं. एक दो photon लेजर exci780 एनएम का tation तरंगदैर्ध्य उत्सर्जन प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
दो वर्णक्रमीय घटकों के 7 चित्रा विशेषता. (ए) पृष्ठभूमि (नीला) के वर्णक्रमीय प्रोफाइल, chromatophores (हरा) और 780 एनएम लेजर के दो फोटॉन लेजर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य से उत्साहित क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति (लाल) से autofluorescence. स्पेक्ट्रा मढ़ा बहुरंगा वर्णक्रमीय डेटा के सही पक्ष पर दिखाया गया और छद्म रंग उत्सर्जन प्रोफाइल के अनुसार ली गई. (बी) के संकेतों स्पेक्ट्रा और (ए) में छवि प्राप्त करने के लिए 10 एनएम अंतराल पर एकत्र कर रहे हैं, जहां व्यक्ति वर्णक्रमीय डिब्बे. नोट दो अलग घटकों, लगभग 500 एनएम (chromatophore autofluorescence) और 675 एनएम (क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति) से अधिक अन्य पर केंद्रित एक. कि यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 8
चित्रा आंकड़े 7A और 7 बी में एक ही छवियों, वर्णक्रमीय डेटा सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अमिश्रित 8 और उनके इसी उत्सर्जन चोटियों / स्पेक्ट्रा. एम दोनों में annularis और एम faveolata, वर्णक्रमीय घटकों के रूप में अच्छी तरह से, उनके उत्सर्जन चोटियों बहुत समान हैं. महत्वपूर्ण अंतर है, हालांकि, इन वर्णक्रमीय घटकों और उनकी बहुतायत के स्थान पर है (9 चित्रा देखें).ghres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा
एम से प्रवाल जंतु के 9 चित्रा दो photon प्रतिदीप्ति 3 डी छवियों annularis (ई) और एम faveolata (एह). (ए और ई) 450-700 एनएम से एकत्र ऑप्टिकल संकेत के साथ, दो photon लेजर के 780 एनएम उत्तेजना का उपयोग घटकों का कोई वर्णक्रमीय जुदाई के साथ imaged थे. (बी और एफ) एक ही उत्तेजना (780 एनएम) के साथ एकत्र किए गए थे, लेकिन दो पी एम टी डिटेक्टरों दो घटकों से डेटा एकत्र करने के लिए एक साथ इस्तेमाल किया गया यानी., 500-550 एनएम (ग्रीन chromatophore autofluorescence) और अन्य 650 से एक 720 एनएम (लाल क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति). (सी और जी) की गहराई कोडित छवियों हैं(बी और एफ), लाल उथले है और नीले 2 डी में गहरी घटक है. (डी और एच) प्रतिदीप्ति मूंगा की सतह से केवल आ रहा है और कंकाल 780 एनएम उत्तेजना पर किसी भी प्रतिदीप्ति नहीं है दिखा क्रमशः के माध्यम से कटौती की yz छवियों (बी और एफ), कर रहे हैं. दो कोरल बीच chromatophore सामग्री में काफी अंतर ध्यान दें. एम annularis वास (0-10 एम MD) एम से shallower है faveolata वास (10-20 मीटर MD). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 10
चित्रा 10 ओ के अध्ययन के दस श्रेणीबद्ध स्थानिक संरचना की शक्तियांच मूँगे की चट्टान पारिस्थितिकी प्रणालियों. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा S1
SBFI डेटा या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 2Photon माइक्रोस्कोपी या तो से प्रतिपादन 3 डी की मात्रा और isosurface के निर्माण में शामिल कदम (एआई) दिखा एसआई चित्रा 1 स्क्रीन शॉट्स (सामग्री तालिका देखें). (ए) रॉ के 2 डी स्लाइस एक ही विमान दिखा टुकड़ा मोड में डेटा; (बी) सभी 2 डी स्लाइस की 3 डी की मात्रा; (सी) ब्याज (आरओआई) चयनित की एक क्षेत्र के साथ isosurface निर्माण विज़ार्ड; (डी) चयनित एक पृष्ठभूमि घटाव के साथ एक एल्गोरिथ्म; (ई) एक दहलीज मूल्य जो प्रतिनिधि पिक्सल लेने के लिए आवेदन कियाडेटा t; (एफ) की सतह के केंद्र बीज अंक; (जी) एक मात्रा आधारित फिल्टर मलबे और शोर के छोटे मात्रा को खत्म करने के लिए लागू किया जाता है; (एच) isosurface गाया अंतिम 3 डी; (मैं) प्रमुख सीमा एनीमेशन जादूगर एसआई वीडियो के रूप में फिल्में बनाने के लिए. अंतिम गाया छवियों एसआई वीडियो 3-7 में दोनों मात्रा और isosurface तौर तरीकों में दिखाए जाते हैं. प्रोटोकॉल 3.1.3-3.1.5 इन प्रक्रियाओं को शामिल किया गया कदम. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

सामग्री / उपकरण कंपनी सूची / मॉडल संख्या टिप्पणियाँ / विवरण
कोरल टिशू कंकाल कोई नहीं कोई नहीं 2.5 सेमी Biopप्राकृतिक निवास स्थान से एसवाई
आर्क पंच Coring डिवाइस सीएस ओसबोर्न और कंपनी सं 149 कोरल बायोप्सी संग्रह के लिए
Paraformaldehyde इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान आर टी 15700 16% pre-पतला
Histoclear / Safeclear द्वितीय इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान आर टी 64111-04 Xylene, निर्जलीकरण और Deparafinization गैर विषैले वैकल्पिक
Xylene और इथेनॉल फिशर साइंटिफिक फिशर साइंटिफिक निर्जलीकरण
पैराफिन वैक्स रिचर्ड एलन वैज्ञानिक प्रकार एच रेफरी 8338 घुसपैठ समाधान
Vybar मोमबत्ती निर्माता कोई नहीं लाल वैक्स के घटक
स्टियेरिन मोमबत्ती निर्माता कोई नहीं लाल वैक्स के घटक
सूडान चतुर्थ फिशर रासायनिक S667-25 लाल वैक्स अपारदर्शी पृष्ठभूमि
गेहूं के बीज Agglutinin (WGA) जीवन टेक्नोलॉजीज W32466 कोरल बलगम लेबलिंग के लिए
लम्बा गोल्ड जीवन टेक्नोलॉजीज P36095 विरोधी फीका बढ़ते मीडिया
फ्लोरो डिश विश्व परिशुद्धता उपकरण एफडी-35-100 दो photon इमेजिंग के लिए
XY मोटर, चालक और नियंत्रक लिन इंजीनियरिंग 211-13-01R0, R325, R256-आरओ XY translational आंदोलन
गरम प्लेट Corning डीसी-220 सभी मोम पिघल
संवहन ओवन Yamato DX-600 घुसपैठ और एम्बेडिंग
टिशू प्रोसेसर Leica एएसपी 300
सूक्ष्म Leica RM2055 डिस्पोजेबल चाकू
स्टीरियो माइक्रोस्कोप कार्ल जीस Stereolumar वी 12 1.5x (30 मिमी MD) उद्देश्य
Apotome साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप कार्ल जीस Axiovert एम 200, Apotome मैं सिस्टम एक नाकड़ा की पतली धारा इमेजिंग: zooxanthellae
AxioCam कैमरा कार्ल जीस MRM मोनोक्रोम कैमरा 1388x1040 पिक्सल
AxioVision सॉफ्टवेयर कार्ल जीस संस्करण 4.8 छवि अधिग्रहण कार्यक्रम
दो photon लेजर Spectraphysics Maitai EHP, स्पंदित लेजर (70 FS) DeepSee मॉड्यूल के साथ
लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप कार्ल जीस वर्णक्रमीय डिटेक्टर के साथ एल एस एम 710 34चैनल पीएमटी का पता लगाने
ज़ेन सॉफ्टवेयर कार्ल जीस 2010 या इसके बाद के संस्करण दो photon और वर्णक्रमीय छवि अधिग्रहण के लिए
Imaris सुइट सॉफ्टवेयर Bitplane, इंक, संस्करण 7.0 या इसके बाद के संस्करण 3 डी की मात्रा, आईएसओ सतह प्रतिपादन, दृश्य

तालिका 1 प्रमुख सामग्री, इस अध्ययन में इस्तेमाल उपकरण, सूक्ष्मदर्शी, और सॉफ्टवेयर.

एसआई वीडियो 1. सीटू पानी के भीतर क्षेत्र वीडियो में एम की 12 मीटर WD पर मूंगा वास दिखा प्लाया कल्कि, कुराकाओ पर faveolata.

एसआई वीडियो 2. फाई में दिखाया गया है 3 डी छवि प्रदान की व्यक्तिगत 2D धारावाहिक ब्लॉक अंकित छवियोंgure 4E.

एसआई वीडियो 3. Isosurface 3 डी गाया धारावाहिक ब्लॉक चेहरा छवि मूंगा नाकड़ा की स्थलाकृति दिखा चित्रा 4E और एसआई वीडियो 1 में प्रस्तुत किया.

एसआई वीडियो 4. मूंगा नाकड़ा एम के 3 डी मात्रा गाया कच्चे डेटा दो photon माइक्रोस्कोपी छवि faveolata. उत्तेजना 780 एनएम और zooxanthellae (छद्म रंग लाल, 600-700 एनएम) और chromatophores (500-550 एनएम, छद्म रंग हरा) के लिए दो बैंड चौड़ाई पर एक साथ कब्जा कर लिया उत्सर्जन है.

एसआई वीडियो 5. 3 डी मात्रा Isosurface स्पॉट में मूंगा नाकड़ा एम की दो photon माइक्रोस्कोपी छवि प्रदान की गई हैfaveolata. उत्तेजना 780 एनएम और zooxanthellae (छद्म रंग लाल, 600-700 एनएम) और chromatophores (500-550 एनएम, छद्म रंग हरा) के लिए दो बैंड चौड़ाई पर एक साथ कब्जा कर लिया उत्सर्जन है.

एसआई वीडियो 6. मूंगा नाकड़ा एम के 3 डी मात्रा गाया कच्चे डेटा दो photon माइक्रोस्कोपी छवि annularis. उत्तेजना 780 एनएम और zooxanthellae (छद्म रंग लाल, 600-700 एनएम) और chromatophores (500-550 एनएम, छद्म रंग हरा) के लिए दो बैंड चौड़ाई पर एक साथ कब्जा कर लिया उत्सर्जन है.

एसआई वीडियो 7. मूंगा नाकड़ा एम के 3 डी मात्रा गाया Isosurface स्पॉट दो photon माइक्रोस्कोपी छवि annularis. उत्तेजना 780 एनएम और zooxanthellae के लिए दो बैंड चौड़ाई (पुनश्च पर एक साथ कब्जा कर लिया उत्सर्जन हैeudo रंग लाल, 600-700 एनएम) और chromatophores (छद्म रंग हरा, 500-550 एनएम).

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Discussion

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कोरल रीफ अनुसंधान समुद्री वातावरण में काम करते हैं कि एक साथ भौतिक, रासायनिक का विश्लेषण, और जैविक घटना से जुड़े, एक अत्यधिक अंतःविषय अनुसंधान प्रयास है. जटिल मूँगे की चट्टान पारिस्थितिकी प्रणालियों का अध्ययन इसलिए सबसे अच्छा प्रासंगिक फ्रेमवर्क (चित्रा 10) एक 'दस का पॉवर्स' के भीतर पूरा हो गया है. इस ग्राफिक संकलन कोरल पारिस्थितिकी तंत्र स्थानिक आयामों की एक विस्तृत श्रृंखला (10 -9 10 5 मीटर) को शामिल किया गया है कि दिखाता है. इसके अलावा, इस अभ्यास geobiological क्षेत्र गठबंधन और प्रयोगशाला विश्लेषण करती है की जरूरत पुल हैं 1 मिमी-1 सेमी की एक मध्यवर्ती लंबाई पैमाने पर विश्लेषण करती है कि दिखाता है. दस ढांचे की इस पॉवर्स मॉडलिंग, और भौतिक, रासायनिक संश्लेषण की, और कुराकाओ मूँगे की चट्टान पारिस्थितिकी प्रणालियों को नियंत्रित कि जैविक मापदंडों,, प्रयोगों के लिए संदर्भ है विश्लेषण करती है.

वर्तमान अध्ययन पूरी तरह से एकीकृत सुइट ओ लागू करने के लिए सबसे पहले हैच एफएम, SBFI और CLSM तकनीक बढ़ती पानी की गहराई के लिए जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने के लिए. छवि पूरे ऊतक या मोटी जैविक नमूने के लिए उपलब्ध प्रकाश माइक्रोस्कोपी उपकरणों की वजह से अवशोषण, बिखरने, और अन्य घटनाओं में शामिल हैं जो नमूने खुद से उत्पन्न ऑप्टिकल बाधाओं की एक किस्म को सीमित किया गया है. अभी पिछले दशक के भीतर, SBFI स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कई जैविक नमूने के व्यापक क्षेत्र आधारित SBFI इमेजिंग का उपयोग अति उच्च संकल्प 31 के साथ ही प्रकाश सूक्ष्म इमेजिंग में इस्तेमाल किया गया था. यह दिमाग से पूरे दिल ऊतकों और, जमीन, पॉलिश थे लेबल कि हड्डियों से युक्त भी नमूने लिए सब कुछ का विश्लेषण शामिल है, और प्रत्येक अनुभाग 23-29 बनाया गया था के बाद एक ही समय में imaged किया है. हाल ही में, प्रतिदीप्ति और confocal माइक्रोस्कोपी जैविक नमूने 32-33 में आकृति, आकार, और प्रोटीन और pigments के वितरण प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हालांकि, व्यक्तिगत प्रवाल जंतु हेक्टेयर की 3 डी संरचनाडी पहले से हल नहीं किया गया. कैल्शियम कार्बोनेट घुसपैठ करने के लिए उत्तरदायी नमूने प्रतिपादन और एक नियमित रूप से सूक्ष्म उपयोग कर सेक्शनिंग से पहले हटा दिया जाना चाहिए के रूप में प्रवाल के नमूने के साथ SBFI के लिए शर्त, विकैल्सीकरण है.

दो photon प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी जैविक ऊतकों के विश्लेषण के लिए अपरिहार्य हो जाता है, जहां इस वजह से अपनी अनूठी दो photon उत्तेजना घटना है. इस कारण nonlinear दो photon उत्तेजना को विकैल्सीकरण कदम को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया है, जहां वर्तमान अध्ययन में मूंगा ऊतकों की विस्तारित गहराई पैठ 33-34 का नेतृत्व करने के 34 घटना. इसके अलावा, दो photon लेजर के साथ precompensation मॉड्यूल अतिरिक्त प्रवेश गहराई में सुधार हुआ है, जो बहुत कम पल्स चौड़ाई, प्रदान की है. नमूना तरफ, के बाद से कैल्शियम कार्बोनेट 780 एनएम पर निकट अवरक्त प्रकाश को अवशोषित नहीं करता है, गहराई पैठ उद्देश्य के काम दूरी से आम तौर पर सीमित है. अभी तक एक और नुकसान यह है कि हेच विकैल्सीकरण और कोरल कंकाल को हटाने नमूना कई निर्जलीकरण और पुनर्जलीकरण चरणों के माध्यम से चला गया और पानी से मुक्त मोम में एम्बेड होने के बाद भी कठिन ऊतक मात्रा का अनुमान है जो बनाता मूंगा ऊतक के संरचनात्मक अखंडता का नुकसान हुआ है. इस से पहले और प्रसंस्करण के बाद दोनों मूंगा ऊतक संस्करणों का निर्धारण करने के महत्व पर जोर दिया.

मूंगा की फ्लोरोसेंट प्रोटीन की confocal लक्षण वर्णन ग्रेट बैरियर रीफ मूंगों के लिए पूरा हो चुका है और सुरक्षात्मक वर्णक्रमीय गुण मूंगा निवास स्थान 32 की गहराई के साथ जोड़ा गया है. हालांकि, वर्तमान अध्ययन में हम मुंह के ऊतकों में छोड़कर गहरे पानी प्रवाल में हर जगह chromatophores की पर्याप्त कमी है कि वहाँ दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग पहली बार प्रदर्शित करता है. इसके अलावा, chromatophores के संबंध में zooxanthellae के वितरण में विशिष्ट परिवर्तन एम में गहराई transects भर में देखा गया है annularis, wherई उथले पानी मूंगा ऊतकों पूरी तरह से chromatophores के साथ आते हैं. उच्च बढ़ाई इमेजिंग (आंकड़े 8C और 8D) द्वारा उपलब्ध कराए गए संकल्प के साथ, हम अब ठीक zooxanthellae द्वारा लिया क्षेत्र और मात्रा यों कर सकते हैं, और उनके ऊतक घनत्व अनुपात अन्य सेलुलर घटकों के संबंध में निर्धारित किया जा सकता है. साथ में ले ली, वर्तमान अध्ययन में SBFI के एकीकरण और दो photon प्रतिदीप्ति वर्णक्रमीय इमेजिंग मूंगा ऊतकों की आकृति विज्ञान और संरचना में vitally महत्वपूर्ण नए अंतर्दृष्टि झुकेंगे. इस डेटा व्यक्ति नाकड़ा स्तर पर या एक पूरी मूंगा सिर पर औपनिवेशिक जंतु के बीच परस्पर क्रिया की प्रासंगिक स्तर पर, या तो मूंगा ऊतक के व्यक्तिगत घटकों यों में मदद मिलेगी. अब समुद्र के स्तर से पानी की गहराई और विकिरण में परिवर्तन करने के लिए मूंगा holobiont के अनुकूली प्रतिक्रिया की अनुमति होगी इस संदर्भ मात्रात्मक नज़र रखी और भविष्यवाणी की जा सके.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

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References

  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. Cambridge University Press. 1535 (2013).
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Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

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