Summary
En integrerad svit av avbildningstekniker har tillämpats för att bestämma polyp morfologi och vävnadsstruktur i Karibien koraller Montastraea annularis och M. faveolata. Fluorescens, serieblockytan, och två-photon konfokala laserskanning mikroskopi har identifierat flikiga struktur, polyp väggar, och beräknad chromatophore och zooxantheller tätheter och distributioner.
Abstract
En integrerad svit av avbildningstekniker har tillämpats för att bestämma den tredimensionella (3D) morfologi och cellstruktur polyp vävnader som består av Karibiska revet byggnad koraller Montastraea annularis och M. faveolata. Dessa metoder inkluderar fluorescensmikroskopi (FM), serieblock ansikte imaging (SBFI), och två-photon konfokala laserskanning mikroskopi (TPLSM). SBFI ger djup vävnad avbildning efter fysisk sektione; Det detaljer vävnaden ytstruktur och 3D-visualisering på vävnadsdjup på mer än 2 mm. Kompletterande FM och TPLSM avkastnings extremt högupplösta bilder av vävnadscellstruktur. Resultaten har: (1) identifieras tidigare orapporterade flikiga vävnads morfologier på den yttre väggen av enskilda korallpolyper och (2) skapade de första ytan kartor över 3D-distribution och vävnadstäthet på chromatophores och alger liknande dinoflagellaten zooxantheller endosymbionter. Spektral absorption ärtaks av 500 nm och 675 nm, respektive, antyder att M. annularis och M. faveolata innehåller liknande typer av klorofyll och chromatophores. Emellertid M. annularis och M. faveolata uppvisar betydande skillnader i vävnadsdensitet och 3D fördelning av dessa viktiga cellulära komponenter. Denna studie fokuserar på avbildningsmetoder visar att SBFI är mycket användbart för analys av stora mm skala prover av avkalkat korall vävnader. Kostnadsfri FM och TPLSM avslöjar subtila submillimeter skala förändringar i cellulär fördelning och täthet i nondecalcified korall vävnadsprover. Den TPLSM Tekniken ger: (1) minimalt invasiv provberedning, (2) överlägsen optisk sektioneförmåga, och (3) minimal ljus absorption och spridning, medan de låter djup vävnad avbildning.
Introduction
Global uppvärmning och åtföljande miljöförändringar direkt påverkar hälsa och distribution av tropiska marina koraller 1-4. Flera effekter efterlevs, bland korallblekning och uppkomsten av smittsamma sjukdomar 5-6. Dock kommer mer exakt förutsäga framtida koraller svar på dessa miljöhot kräver att en histologisk "baseline" inrättas, som definierar vävnadsmorfologi och cellsammansättning och fördelning av "synes friska" koraller. I sin tur "påverkade" koraller kan sedan kvantitativt jämföras. Dessutom bör denna baslinje fastställas för till synes friska koraller under olika miljöförhållanden, så att "sunt svar" också kan mätas över miljögradienter. Som ett första steg mot upprättandet här baslinjen, har en högupplöst 3D studie genomförts av hur till synes frisk korall polyp vävnadmorfologi och cellulära sammansättning svarar på ökningar i vattendjup (WD) och åtföljande minskning i solljus irradians. Resultaten kan sedan användas för att skapa en mer heltäckande mekanistisk förståelse av korall anpassning, samt för att få inblick i korall-symbionten evolution och förstärkning av ljus skörd.
Stenkoraller (Scleractinia) är koloniala marina ryggradslösa djur som spelar värd till en komplex samling av andra mikroorganismer, tillsammans kallade koraller holobiont 7-10. Den forskning som bedrivs i denna studie är att använda en serie banbrytande bildteknik för att samtidigt spåra ändringar med ökande vattendjup i vävnadspigment och symbiotiskt zooxanthellae av till synes friska värd koraller. Detta kommer att skapa den nödvändiga jämförande vävnadscell "baseline" över en djup gradient för till synes friska koraller och fungera som indikatorer på korall heaLTH 10. Coral pigment, som kallas chromatophores, agera för att absorbera, reflektera, scatter, bryta, avböja, eller på annat sätt störa infallande solstrålningen 11. Den zooxanthellae-chromatophore endosymbiotisk förhållande har gjort att coevolution strategiskt fördelaktigt ljus-skörd optimering och skeletttillväxtstrategier, samt trofiska plasticitet (skifta utfodringsstrategier back-och-tillbaka från autotrofi till heterotrophy) för korall djur 12.
Den södra karibiska önationen Curaçao (tidigare en del av Nederländska Antillerna) ligger ca 65 km norr om Venezuela i den öst-västliga trending Aruba-La Blanquilla skärgård (figur 1 A). Den 70 km långa sydkust Curaçao innehåller en kontinuerlig modern och miocen-pliocen-pleistocen-Holocene gamla plym korallrev kanalen 13,14. Genomsnittlig årlig SST på Curaçao varierar ca 3 ° C enligen, från lägst 26 ° C i slutet av januari till högst 29 ° C i början av september, med en genomsnittlig årlig temperatur på 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Korallrevet vid Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), som ligger nära den nordvästra spetsen av Curaçao (Figur 1A), valdes för provtagning eftersom det har varit tidigare väl studerat och marina ekosystemet på den här platsen badar i färskt nonpolluted havsvatten 7,15-19. . Två närbesläktade scleractinian korallarter, M. annularis och M faveolata, valdes för experiment och analys i denna studie eftersom varje art: (1) uppvisar helt olika och icke överlappande batymetriska distributioner på revet tarmkanalen med avseende på hyllan brytning och associerade karbonat sedimentära avsättningsmiljöer (M. annularis intervall = 0-10 m WD M. faveolatarange = 10-20 m WD 20, fig 1B, 2A och 2B); (2) är en vanlig korallrev ram byggare i hela Karibiska havet 21; och (3) har väl studerat ekologiska, fysiologiska och evolutionära relationer 22.
Fält provtagning för den aktuella studien genomfördes med hjälp av standard dykning tekniker offshore i Playa Kalki på Curaçao. Ett grunt till djupt vatten djuptransekt fastställdes att sprang över hyllan, under hyllan paus, och i de djupa vattenfram rev miljöer. Tydligen friska korall huvuden identifierades sedan för provtagning längs denna batymetrisk transekt, inklusive: (1) tre individuella ~ 1 m korall diameter chefer M. annularis, som alla var vid 5 m vattendjup (WD); och (2) tre individuella ~ 1 m korall diameter chefer M. faveolata, som alla var på 12 m WD. Fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR) mättes som 33-36% PAR vid 5 m WD och 18-22% PAR vid 10 m WD. Provtagning genomfördes i januari när SST var 26 ° C vid vattendjup av både 5 m och 12 m. Var och en av dessa sex korall huvuden provtogs i tre exemplar på motsvarande rumsliga positioner (dvs., Ca 45 ° N latitud på var och en av de sex halvsfäriska korall huvuden). Varje enskilt prov bestod av en 2,5 cm diameter korall vävnads skelett core biopsi som samlades med en rengjord bågstans. Tre korall vävnads skelett biopsier provtogs på standard SCUBA med handskar på händerna från var och en av korall huvuden (9 från M. annularis kolonier vid 5 m WD och 9 från M. faveolata vid 12 m WD). Omedelbart efter insamling på djupet, fick varje biopsi kärnprov placeras i en steril 50 ml polypropylen centrifugrör, skruvlock förslutna, och återvände till ytan. Havsvattnet dekanterades från varje centrifugrör och varje kärnbiopsi nedsänktes därefter, lagras och transporteras i 4% paraformaldehyd.
23-30. De flesta av dessa studier utnyttjas optisk / ljusmikroskop med antingen fluorescens eller ljusa fälttekniker. Men studier har genomförts på extremt höga förstoringar använder svepelektronserieblock ansikte avbildning i det förflutna 31. I den aktuella studien har ett modifierat SBFI protokoll utvecklats för och appliceras på koraller för första gången. Eftersom M. annularis och M. faveolata korall polyper är 1-2 mm i tjocklek, skulle ingen av de rutin Ijusmikroskopi tekniker vara i stånd att penetrera hela tjockleken hos korall polyp vävnad. Därför har vi SBFI provberedning protokoll speciellt för korallprover. Dessutom har vi skräddarsytt ett stereomikroskop hållare, Vilken är motordriven för att röra sig i både x och y-riktningarna. Denna apparat tar bilder av blockytan av exemplaret i stället samla sektionerna med hjälp av en vanlig mikrotom framför mikroskopet. Vi införde också en annan icke-linjär optisk två-foton mikroskopisk teknik för att bilden samma korallpolyper över hela tjockleken av korall vävnader. Detta övervinner de begränsningar som SBFI gäller avkalkning och möjligheten till förändringar i vävnadsmorfologi och volym (krympning) som kan induceras av provberedning (dehydrering) och bearbetningsprotokoll. Dessutom utsläppsprofiler från koraller var spektral beslutat att identifiera sina toppstrålning och variationer mellan chromatophores och den foto zooxanthellae. Dessa resultat utvärderades i samband med den metod som används och deras individuella fördelar vad gäller förvärvstiden, analystiden och förmågan att lösa fina strukturella detaljer utan att kompromissa structural integritet korallvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Reagens vara beredd på Serial Block Face avbildning av Coral Prover
1. Preinfiltration Vax
- Smält 3,6 g stearin flingor i en glasbägare. Blanda väl på en värmeplatta (60 till 70 ° C).
- Tillsätt 400 mg Sudan IV (för att minimera vax bakgrundsfluorescens). Blanda väl och vänta tills en röd genomskinlig lösning uppnås.
- Lägg 96 ml varm smält paraffin (100%) och blanda väl.
1.2) Bädda Wax
- Smält 7,2 g stearin flingor i en glasbägare och blanda väl på en värmeplatta (60 till 70 ° C).
- Tillsätt 0,8 g Sudan IV. Blanda väl och vänta tills en röd genomskinlig lösning uppnås.
- Lägg paraffin granuler (162 g) och blanda tills paraffin smälter helt.
- Lägg 30 g vitt kornigt Vybar och smälta helt i samma bägare; gång smält, blanda.
- Stänga Löst glasflaska med ett lock. Placera glasflaska i en 60 ° C konvektion ovsv att hålla ingredienserna i ett flytande tillstånd. Utför alla infiltrationer i denna ugn.
- Dela den totala volymen av de 200 ml rött vax i två glasflaskor om 100 ml vardera. Använd en alikvot för infiltration och en för slut inbäddning.
1.3) Bädda Coral Vävnader för Serial Block Face Imaging
- Tvätta korallpolyper som samlats i fält (SI Video 1) och lagrade (3-6 månader vid 4-5 ° C i paraformaldehyd) i fosfatbuffrad saltlösning (3x 5 min) och avkalka när redo att avbildas. Kalkar av polyper i Excal lösning för 24 timmar eller tills de polyper är helt saknar CaCO 3. Inkubera flera avkalkat koraller polyper som ett enda block i en 25, 50, 75, och 100% etanolserier, följt av 1x xylensubstitut att dehydratisera proverna.
- Placera de bearbetade polyper i en förvärmd ugn vid 65 ° innehållande 100% xylen substitut. Inkubera under 30 minuter två gånger genom changing till färsk lösning. Orientera polyper i ett sådant sätt att den övre delen av polyperna är vänd nedåt och den övre ytan är så platt som möjligt.
- Gör lösningar av 2: 1, 1: 1 och 1: 2 xylensubstitut och preinfiltration vax (steg 1.1) i 50 ml Falcon-rör.
- Inkubera korallpolyper med dessa tre ökande koncentrationer av preinfiltration vax, följt av 3x inkubation i 100% preinfiltration vax för 30-60 min varje gång.
- Anmärkning: Beroende på tjockleken av proverna, steg 1.3.1-1.3.5 kunde ökas med längre tidsperioder.
- Flytta prover till bädda vax (se steg 1.2.6) efter 3x inkubation i 100% preinfiltration vax.
- Avlägsna bädda vax efter 30 min. Ersätt med färsk inbäddning vax och fortsätter inkuberingen under minst 4 h vid 65 ° C.
1.4) Bädda in Red Wax
- Fotografi blocket (det rostfri bricka där vitt vax är placerad och ovanpå vilken sampel är placerad). Detta är nödvändigt eftersom när inbäddade i vax, kommer placeringen av provet bli osynlig när inbäddning röd vax är ogenomskinlig.
- Placera små droppar av hög smältpunkt vax runt den nya förvärmda rostfria bädda mögel och låt den svalna. Häll en liten volym av nyligen smält bädda vax från andra behållare såsom anges i steg 1.2.6.
- Placera korall polyp nedåt snabbt över den vita vax prick, sedan placera en plastprovhållare på brickan i rostfritt stål och häll mer inbäddning vax så att vaxet kommer upp till ytan av plastform.
- Ta hela installationen av 65 ° C ugn och låt den svalna på en bänk eller en kall yta tills vaxet helt hårdnar.
- Detta kan ta 6 timmar upp till dag eller två. Placera blocket torkats i kylskåp vid 4 ° C, skyddat från ljus, för långtidsförvaring.
1.5) Snittning vid Serial Block Face Setup
- Trim blocket och skär ett pm sektioner med hjälp av en mikrotom. Inte samla sektionerna som de kommer att bli som pulver. Kom ihåg att vi är avbildning bara blocket ansiktet. Provet visas när vita vaxet börjar försvinna.
- Ta bilder av den släta blocket yta som innehåller provet varje gång ett avsnitt tas bort. Fortsätt tills korall polyp försvinner som i SI Video 2.
- Record / Fånga bilder med en monokrom kamera med FITC fluorescerande filter för att plocka upp den automatiska fluorescens av chromatophores / korall polyp. Bild 3-4 urkalkade kärnor från varje art.
2 Imaging Koraller Under Två-foton fluorescensmikroskopi
- Fix korall polyp kärnor, var och en innehållande cirka 10-12 polyper omkring en tum i diameter, i 4% paraformaldehyd vid platsen för samlingen (havet) så snart de skördas under vatten.
- Förvara proverna vid 4 ° C tills avbildning. Tvättade kärnor placeras i the samma lösning upp och ner i ett skyddsglas nedre skålen (0,17 mm tjock).
- Med hjälp av en två foton laser vid 780 nm excitation, bild 3-4 polyper vid två olika förstoringar (digital zoom) med en 10X (0,3 NA) mål. Den korall polyp form och höjd varierar mellan prover (vanligtvis 1-2 mm) och den bilddjupet begränsas också av avbildnings målet arbetsavstånd.
- Använd kakel läget scan att samla ca 25-100 (5 x 5 eller 10 x 10 brickor) bilder per fokalplanet i xy och 50-100 bilder genom z-axeln vid 10 eller 20 nm intervall, totalt cirka 5.000-10.000 bilder / korall polyp.
- Bild 3-4 polyp områden för att representera en kärna och korallarter. OBS: Bild anskaffningstiden varierar mellan 2-5 tim / polyp område.
- Förvara alla bilder i rådataformat i systemets hårddisk som LSM 5. Rendera 3D i en 3D-bild analys och renderingsprogram.
3 3D Volume Rendering och Visualization av SBFI och Två-foton Spectral Fluorescens Data
- Beskär 2D data för att minska filstorleken genom att fokusera på en enda polyp använder torget beskärningsverktyget i programmet och sammanställa som en enda TIFF-fil (minska filstorleken också genom att spara filen i 8-bitars format) i förvärvet programvaran.
- Öppna de församlade filerna i SBFI data (som samlats in i steg 1.5.1) eller klinker flera z-stackar av två foton optiska sektioner (som samlats in i steg 2.1.4) i programmet Imaris Surpass modul enligt volymalgoritmen.
- Projekt för SBFI uppgifter som gjorts i 3D med hjälp av en skuggprojektion. Skapa ett isosurface läge där voxlarna är trösklas att skapa en fast yta mönster (SI Video 3).
- Visualisera 3D projektioner med en klippning plan algoritm på xy, xz och yz ortogonala lägen att avslöja 3D-strukturen och formen på koraller.
- Animera prognoserna med hjälp av en nyckel bildruteanimering modulen i samma Imaris programmet (SI ViDEOS 3-7).
- Generera videofiler vid 5% kompression och generera ett filmklipp i avi-format med hjälp av volym (SI Video 4 och 6), 3D och isosurface modaliteter (SI Videos 5 och 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En specialdesignad SBFI apparat (tillverkats speciellt för denna studie, Figur 3) producerade de första detaljerade 3D digitala höjdkartor (Dems) av den yttre ytstruktur och morfologi M. annularis och M. faveolature korallpolyper (Figur 4 och SI Videor 1-2). Detta gav bilder av tidigare obeskrivna staplade lober korallvävnad koncentriskt utstrålar utåt från mitten av varje polyp (figur 4B, 4D och 4E). Dessa lober är staplade längs den översta åsen av vävnad täckta primär och sekundär skelett septa, de radiellt yttersta och nedersta höjd lober småningom syntetisera och samgående med coenosarc vävnader mellan polyper. 3D polyp form och tillhörande loberna var väl bevarade trots korallvävnadsprov ha gått igenom flera steg av hög temperatur infiltration och inbäddning. Den addition Sudans färgämne framgångsrikt maskerade bakgrunden som ogenomskinliga, med den svarta färgen har bidragit till att maximera kontrasten för varje prov och öka signal-till-brus-förhållande. 3D och ortogonala planvyer visade fördelningen av fluorescerande komponenter längs z-axeln (figur 4B). Det fanns flygplan med vax flingor som ibland skyms polyp yta detalj, som togs bort för tydlighetens skull när du skapar prognoser. Den stora fördelen med denna teknik är att avslöja interna uppgifter om eventuell tjockt prov, vilket eliminerar behovet av att ta flera avsnitt och anpassa dem vid ett senare tillfälle. Vidare är bilderna i denna teknik redan har anpassats när samlas (Figur 4A), vilket ger az upplösning på upp till 1 pm från en urvalsstorlek på upp till 10 mm (beroende på den totala drivavstånd blockhållare i mikrotomen ). Det är möjligt att skilja olika auto-fluorescerande komponenter (med flera filter) samt enskildazooxanthellae vid högre förstoring, under förutsättning att reducerat synfält är acceptabel.
Den ApoTome optiska sektionefluorescensmikroskop avslöjade fördelningen av korall vävnader celler (zooxantheller och chromatophores) och ytan vävnadsstruktur vid en submillimeter upplösning. Därför kunde zooxanthellae den 6-13 um diameter vara lätt att känna igen och kvantifieras med avseende på antalet celler per vävnadsvolym (Figur 5). Den dubbla kanaler bildtagning med hjälp av klorofyll fluorescens (grön) och slem märkt med WGB Alexa 647 (visas i rött), fungerade bäst för att kvantifiera graden av slem och antalet zooxanthellae inom en given plats på polyp (större och mindre septa av polyp kunde beräknas oberoende).
Utöver dessa mikroskop tillvägagångssätt har vi också appliceras TPLSM, en olinjär teknik används allmänt för tjocka biologiska prover. De stora fördelarna med TPLSM över dene-foton kontinuerlig våg lasrar är att: (1) excitation sker endast vid fokuspunkten eftersom kraften i excitationsljusintensiteten blir fyrkantig och chansen för en molekyl att absorbera två på varandra följande fotoner att excitera en elektron från fluoroforen är begränsad till skärpedjup av målet, vilket ger en inneboende konfokalitet. och (2) som en följd blir det ingen förlust av en exciterings foton samtidigt tränga djupare in i provet, till skillnad från enskilda foton lasrar. Dessutom har de flesta biologiska vävnadsprov absorberar även synligt ljus. Eftersom den två-foton-excitation är inneboende lång (i nära infrarött vid 780 nm), är absorptionen också väsentligen minimeras. Å andra sidan, korallskelett som består av kalciumkarbonat absorberar eller sprider den två-foton-ljus knappt. Slutligen, eftersom vi var intresserade av att bestämma fördelningen av föremål enbart på den profilerade ytan av korall skelett, fann vi djupare avbildning med denna modalitet very lämplig för korall avbildning.
Vi har försökt att karakterisera de tillgängliga spektrala signaturer i M. annularis (figurerna 6-9). Här visar vi att under 780 nm tvåfotonexcitering har chromatophore auto-fluorescens en topp kring 500 nm, medan klorofyllfluorescensen från zooxanthellae är centrerad vid ca 675 nm (Figur 6). Medan unmixing av denna spektrala data (Figur 6-7) är också möjligt med en unmixing algoritm i programvaran (Figur 8), eftersom det finns ett klart spektral avståndet mellan de två komponenterna, imaging dem samtidigt med hjälp av två detektorer vid två emissionsbanden bevisade vara mest tidssparande teknik. Detta är särskilt sant när provet kaklade och avbildas över en hel 1-2 mm djup av vävnad. Detta eliminerar behovet av fysiska sektione, vilket kräver flera tusen bilder per plats och prov och polyp. Fördelningen o f auto-fluorescerande chromatophores är också tydlig (figur 9) bland de två korallarter som testades. I ett fall, observerade vi en betydande ökning av chromatophores i grundare vatten levande korall M. annularis jämfört med djupare vatten M. faveolata (Figur 9 och SI till bilder 3 och 4).
Figur 1 (A) Karta över Curaçao i södra Karibiska havet, som visar var studie plats på Playa Kalki längst nordväst lä kusten av ön. (B) Schematisk tvärsnitt av revet-kantad hylla vid Playa Kalki på Curacao, som visar de vattendjup fördelningar av M. annularis och M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 (A) In situ vattensfält fotograferar vid 12 m WD M. faveolata vid Playa Kalki, Curaçao. (B) Närbild förstoring av bilden i (A) som visar de enskilda korallpolyper av M. faveolata i dagtid ljusförhållanden (varje polyp är ca 2 mm i diameter, av vilka några är tillbakadragna, betecknade med *). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5in "src =" / filer / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3 Serie blocket ansikte imaging instrumentering. (A och B) Den specialdesignade mikroskophållaren håller Stereolumar mikroskop vid 180 ° vänd mot blocket inför provet placeras i mikrotomen. När varje avsnitt togs bort, var blockansiktsbild fångas med målet och 2D data digitalt lagrad. Detta gjordes tills provet försvann i blocket. Mikroskopet flyttas i x och y-led med hjälp av en motordriven ledarskruv och z, är justering för att fokusera provet. Det är viktigt att notera att när varje 1 um prov är sektionerad, block flyttas 1 mm framåt, så fokusera på omfattningen är inte nödvändigt. XYMOT, Custom byggd xy translationell motoriserad skede; FLS, Fluorescens ljuskälla; MT, Mikrotomen; MIC, Stereo; CAM, AxioCam svartvit kamera; BH, Blockhållare; BF, Block ansikteprovet; FLL, fluorescerande ljus excitation plats på blocket ansiktet; OBJ, mikroskop mål; HIP, Human interface panel. En bild på dimension 1,388 horisontella x 1040 vertikala bildpunkter i monokromt läge samlades vid en xy pixel (singel) upplösning på 1,25 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Serie blocket ansikte avbildning av korallerna M. annularis och M. faveolata samlats in från Playa Kalki, Curaçao. (A) Exempel på datasats galleri som visar cirka 800 bilder av enskilda 2D-bilder som erhållits från en polyp på 1 mikrometer upplösning i z. (B) I en annan korall prov, snitt gick långt över 2,000 nm i z. Bilden visar flera polyper och sammanställning av alla 2D skivor i en 3D-volym under skuggprojektion använder Imaris volymvisualisering algoritm. (C) Ortogonal projektion som visar en xz bild av provet i (B), kan man se hela djupet av provet över 2 mm och pilarna visar de svarta linjerna där 2D skivor avlägsnades på grund av dålig kvalitet; den här bilden är från M. annularis. 3D-volym (D), isosurface rendering (E) och visualisering av SBFI data. (D) Flera korallpolyper visar polyp morfologi i längdsnitt på sidan och 3D-volymen (shadow projektion) av en enda polyp i mitten. Sektione och visualisering i alla vinklar är möjligt i 3D (se SI-video). E. Sedan voxlar är suddiga i 3D (D) visar den 3D isosurface renderade yta konturen av korall polyp yta och deras kontextuellaarrangemang med intilliggande polyper (se SI-video). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Fluorescensmikroskopi av korallpolyper. (A) Tvärsnitt av en urkalkade polyp av M. faveolata uppvisar zooxanthellae med klorofyll autofluorescens under blått ljus (visas i grönt) och slemhinnor fickor märkta med vetegroddagglutinin (visas i rött) som avbildas i rött ljus. Bilden automatiskt kaklade i två kanaler och sys och anpassas med hjälp av instrumentets programvara. (B) Utvidgningen av lådan som visas i (A), som visar enskilda zooxanthellae (var gröna cirklar, approxifär 6-8 nm i diameter i grönt) och ytan slemlager (röd), och sammanslagningen av de båda kanalerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Två-foton spektral karakterisering av fluorescens från koraller. Använda den spektrala detektor för LSM 710 systemet, fluorescenssignaler från hela det synliga spektrumet (419-722 nm) scannas över ett djup av ca 190 nm. Bilden visar djupintervallet vid 5 pm i x-axeln för z stacken och y-axeln är våglängden 419-722 nm fått vid 10 nm intervall (totalt cirka 1154 bilder visade). Man kan se de två spektrala komponenter, en centrerad vid 500 nm och den andra vid 650 nm. En två-foton-laser EXCIförandet våglängd av 780 nm användes för att erhålla utsläppsprofiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 Karakterisering av de två spektrala komponenter. (A) Den spektrala profilen för bakgrunden (blå), autofluorescens från chromatophores (grön) och klorofyllfluorescens (red) upphetsad av de två foton laserexcitation våglängd av 780 nm laser. Spektra härledda visas vid den högra sidan av de multispektrala data som överdras och pseudo färgad enligt profilen emission. (B) De individuella spektrala lagerplatser där signalerna samlats vid 10 nm intervall för att härleda spektra och bilden i (A). Anmärkning att de två olika komponenter, en centrerad vid ca 500 nm (chromatophore autofluorescens) och den andra över 675 nm (klorofyllfluorescens). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 Samma bilder i figurerna 7A och 7B, oblandat spektrala data med hjälp av programvara och deras motsvarande utsläppstoppar / spektra. Både M. annularis och M. faveolata, de spektrala komponenterna är mycket lika, liksom sina utsläppstoppar. Den signifikanta skillnaden är emellertid på grund av placeringen av dessa spektrala komponenter och deras överflöd (se figur 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Två-foton fluorescens 3D-bilder av korallpolyper från M. annularis (AD) och M. faveolata (EH). (A och E) avbildades med ingen spektral separation av komponenter med hjälp av 780 nm excitation av två-foton-laser, med den optiska signalen samlas 450-700 nm. (B och F) samlades med samma excitation (780 nm), men två PMT detektorer användes samtidigt för att samla in data från två komponenter dvs., Ett 500-550 nm (grön-chromatophore autofluorescens) och den andra 650 720 nm (röd-klorofyll fluorescens). (C och G) är djup kodade bilder av(B och F), är röd grundaste och blått är djupaste komponenterna i 2D. (D och H) är YZ bilder av snitt genom (B och F) respektive visar fluorescens kommer bara från ytan av koraller och skelettet har ingen fluorescens vid 780 nm excitation. Notera den stora skillnaden i chromatophore innehåll mellan de två koraller. The M. annularis habitat (0-10 m WD) är grundare än M. faveolata habitat (10-20 m WD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10. tiopotenser hierarkisk rumslig struktur studier of korallrev ekosystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
SI Figur 1 Skärmbilder som visar stegen (AI) är inblandade i skapandet av 3D-volym och isosurface rendering från antingen SBFI data eller 2Photon mikroskopi med hjälp av bildanalysmjukvara (se Material tabell). (A) 2D skivor av rå data i slice läge visar ett enda plan; (B) 3D-volymen av alla 2D skivor; (C) att skapa guiden isosurface med ett område av intresse (ROI) valt; (D) en algoritm med en bakgrund subtraktion valt; (E) ett tröskelvärde tillämpas för att plocka upp de pixlar som repret data; (F) mittpunkter ytan utsäde; (G) en volymbaserad filtret tillämpas för att eliminera mindre volym av skräp och brus; (H) det slutliga 3D-renderade isosurface; (I) nyckelram animation guiden för att skapa filmerna som i SI videor. De slutliga renderade bilder visas i både volym och isosurface formerna i SI Videor 3-7. Protokollet steg 3.1.3-3.1.5 täcker dessa förfaranden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Material / utrustning | Företag | Katalog / Modellnummer | Kommentar / Beskrivning |
| Coral Tissue Skelett | Inget | Inget | 2,5 cm BioPsy från naturliga livsmiljö |
| Bågstans Coring Device | CS Osborne and Company | Nr 149 | För Coral biopsi samling |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | RT 15.700 | 16% spätts |
| Histoclear / Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64.111-04 | Giftfri suppleant till Xylen, uttorkning och Deparafinization |
| Xylen och Etanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydrering |
| Paraffin | Richard Allen Scientific | Typ H REF 8338 | Infiltration lösning |
| Vybar | The Candle Maker | Inget | Del av Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | Inget | Del av Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque bakgrund |
| Vetegroddagglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | För märkning Coral Slem |
| Prolong Guld | Life Technologies | P36095 | Anti-fade montering media |
| Fluor Dish | World precisionsinstrument | FD-35 till 100 | För två-photon avbildning |
| XY Motor, Driver och Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY translationsrörelse |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting allt vax |
| Konvektion Ugn | Yamato | DX-600 | Infiltration och inbäddning |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | |
| Mikrotomen | Leica | RM2055 | Engångs knifes |
| Stereo mikroskop | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Mål |
| Fluorescensmikroskop med ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Bildåtergivning tunn sektion av en polyp: Zooxanthellae |
| AxioCam kamera | Carl Zeiss | MRM | Monokrom kamera 1388x1040 pixlar |
| AxioVision Mjukvara | Carl Zeiss | Version 4.8 | Bildförvärvsprogram |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai EHP, pulsad laser (70 fs) | Med DeepSee modul |
| Laserskanning Mikroskop | Carl Zeiss | LSM 710 med Spectral Detector | 34kanal PMT detektion |
| Zen Programvara | Carl Zeiss | 2010 eller senare | för två-foton och spektrala bild förvärv |
| Imaris Suite | Bitplane, Inc., | Version 7.0 eller högre | 3D volym, Iso-yta rendering, visualisering |
Tabell 1. Nyckel material, utrustning, mikroskop, och programvara som används i denna studie.
SI Video 1. in situ vattensfält video som visar korall livsmiljö vid 12 m WD M. faveolata vid Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. Individuell 2D serieblockansiktsbilder av den renderade 3D-bilder som visas i Figur 4E.
SI Video 3. isosurface 3D-renderade serieblockansiktsbild som presenteras i Figur 4E och SI video 1 visar topografi korall polyp.
4. SI Video 3D-volymen återges rådata två foton mikroskopi bild av korall polyp M. faveolata. Den excitation är 780 nm och emissions fångas samtidigt vid två bandbredder för zooxanthellae (pseudo-färgade röda, 600-700 nm) och chromatophores (pseudo-färgade gröna, 500-550 nm).
SI Video 5. 3D-volymen återges i isosurface-spots två foton mikroskopi bild av korall polyp M.faveolata. Den excitation är 780 nm och emissions fångas samtidigt vid två bandbredder för zooxanthellae (pseudo-färgade röda, 600-700 nm) och chromatophores (pseudo-färgade gröna, 500-550 nm).
6. SI Video 3D-volymen återges rådata två foton mikroskopi bild av korall polyp M. annularis. Den excitation är 780 nm och emissions fångas samtidigt vid två bandbredder för zooxanthellae (pseudo-färgade röda, 600-700 nm) och chromatophores (pseudo-färgade gröna, 500-550 nm).
SI Video 7. 3D-volymen utförda isosurface-spots två foton mikroskopi bild av korall polyp M. annularis. Excitationen är 780 nm och emissions fångas samtidigt vid två bandbredder för zooxanthellae (psEUDO färgat rött, 600-700 nm) och chromatophores (pseudo-färgad grön, 500-550 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korallrev forskning är en mycket tvärvetenskaplig forskningsinsats, som innebär analys av den samtidiga fysiska, kemiska och biologiska fenomen som verkar i den marina miljön. Studien av komplexa korallrev ekosystem är därför bäst avslutas inom en "Powers of Ten" kontextuella ram (Figur 10). Denna grafiska sammanställning visar att korall ekosystem omfattar ett brett spektrum av rumsliga dimensioner (10 -9 till 10 5 m). Dessutom illustrerar denna övning som geobiologiska analyser vid en mellanliggande längd skala av 1 mm-1 cm är bron som behövs för att kombinera fält och laboratorieanalyser. Detta tiopotenser ram är ramen för experimenten, analyser, modellering och syntes av fysiska, kemiska och biologiska parametrar som styr Curaçao korallrev ekosystem.
Den aktuella studien är den första att tillämpa den fullt integrerad svit of FM, SBFI och CLSM tekniker för att spåra svaret av till synes friska koraller att öka vattendjupet. Ljusmikroskopi verktyg tillgängliga för bild hel vävnad eller tjocka biologiska prover har begränsats på grund av en mängd olika optiska restriktioner som utfärdats av proverna själva, bland annat absorption, spridning och andra fenomen. Inom bara det senaste årtiondet, var SBFI svepelektronmikroskop som används vid ultrahöga upplösningar 31 samt lätta mikroskopisk avbildning med brett fält baserade SBFI avbildning av flera biologiska prover. Detta har inkluderat analyser av allt från hjärna till hela hjärtvävnad och även prover som innehåller ben som var slipat, polerat, märkta, och avbildas på samma gång efter varje avsnitt gjordes 23-29. Nyligen var fluorescens och konfokalmikroskopi användes för att avslöja de konturer, form och fördelning av proteiner och pigment i biologiska prover 32-33. Men 3D-strukturen av enskilda korall polyper had inte tidigare lösts. Förutsättningen för SBFI med korallprover är urkalkning, eftersom kalciumkarbonat måste tas bort innan rendering proven lämpar sig för infiltration och snitt med hjälp av en vanlig mikrotom.
Det är här två-foton fluorescensmikroskopi blir oumbärlig för analys av biologiska vävnader på grund av sin unika tvåfotonexcitering fenomen. Detta ledde till förlängd djupavkänning 33-34 av korall vävnader i den aktuella studien, där urkalkning steget elimineras effektivt på grund av den olinjära tvåfotonexcitering fenomen 34. Dessutom precompensation modulen med två-foton laser som mycket kortare pulsbredd, som dessutom förbättrade penetrationsdjup. På provsidan, eftersom kalciumkarbonat inte absorberar nära infrarött ljus vid 780 nm, är djup penetration begränsas vanligen av den arbetsavstånd av målet. Ännu en annan nackdel of avkalkning och borttagning av korallskelett är förlust av strukturell integritet korallvävnad, vilket gör vävnadsvolymskattningarna ännu hårdare efter att provet har gått igenom flera uttorkning och rehydrering steg och bädda in vattenfritt vax. Detta understryker vikten av att fastställa korall vävnadsvolymer både före och efter behandling.
Den konfokala karakterisering av fluorescerande proteiner av koraller har avslutats för Great Barrier Reef koraller och de skyddande spektrala egenskaper har satts i samband med djup korall livsmiljö 32. I denna studie visar vi för första gången med två-foton mikroskopi att det finns en avsevärd minskning av chromatophores allt på djupt vatten korall utom i munnen vävnader. Dessutom har de distinkta förändringar i fördelningen av zooxanthellae med avseende på de chromatophores observerats över djup transekter i M. annularis, where de grunda havskorallvävnad är helt täckta med chromatophores. Med den resolution som den höga förstorings imaging (figur 8C och 8D), kan vi nu exakt kvantifiera area och volym upptas av zooxanthellae och deras vävnadsdensitetsförhållanden kan bestämmas med avseende på andra cellkomponenter. Sammantaget har gett integrationen av SBFI och två-photon fluorescens spektral avbildning i föreliggande studie oerhört viktiga nya insikter i morfologi och struktur korall vävnader. Dessa uppgifter kommer att bidra till att kvantifiera de enskilda komponenterna i korallvävnad, antingen på individnivå polyp eller på kontextuella nivå samspelet mellan koloniala polyper på en hel korallhuvud. Detta sammanhang kommer nu tillåta adaptiv respons av korall holobiont till förändringar i havsnivån vattendjup och strålningen som kvantitativa spåras och förutspådde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
