Summary
Görüntüleme tekniklerinin entegre bir takımdır Karayip mercan Montastraea annularis ve M. polip morfolojisi ve doku yapısını belirlemek için uygulanan olmuştur faveolata. Floresan, seri blok yüz ve iki foton odaklı lazer tarama mikroskopisi lobate yapısı, polip duvarlar ve tahmini chromatophore ve zooxanthellae yoğunluklarını ve dağılımlarını belirledik.
Abstract
Görüntüleme tekniklerinin entegre bir takımdır Karayip resif bina mercanlar Montastraea annularis ve M. oluşan üç boyutlu (3D) morfoloji ve polip dokuların hücre yapısını belirlemek için uygulanan olmuştur faveolata. Bu yaklaşımlar, floresan mikroskobu (FM), seri blok yüz görüntüleme (SBFI) ve iki-fotonlu lazer konfokal tarama mikroskobu (TPLSM) içerir. SBFI fiziksel kestileme sonra derin doku görüntüleme sağlar; fazla 2 mm doku derinliklerine doku yüzey dokusu ve 3D görselleştirme ayrıntıları. Doku hücresel yapının Tamamlayıcı FM ve TPLSM verim ultra-yüksek çözünürlüklü görüntüler. Sonuçlar: (1) dış bireysel mercan poliplerinin duvar ve daha önce bildirilmemiştir loblu doku morfolojileri tanımlanan (2) kromatoforların ve algler gibi dinoflagellat zooxanthellae endosimbiyont 3D dağılımı ve doku yoğunluğunun birinci yüzeyi haritaları hazırlandı. Spektral soğurma bezelye500 nm ve 675 nm ks, sırasıyla öneririz M. annularis ve M. faveolata klorofil ve kromatoforların benzer türlerini içerir. Ancak, M. annularis ve M. doku yoğunluğu ve bu anahtar hücresel bileşenlerin 3D dağılımında önemli farklılıklar sergilerler faveolata. Görüntüleme yöntemleri odaklanarak bu çalışma SBFI dekalsifiye mercan dokuların büyük mm çaplı numune analiz için son derece yararlı olduğunu gösterir. Ücretsiz FM ve TPLSM nondecalcified mercan doku örneklerinde hücresel dağılımı ve yoğunluğu ince milimetreden ölçek değişikliklerini ortaya koymaktadır. TPLSM tekniği verir: (1) minimal invaziv numune hazırlama, (2) üstün optik kesit yeteneği, ve (3) minimum ışık emme ve saçılması, hala derin doku görüntüleme izin verirken.
Introduction
Küresel ısınma ve eşlik eden çevresel değişim, doğrudan tropik deniz mercanlar 1-4 sağlığını ve dağıtımını etkiliyor. Birden etkiler Mercan ağarması ve bulaşıcı hastalıkların 5-6 ortaya çıkması gibi, izlenmektedir. Ancak, bu çevresel tehditlere gelecek mercan yanıtı daha doğru tahmin histolojik "temel" "görünüşte sağlıklı" mercanlar için doku morfolojisi ve hücre yapısını ve dağılımını tanımlayan, kurulacak gerektirecektir. Buna karşılık, mercanlar ardından nicel mukayese edilebilir "etkiledi". "Sağlıklı yanıtı" Ayrıca çevresel geçişlerini karşısında teraziye böylece Ayrıca, bu temel, çevre koşulları altında çeşitli görünüşte sağlıklı mercanlar için kurulmalıdır. Bu temel oluşturma yönünde bir ilk adım olarak, yüksek çözünürlüklü 3D çalışma ne kadar görünüşte sağlıklı mercan polip dokusunun üstlenilmiştirmorfolojisi ve hücresel kompozisyon güneş ışığı parlaklığındaki su derinliği arttıkça (WD) ve eşlik eden düşüşler yanıt verir. Sonuçlar daha sonra mercan adaptasyon daha kapsamlı bir mekanistik anlayış kurmak için, yanı sıra mercan-symbiont evrim içgörü ve hafif hasat geliştirme kazanmak için kullanılabilir.
Stony mercanlar (Scleractinia) toplu mercan 7-10 holobiont olarak anılacaktır diğer mikroorganizmaların karmaşık bir montaj, ev sahipliği sömürge deniz omurgasız hayvanlardır. Bu çalışmada gerçekleştirilen araştırma eş zamanlı doku pigmentlerin artan su derinliği ve görünüşte sağlıklı konak mercan simbiyotik zooxanthellae ile değişiklikleri izlemek için üstün görüntüleme teknolojileri paketini kullanmak istiyor. Bu mercan İşitme göstergeleri olarak, görünüşte sağlıklı mercanlar ve eylem için bir batimetrik degrade boyunca gerekli karşılaştırmalı doku hücresi "dayanak" kuracaklth 10. Mercan pigmentler denilen Kromatofor, absorbe yansıtmak, dağılım, kırmak, kırabilen, ya da başka güneş radyasyonunun 11 ile müdahale hareket. Zooxanthellae-chromatophore endosimbiyotik ilişkisi mercan hayvan 12 stratejik avantajlı ışık hasat optimizasyonu ve iskelet büyüme stratejileri Birlikte evrimin varlığını, yanı sıra besinsel plastisite (vites besleme stratejilerini autotrophy heterotrophy kadar geri ve ileri-) sağladı.
Curaçao güney Karayip ada ülkesi (Hollanda Antilleri eskiden parçası) Aruba La Blanquilla takımada (Şekil 1A) uzanımlı doğu-batı içinde yaklaşık 65 km kuzeyinde Venezuela yatıyor. Curaçao 70 km uzunluğundaki güney sahili modern bir sürekli ve Miyosen-Pliyosen-Pleistosen-Holosen antik saçak mercan kayalığı yollarını 13,14 içerir. Curaçao yaklaşık 3 ° C Bir değişir yıllık SST ortalamanually, 27.5 ± 0.5 ° C arasında bir yıllık ortalama sıcaklık, erken Eylül ayında 29 ° C maksimum Ocak ayı sonlarında 26 ° C minimum değişen (NOAA SST Veri 2000-2010, ayarlar). Daha önce iyi çalışılmış ve olmuştur çünkü Curaçao (Şekil 1A) kuzeybatı ucuna yakın yalan Playa Kalki de mercan kayalığı (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), örnekleme için seçildi Bu konumda deniz ekosistemi taze kirlenmemiş deniz suyu 7,15-19 yıkanıyor. . İki yakından ilgili scleractinian mercan türlerinin, M. annularis ve M faveolata, bu çalışmada deney ve analiz için seçildi her türün çünkü: (1) raf tatili ve bakımından resif sistem üzerinde sergileyen belirgin bir biçimde farklı ve örtüşmeyen batimetrik dağılımları ilişkili karbonat çökel çökelme ortamları (M. annularis aralık = 0-10 m WD M. faveolataaralık = 10-20 m, WD 20, Şekil 1B, 2A ve 2B); (2) Karayip Denizi 21 genelinde yaygın bir mercan resif çatısı kurucusudur; ve (3) iyi çalışılmış ekolojik, fizyolojik ve evrimsel ilişkileri 22 sahiptir.
Bu çalışma için alan örnekleme deniz Curaçao'da Playa Kalki standart Dalış teknikleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bir sığ-to-derin su batimetrik transekt raf tatili boyunca rafta koştu kuruldu ve derin su ön resif ortamlara edildi. (1) üç ayrı M. ~ 1 m çap mercan başkanları: Görünüşe sağlıklı mercan başkanları sonra da dahil olmak üzere, bu batimetrik transect boyunca örnekleme için tespit edildi 5 m su derinliğine (WD) idi hepsi annularis; M. ve (2) üç ayrı ~ 1 m çap mercan kafaları faveolata, her biri 12 m WD vardı. Fotosentez için aktif radyasyon (PAR) 33-36% P olarak ölçüldü5 m WD'nin en AR ve 10 m WD 18-22% PAR. SST 5 m ve 12 m hem derinliklerdeki 26 ° C iken Örnekleme Ocak ayında yapılmıştır. Bu altı mercan başkanları Her (yani. Altı yarım küre mercan başkanları her birinde yaklaşık 45 ° N enlemi) eşdeğer mekansal konumlarda üç nüsha örnekleri alındı. Her bir numune, bir temizlenmiş zımba ile toplandı, 2.5 cm çapında bir mercan doku iskelet biyopsiye oluşuyordu. Üç mercan doku-iskelet biyopsileri mercan başkanları her birinden eldivenli elleriyle standart SCUBA örneklenmiştir (M. 9 5 m WD koloniler annularis ve M. 9 ila 12 m WD de faveolata). Hemen derinlikte toplanarak her bir biyopsi örneği çekirdek, steril bir 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne yerleştirilmiş, vidalı kapaklı kapalı ve yüzeyin geri döndü. Deniz suyu, her santrifüj tüpüne dekante edildi ve her bir çekirdek biyopsisi daha sonra, daldırma, depolanması ve% 4 paraformaldehid içinde taşınmıştır.
23-30 hayvansal örneklerin çok sayıda türleri dahil olmak üzere biyolojik numunelerde geniş bir yelpazesi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Floresan veya parlak bir alan teknikleri ile ya optik / ışık mikroskobu kullanılan bu çalışmaların çoğu. Ancak, çalışmalar son 31 tarama elektron seri blok yüz görüntüleme kullanarak ultra-yüksek büyütme yapılmıştır. Bu çalışmada, bir tadil edilmiş SBFI protokolü geliştirilmiştir ve ilk kez mercan uygulanır. M. Çünkü annularis ve M. faveolata mercan polipleri kalınlığı 1-2 mm olan, ışık mikroskobu rutin tekniklerden herhangi birinin mercan polip dokusunun bütün kalınlığı içinden geçebilme kabiliyetine sahip olacaktır. Bu nedenle, özellikle mercan örnekleri için tasarlanmış SBFI numune hazırlama protokolü var. Ayrıca, özel bir stereomikroskopta tutucu tasarladık, X ve y doğrultularında hareket motorlu hangi. Bu cihaz, oldukça mikroskop önünde düzenli mikrotom kullanılarak bölümleri toplama daha numunenin blok yüz görüntülerini alır. Ayrıca mercan dokuların bütün kalınlığı boyunca görüntü aynı mercan polip bir doğrusal olmayan optik iki-fotonlu mikroskopik tekniği sundu. Bu yumuşatma açısından ve numune hazırlama (dehidratasyon) ve işleme protokolleri tarafından uyarılan olabilir doku morfolojisi ve hacim (büzüşmesi) değişim olasılığı SBFI tarafından dayatılan sınırlamaların üstesinden gelir. Ayrıca, mercan emisyon profilleri spektral kromatoforların ve fotosentetik zooxanthellae arasındaki tepe emisyonlarını ve varyasyonları belirlemek için çözüldü. Bu sonuçlar, kullanılan yöntemin bağlamında elde etme süresi ile ilgili bireysel avantajları, süre ve str ödün vermeden ince yapı ayrıntıları çözmek için yeteneği değerlendirilmiştirmercan dokusu uctural bütünlüğü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Reaktifler Mercan Örneklerinin Seri Blok Yüz Görüntüleme için hazırlanacak
1. Preinfiltration Wax
- , Bir cam beher içinde, STEARINI pullarının 3.6 g eritin. Sıcak bir plaka (60-70 ° C) için iyice karıştırın.
- Sudan IV 400 mg ekleyin (balmumu arka floresan en aza indirmek için). İyice karıştırın ve bir kırmızı saydam solüsyon elde edilene kadar bekleyin.
- 96 ml sıcak erimiş parafin (% 100) ekleyin ve iyice karıştırın.
1.2) Gömme Wax
- , Bir cam beher içinde, STEARINI pullarının 7.2 g eritin ve sıcak bir plaka üzerinde iyice karıştırılır (60-70 ° C).
- Sudan IV 0.8 g ekleyin. İyice karıştırın ve bir kırmızı saydam solüsyon elde edilene kadar bekleyin.
- Parafin granülleri (162 gr) ekleyin ve parafin, tamamen eriyene kadar karıştırın.
- Beyaz granül yapısında bir Vybar 30 gr eklemek ve aynı beher içinde tamamen eritmek; Ergitildikten sonra karıştırılır.
- Gevşek bir kapak ile cam şişe kapatın. 60 ° C'lik bir konveksiyon ov cam şişe yerleştirintr sıvı halde tutmak için maddeler. Bu fırında bütün sızmaları yürütmek.
- 100 ml her biri iki cam şişe içinde 200 ml kırmızı mum toplam hacmi bölün. Bir sızıntı için alikosunu ve nihai gömme için diğer kullanın.
1.3) Seri Blok Yüz Görüntüleme için gömülmesi Mercan Dokular
- Fosfat tamponlu tuzlu su (3 x 5 dk) (paraformaldehid içinde 4-5 ° C de 3-6 ay) mercan alana (SI video 1) içinde toplanır ve saklanan polipleri yıkayın ve hazır yansıması zaman kirecini. 24 saat boyunca ya da polipler CaCO 3 tamamen yoksun olarak Excal kadar çözelti içinde polipler kirecini. Örnekleri kurutmak için 1x iksilen yerine, ardından bir 25, 50, 75, ve% 100 etanol serileri içerisinde, tek bir blok olarak birkaç polipler kireçlenmiş mercan inkübe edin.
- % 100 ksilen yedeği içeren önceden ısıtılmış 65 ° C fırında işlenmiş polipler yerleştirin. Changi ile iki kere 30 dakika süre ile inkübetaze çözelti kadar değişmektedir. Poliplerin yukarıdan aşağıya bakan üst yüzeyi mümkün olduğu kadar düz olduğu şekilde polipler döndürün.
- 1: 1: 1 ve 1: 2 solüsyonlar yapmak yerine 2 ksilen ve 50 ml Falcon tüpleri içerisinde preinfiltration balmumu (adım 1.1).
- 30-60 dakika, her seferinde 100% preinfiltration mum 3x inkübasyon takip preinfiltration balmumunun bu üç artan konsantrasyonları ile mercan polipler inkübe edin.
- Not: numunelerin kalınlığına bağlı olarak, basamak 1.3.1-1.3.5 daha uzun bir süre ile arttırılabilir.
- Balmumu gömme örnekleri taşı 100% preinfiltration mum 3x inkübasyondan sonra (adım 1.2.6 bakınız).
- 30 dakika sonra gömme balmumu çıkarın. Taze gömme balmumu ile değiştirin ve 65 ° C'de 4 saatlik bir inkübasyon en az devam etmektedir.
1.4) Kırmızı Wax katıştırma
- Bloğu (beyaz mum yerleştirilir ve üstüne bir paslanmaz çelik tepsiyi fotoğraflamak hangi sample) yerleştirilir. Bir kez balmumu içine alınır, bu gereklidir, numunenin yer gömülü kırmızı mum opak olarak görünmez hale gelecektir.
- Yeni ısıtılmış paslanmaz çelik gömme kalıp etrafında yüksek erime noktası balmumu küçük damla koyun ve soğumasını bekleyin. Adım 1.2.6 belirtildiği gibi ikinci konteyner taze erimiş gömme balmumu küçük bir hacim dökün.
- Beyaz mum nokta üzerine hızlı bir şekilde bakacak mercan polip yerleştirin, daha sonra paslanmaz çelik tepsi üzerine plastik bir numune tutucu yerleştirmek ve balmumu plastik kalıp yüzeyine kadar gelir ve böylece daha fazla balmumu gömme dökün.
- 65 ° C fırında dışarı tüm kurulum alın ve mumu tamamen sertleşir kadar bir tezgah ya da serin bir yüzey üzerinde soğumasını bekleyin.
- Bu gün ya da iki 6 saat kadar sürebilir. Uzun süreli depolama için ışıktan korumalı 4 ° C 'de bir buzdolabında kurutulmuş blok, koyun.
1.5) Seri Blok Yüz Kur at Kesit
- Trblok im ve mikrotomu ile 1 mikron bölümleri kesti. Onlar tozu gibi olacak gibi bölümleri toplamak etmeyin. Biz sadece blok yüzünü görüntüleme vardır, unutmayın. Beyaz mum yok başladığı zaman örnek görüntülenir.
- Örneklemin bir bölümü kaldırıldı her zaman içeren düzgün blok yüz görüntüleri yakalayın. Mercan polip SI Videolu 2 olarak kaybolana kadar devam edin.
- Tutanak / Kromatofor / mercan polip otomatik floresan almak için bir FITC floresan filtre kullanarak siyah beyaz kamera ile görüntüleri yakalayın. Görüntü her türün 3-4 dekalsifiye çekirdekler.
2. Görüntüleme Mercanlar altında İki foton Floresan Mikroskopi
- Kısa sürede su altında hasat gibi her toplama (deniz kıyısında) yerinde% 4 paraformaldehitte, çapı yaklaşık bir inç etrafında 10-12 polipleri içeren, mercan polip çekirdekleri Fix.
- Görüntüleme kadar 4 ° C 'de örnekleri tutun. Yıkanmış çekirdek inci yerleştirilirbaş aşağı bir kapak cam alt çanak e aynı solüsyonu (0.17 mm kalınlığında).
- 10X (0.3 NA) objektif kullanılarak 780 nm uyarma, görüntü iki farklı büyütme (dijital zoom) 3-4 polipler bir iki foton lazer kullanılarak. Mercan polip şekli ve yüksekliği de görüntüleme objektif çalışma mesafesi ile sınırlıdır numuneler (genellikle 1-2 mm) ve görüntüleme derinliği arasında değişmektedir.
- Etrafında 5.000-10.000 görüntüleri, toplamda 10 veya 20 mikron aralığında z ekseni boyunca xy odak düzlemi başına görüntüleri ve 50-100 görüntüleri yaklaşık 25-100 (5 x 5 veya 10 x 10 fayans) toplamak için karo tarama modunu kullanın / mercan polip.
- Dört polip alanlara Görüntü üç çekirdek ve mercan türleri temsil etmek. NOT: Görüntü alma süresi 2-5 saat / polip alanı arasında değişir.
- LSM 5. 3D görüntü analizi ve rendering yazılımları 3D Render gibi sistemin sabit diskine ham veri formatında tüm görüntüleri saklayın.
3. 3D Volume Rendering ve VisualizatioSBFI n ve İki foton spektral Floresan Veri
- Programda kare kırpma aracını kullanarak tek bir polip üzerinde odaklanarak dosya boyutunu azaltmak ve derleme bir tek tiff dosyası olarak toplama yazılımı (8 bit formatında kaydederek de dosya boyutunu azaltmak) için 2D verileri kırpın.
- Imaris hacim algoritması altında modülünü Aşan programında SBFI verilerin monte dosyaları (adım 1.5.1 toplanan) veya (adım 2.1.4 toplanan) iki foton optik bölümden kiremitli çoklu z yığınları açın.
- Bir gölge projeksiyon kullanarak 3D render SBFI verileri yansıtın. Vokselden bir katı yüzey deseni (SI Video 3) oluşturmak için eşiklenir olduğunuz bir isosurface modu oluşturun.
- Mercan 3D yapısı ve şekli ortaya çıkarmak için xz, xy bir kırpma düzlem algoritması kullanarak 3D projeksiyonları ve yz dik modları gözünüzde canlandırın.
- Aynı Imaris programda bir anahtar kare animasyon modülünü kullanarak projeksiyonlar animasyon (SI ViDEOS 3-7).
- 5% sıkıştırmada video dosyalarını oluşturmak ve hacim kullanarak avi formatında bir film klipleri oluşturmak (SI Videolar 4 ve 6), 3D ve Isosurface modaliteleri (SI Video 5 ve 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(Bu çalışma için özel olarak üretilmiş; Şekil 3) Bir özel tasarlanmış SBFI cihaz M. dış yüzey dokusu ve morfolojisi ilk detaylı 3D sayısal yükseklik haritaları (DEM) üretildi annularis ve M. faveolature mercan polipleri (Şekil 4 ve SI Videolar 1-2). Bu eş, her polip (Şekil 4B, 4D ve 4E) merkezinden dışa doğru yayılan mercan dokusu daha önce tanımlanmamış yığılmış lob görüntüleri vermiştir. Bu loblar radyal dış ve alt yükseklik lobları sonunda sentezlenmesi ve polipler arasındaki coenosarc dokuları ile birleştirilmesi ile, doku kaplı birincil ve ikincil iskelet septum üst sırt boyunca dizilir. Mercan doku örneği yüksek sıcaklık sızma ve katıştırma çeşitli adımlarda gitmiş olmasına rağmen 3D polip şekli ve ilişkili lobları iyi korundu. AdditioSiyah renk her numunenin kontrast üst düzeye çıkarmak ve sinyal-gürültü oranını artırmak için yardımcı olan Sudan boya n başarılı bir şekilde opak olarak arka maskeli. 3D ve dik düzlem görünümleri z-ekseni (Şekil 4B) boyunca floresan bileşenlerin dağılımını gösterdi. Bazen projeksiyonlar oluştururken netlik için çıkarıldı polip yüzey ayrıntılarını, belirsiz balmumu gevreği ile uçaklar vardı. Bu tekniğin en büyük avantajı, böylelikle birden fazla bölümleri almak ve daha sonraki bir zamanda onları hizalamak için ihtiyacı ortadan kaldırarak, herhangi bir kalın numunenin iç ayrıntıları ortaya olduğunu. En fazla 10 mm veya daha büyük bir örnek büyüklüğü ile en fazla 1 um az bir çözünürlük sağlayarak (Şekil 4A) toplandı Bundan başka, bu teknikte görüntüler zaten hizalanmıştır (mikrotom blok tutucu toplam mesafeye göre tahrik ). Bu farklı oto-floresan (çoklu filtreler kullanılarak) bileşenlerin yanı sıra, bireysel olarak ayırt etmek mümkündürzooxanthellae daha yüksek bir büyütmede, görüş alanı azaltılmış olarak kabul edilebilir olması koşuluyla.
Apotome optik kesit floresan mikroskop bir milimetreden çözünürlükte mercan doku hücreleri (zooxanthellae ve Kromatofor) ve yüzey doku yapısının dağılımını ortaya koydu. Bu nedenle, 6-13 mikron çapında zooxanthellae kolaylıkla anlaşılabilir ve doku hacmi başına hücre sayısı açısından (Şekil 5) ile niceliksel olarak belirtilmiştir. Klorofil floresan (yeşil) ve WGB Alexa 647 ile etiketlenmiş mukus kullanarak çift kanal görüntü alma (kırmızı ile gösterilen), polip belirli bir konum içinde mukus düzeyi ve zooxanthellae sayısını ölçmek için iyi çalıştı (majör ve minör polip septumları) bağımsız hesaplanabilir.
Bu mikroskop yaklaşımlara ek olarak, aynı zamanda TPLSM yaygın olarak kalın biyolojik numuneler için, doğrusal olmayan bir teknik uyguladık. Over üzerine TPLSM önemli avantajlarıE-foton sürekli dalga lazer belirtilmektedir: uyarma ışık yoğunluğunun karesi güç olur ve fluorofor sınırlıdır iki ardışık fotonları emmek için bir molekülünün rastlantısal bir elektron uyarmak için, çünkü (1) tahrik odak noktasında yalnızca oluşur Hedef alanında derinliğine, böylece doğal confocality sağlar. tek foton lazer aksine olarak, örneğin daha derinlemesine nüfuz ederken ve (2) bir sonucu olarak, bir uyarım fotonun kaybı olacaktır. Buna ek olarak, birçok biyolojik doku numuneleri aynı zamanda görünür ışık emer. Iki foton uyarım (780 nm 'de yakın-kızılötesi bölgesindeki) doğal olarak uzun olduğu için, emme esasen en aza indirilir. Öte yandan, kalsiyum karbonattan oluşan mercan iskelet ancak emer ya da iki-fotonlu ışık yayar. Biz sadece mercan iskeletinin konturlu yüzeyi üzerindeki objelerin dağılımını belirlemek ilgilenmişlerdir çünkü sonunda, biz bu yöntemi ver kullanarak derin görüntüleme bulundumercan görüntüleme için uygun y.
Biz M. mevcut spektral imzaları karakterize çalıştınız annularis (Şekil 6-9). Burada zooxanthellae ikinci klorofil flüoresans yaklaşık 675 nm (Şekil 6) arasında merkezlenmiş olur ise 780 nm, iki foton uyarılması altında kromatofor oto-floresan, 500 nm'de bir değere sahip olduğunu göstermektedir. Iki bileşen arasında açık bir spektral mesafe aynı anda kanıtlamış iki dalga boyları iki dedektör kullanarak görüntülenmesi, olmadığı için bu spektral verileri (Şekiller 6-7) içinde karışmama, yazılım bir karışmama algoritma ile de (Şekil 8) mümkün olmasına rağmen en çok zaman tasarrufu tekniği olmak. Örnek kiremitli ve doku bir bütün olarak 1-2 mm derinliğinde üzerinde görüntülü olduğunda bu özellikle doğrudur. Bu konumu ve numune, polip başına birkaç bin görüntüler gerektirir fiziksel kesit için gereksinimini ortadan kaldırır. Dağıtım O f oto-floresan Kromatofor ayrıca test edilen iki mercan türler arasında belirgin (Şekil 9) 'dir. Bir durumda, biz mercan M. konut sığ-su kromatoforların önemli bir artış gözlenmektedir derin su M'ye göre annularis faveolata (Şekil 9 ve SI Video 3 ve 4).
Adanın kuzeybatı rüzgâraltına kıyısındaki Playa Kalki de çalışma alanının yerini gösteren Güney Karayip Denizi'nde Curaçao Şekil 1. (A) Haritası. (B) Curaçao'da Knip de resif kenarlı rafının şematik kesiti, M. su derinliği dağılımlarını gösteren annularis ve M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
M. 12 m WD de yerinde sualtı alan fotoğrafta Şekil 2. (A) Playa Kalki, Curaçao. (B) faveolata M. bireysel mercan polipleri gösteren (A) görüntü genişlemesini Close up gündüz aydınlatma koşullarında faveolata (her polip yaklaşık * tarafından, geri gösterilir bazıları çapı 2 mm, is). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
5in "src =" / files / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3. seri blok-yüz görüntüleme enstrümantasyon. (A ve B) özel olarak tasarlanmış mikroskop tutucu mikrotom yerleştirilen numunenin blok yüzüne bakan 180 ° Stereolumar mikroskop tutar. Her bölümde kaldırıldı, blok yüz görüntüsü amacı ile yakalandı ve 2D veriler dijital saklandı. Örnek blok kaybolana kadar bu yapıldı. Mikroskop motorlu bir x ve kurşun vida ve z ile y yönünde hareket ettiği için, ayar örnek odaklanma yapılır. Her örnek 1 um kesitli olduğunda, blok 1 um ileri doğru hareket eder, bu nedenle kapsam odaklanması dikkat etmek önemlidir gerekli değildir. XYMOT, Özel xy öteleme motorlu sahne inşa; FLS, Flüoresan ışık kaynağı; MT, Mikroskobik; MIC, Stereomikroskopta; CAM, Axiocam siyah beyaz fotoğraf makinesi; BH, Blok tutucu; BF, Blok yüzüNumune; FLL, blok yüzünde Floresan ışık uyarma nokta; OBJ, Mikroskop hedefi; HIP, İnsan arabirim paneli. Monokrom modda 1.388 yatay x 1.040 dikey piksel boyutunda bir resim, bir xy piksel 1.25 um (tek) çözünürlük toplanmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mercan M. Şekil 4. Seri blok yüz görüntüleme annularis ve M. Playa Kalki, Curaçao. toplanan faveolata (A) Örnek veri z 1 mikron çözünürlükte bir polip elde edilen bireysel 2D görüntülerin etrafında 800 görüntüler gösteren galerisi ayarlayın. Başka bir mercan numunede (B), kesit 2,00 üzerinde iyi gittiZ 0 um. Görüntü Imaris ses görselleştirme algoritmasını kullanarak gölge projeksiyon altında bir 3D hacme tüm 2D dilim multipl polipler ve derleme gösteriyor. (B) 'de numunenin bir xz görünümünü gösteren (C)' ortogonal projeksiyonu, bir 2 mm üzerine numunenin tüm derinliği görebilir ve oklar 2D dilimleri kalitesi nedeniyle uzaklaştırılmış olan siyah çizgileri gösterir; Bu görüntü M. dan annularis. SBFI verilerin 3D hacmi (D), Isosurface render (E) ve görselleştirme. (D) yan ve ortasında tek polip 3D hacim (gölge projeksiyon) üzerine, uzunlamasına kesitini polip morfoloji gösteren birden fazla mercan polipler. Herhangi bir açıda Kesit ve görselleştirme 3D mümkündür (SI video). 3D vokseller (D) bulanık olduğu, E., 3D Isosurface verilen yüzey mercan polip yüzeyi ve içeriğe dayalı konturunu gösterirbitişik polip (SI video) ile düzenleme. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mercan poliplerinin Şekil 5. Floresan mikroskopi. (A) M. bir dekalsifiye polip kesiti faveolata (yeşil renkte), mavi ışık altında klorofil otofloresans ile zooxanthellae ve kırmızı ışık altında görüntülendi olarak (kırmızı ile gösterilen) buğday tohumu aglütinini ile etiketlenmiş mukozal cepler sergileyen. Görüntü otomatik olarak iki kanala döşenir ve dikişli ve cihaz yazılımı kullanılarak hizalanmış. (B) Genişleme Payamalanı, (her biri yeşil daireler ayrı zooxanthellae gösterilen (A) 'da gösterilen kutuya, biryaklaxık 6-8 yeşil çapı mikron) ve yüzey mukus tabakası (kırmızı) ve her iki kanal birleştirme. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil mercan floresan 6. İki foton spektral karakterizasyonu. LSM 710 sistemin spektral dedektör kullanarak, tüm görünür spektrumu (419-722 nm) floresan sinyalleri yaklaşık 190 um arasında bir derinliği üzerinde taranmıştır. Görüntü z yığını için x ekseni 5 mikron de derinlik aralığını gösterir ve y ekseni 10 nm aralığında (1,154 etrafında görüntüleri göstermiştir toplam) edinilen nm 419-722 dalga boyudur. Bir iki spektral bileşenleri, tek bir 500 nm ve 650 nm'de ortalanmış ikinci görebilirsiniz. Bir iki-fotonlu lazer exci780 nm dalga boyu tation emisyon profilleri elde etmek için kullanılmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İki tayf bileşenlerinin Şekil 7. karakterizasyonu. (A), bir arka plan (mavi) spektrum profili, kromatoforların (yeşil) ve 780 nm lazer iki fotonlu lazer uyarım dalga boyu tarafından harekete klorofil flüoresansı (kırmızı) için otofloresans. Spektrumlar kaplanmış renkli spektral veriler sağ tarafında gösterilen ve yalancı renkli emisyon profiline göre türetilmiş. (B) sinyalleri spektrumunu ve (A) 'de görüntüyü elde etmek için 10 nm aralıklarla toplanır münferit spektral kutuları. Not iki farklı bileşenler, yaklaşık 500 nm (chromatophore otofloresansı) ve 675 nm (klorofil flüoresan) üzerinden diğer merkezli bir. ki bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7A ve Şekil 7B, aynı görsel spektrum verileri yazılımı kullanılarak karışmamış 8. ve bunların karşılık gelen emisyon tepe nokta / spektrumları. M. Her iki annularis ve M. faveolata, spektral bileşenlerin yanı sıra, bunların emisyon tepe çok benzer. Fark, ancak, bu spektral bileşenlerin ve bolluk yere için (bakınız Şekil 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
M. mercan poliplerinin Şekil 9. İki foton floresan 3D görüntüler annularis (AD) ve M. faveolata (EH),. (A ve E) 450-700 nm toplanan optik sinyali ile, iki-fotonlu lazer 780 nm eksitasyon ile komponent hiç bir spektral ayrılması ile görüntülendi. (B ve F) aynı uyarma (780 nm) ile toplanmıştır, ancak iki PMT dedektörler iki bileşenleri veri toplamak için aynı anda kullanıldı yani., 500-550 nm (yeşil-chromatophore otofloresans) ve diğer 650- itibaren bir 720 nm (kırmızı-Klorofil floresan). (C ve G) derinliği kodlanmış görüntülerdir(B ve F), kırmızı sığ ve mavi 2B derin bileşenleri. (D ve H) floresan mercan yüzeyinden sadece gelen ve iskelet 780 nm eksitasyon flöresanı bulunmamaktadır gösterilen sırasıyla ile kesim yz görsel (B ve E) 'dür. İki mercanlar arasındaki chromatophore içerik önemli farka dikkat edin. M. annularis yaşam (0-10 m WD) M. daha sığ olması faveolata yaşam (10-20 m WD). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 10. o çalışmaların On hiyerarşik mekansal yapısının Yetkilerif mercan kayalığı ekosistemler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SBFI veri veya görüntü analiz yazılımı kullanılarak 2Photon mikroskopi ya render 3D hacmi ve isosurface oluşturulması yer adımları (AI) gösteren SI Şekil 1. Ekran görüntüleri (Malzemeler Tabloya bakınız). (A) ham 2D dilimleri Tek bir dilim düzlemini modunda veri; (B) tüm 2D dilimleri 3D hacmi; (C) ilgi alanları (ROI) seçilen bir bölge ile isosurface oluşturma sihirbazı; (D) seçilen bir arka plan çıkarma ile bir algoritma; (E), bir eşik değeri, Represen piksel almak için uygulananveri t; (F) yüzeyin merkezi tohum noktaları; (G) hacmine göre filtre enkaz ve gürültünün ortadan kaldırılması için daha küçük bir hacim uygulanır; (H) isosurface render nihai 3D; (I) anahtar kare animasyon sihirbaz SI videoları gibi film oluşturmak için. Nihai render görüntüleri SI Videolar 3-7 hem hacim ve isosurface modaliteleri gösterilmiştir. Protokol 3.1.3-3.1.5 bu prosedürleri kapsar adımları. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Malzeme / Ekipman | Şirket | Katalog / Model Numarası | Yorumlar / Açıklama |
| Mercan Doku İskelet | Yok | Yok | 2.5 cm BIOPdoğal ortamdan sy |
| Arch Punch Karot Cihazı | CS Osborne ve Şirket | No: 149 | Mercan biyopsi toplama |
| Paraformaldehit | Elektron Mikroskopi Bilimler | RT 15700 | % 16 Pre-seyreltilmiş |
| Histoclear / Safeclear II | Elektron Mikroskopi Bilimler | RT 64111-04 | Ksilen, Dehidrasyon ve Deparafinizasyon olmayan toksik alternatif |
| Ksilen ve Etanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehidratasyon |
| Parafin Mumu | Richard Allen Bilimsel | Tip H REF 8338 | Sızma çözüm |
| Vybar | Mum Maker | Yok | Kırmızı Wax Bileşen |
| Stearin | Mum Maker | Yok | Kırmızı Wax Bileşen |
| Sudan IV | Fisher Kimyasal | S667-25 | Kırmızı Mum-Opak arka plan |
| Buğday Tohumu Aglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | Mercan Mukus etiketlemek için |
| Prolong Altın | Life Technologies | P36095 | Anti-solmaya montaj medya |
| Flor Bulaşık | Dünya Hassas Aletler | FD-35-100 | İki foton görüntüleme için |
| XY Motor, Sürücü ve Denetleyici | Lin Mühendisliği | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Hareketi |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Tüm mumu Eritme |
| Konveksiyonlu Fırın | Yamato | DX-600 | Sızma ve katıştırma |
| Doku İşlemci | Leica | ASP 300 | |
| Microtome | Leica | RM2055 | Tek kullanımlık bıçaklar |
| Stereo Mikroskop | Carl Zeiss | Stereolumar 12 V | 1.5x (30 mm WD) Amaç |
| Apotome ile floresan mikroskop | Carl Zeiss | Axiovert M 200, Apotome ben Sistemi | Bir polip ince bölüm Görüntüleme: zooxanthellae |
| Axiocam kamera | Carl Zeiss | MRM | Siyah beyaz fotoğraf makinesi 1388x1040 piksel |
| Axiovision Yazılım | Carl Zeiss | Sürüm 4.8 | Görüntü toplama programı |
| İki-Foton Lazer | Spectraphysics | Maitai EHP, darbeli lazer (70 fs) | DeepSee modülü ile |
| Lazer Tarama Mikroskobu | Carl Zeiss | Spektral Dedektör LSM 710 | 34Kanal PMT algılama |
| Zen Yazılım | Carl Zeiss | 2010 veya üstü | İki foton ve spektral görüntü elde etmek için |
| Imaris Suite Yazılımı | Bit-düzlemi, Inc | Sürüm 7.0 veya üstü | 3D Ses, Iso-yüzey Rendering, Görselleştirme |
Tablo 1. Anahtar malzemeler, bu çalışmada kullanılan ekipman, mikroskoplar, ve yazılım.
SI video 1. yerinde sualtı alan videoda M. 12 m WD de mercan habitatı gösteren Playa Kalki, Curaçao de faveolata.
SI Video 2. Fi gösterilen 3D render görüntünün Bireysel 2B seri blok yüz görüntüleriGüre 4E.
SI Video 3. Isosurface 3D render seri blok yüz görüntüsü mercan polip topografyasını gösteren Şekil 4E ve SI Video 1'de sunulmaktadır.
SI video 4. mercan polip M. 3D ses render ham verilerin iki-foton mikroskopi görüntü faveolata. Uyarma 780 nm ve zooxanthellae (pseudo-kırmızı renkli, 600-700 nm) ve kromatoforların (500-550 nm, sözde yeşil renkli) için iki bant genişlikleri aynı anda yakalanan emisyon olduğunu.
SI video 5. 3D ses Isosurface-noktalar mercan polip M. iki-foton mikroskopi renderlarımdafaveolata. Uyarma 780 nm ve zooxanthellae (pseudo-kırmızı renkli, 600-700 nm) ve kromatoforların (500-550 nm, sözde yeşil renkli) için iki bant genişlikleri aynı anda yakalanan emisyon olduğunu.
SI video 6. mercan polip M. 3D ses render ham verilerin iki-foton mikroskopi görüntü annularis. Uyarma 780 nm ve zooxanthellae (pseudo-kırmızı renkli, 600-700 nm) ve kromatoforların (500-550 nm, sözde yeşil renkli) için iki bant genişlikleri aynı anda yakalanan emisyon olduğunu.
SI Video 7. mercan polip M. 3D hacim render Isosurface-lekeler, iki-foton mikroskopi görüntü annularis. Uyarma 780 nm ve zooxanthellae için iki bant genişlikleri (ps aynı anda yakalanan salınımıeudo-kırmızı renkli, 600-700 nm) ve Kromatofor (pseudo-yeşil renkli, 500-550 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mercan resif araştırma deniz ortamında faaliyet eşzamanlı fiziksel, kimyasal analizi ve biyolojik olayları içeren, son derece disiplinler arası araştırma çabası. Karmaşık mercan kayalığı ekosistemlerin çalışma bu nedenle en iyi bağlamsal çerçeve (Şekil 10) bir 'Ten Selahiyet' içinde tamamlanır. Bu grafik derleme mercan ekosistem mekansal boyutları geniş bir yelpazede (10 -9 10 5 m) kapsadığını göstermektedir. Ayrıca, bu egzersiz geobiological alanını birleştirmek ve laboratuar analizleri için gerekli köprü 1 mm-1 cm bir ara boy-ölçeğinde analiz ettiğini göstermektedir. On çerçevenin Bu Yetkileri modelleme ve fiziksel, kimyasal sentezi, Curaçao mercan ekosistemlerinin kontrol biyolojik parametreler, deneyler için bağlam analizleri.
Bu çalışma tam entegre paketi o uygulamak için ilkf FM, SBFI ve CLSM teknikleri artan su derinliğine görünüşte sağlıklı mercanlar yanıtını izlemek için. Görüntü bütün doku veya kalın biyolojik örnekler mevcut ışık mikroskobu araçlar nedeniyle emilimini, saçılması ve diğer fenomenleri kapsar örneklerin kendileri, yarattığı optik kısıtlamaları çeşitli sınırlı kalmıştır. Sadece son on yıl içinde, SBFI taramalı elektron mikroskobu çeşitli biyolojik örneklerin geniş alan bazlı SBFI görüntüleme kullanarak ultra yüksek çözünürlükte 31 gibi ışık mikroskopik görüntüleme kullanıldı. Bu beyin gelen bütün kalp dokuları ve zemin, cilalı vardı etiketli kemikleri içeren hatta örnekleri için her şeyi analizler dahil, ve her bölüm 23-29 yapıldıktan sonra, aynı zamanda görüntülü etti. Son zamanlarda, floresans ve konfokal mikroskopi biyolojik numuneler içinde 32-33 hatlarını, şekil, ve protein ve pigment dağılımı ortaya çıkarmak için kullanıldı. Ancak, bireysel mercan polipleri ha 3D yapısıd önceden çözülmüş değil. Kalsiyum karbonat infiltrasyona mükellef örnekleri oluşturma ve düzenli bir mikrotomu ile kesit önce kaldırılmalıdır mercan örnekleri ile SBFI için ön koşul, Dekalsifikasyon olduğunu.
Iki-fotonlu floresan mikroskobu biyolojik dokuların analizi için vazgeçilmez hale geliyor Kendine özgü iki foton uyarma olayı sonucu husule gelir. Bu durum doğrusal olmayan iki foton uyarma için Dekalsifikasyon adım etkili bir şekilde bertaraf edildi çalışmada, mercan dokuların uzun derinlemesine nüfuz 33-34 yol 34 fenomeni. Buna ek olarak, iki-fotonlu lazer ile ön-telafi modülü ek olarak bir penetrasyon derinliğini daha iyi çok daha kısa darbe genişliği sağladı. Örnek tarafında, yana kalsiyum karbonat 780 nm'de yakın kızıl ötesi ışık emmediği için, derinlemesine nüfuz amacı çalışma mesafesi tipik olarak sınırlıdır. Yine bir başka dezavantaj Of Dekalsifikasyon ve mercan iskeletinin kaldırılması örneği, birden dehidrasyon ve rehidrasyon adımlarla gitti ve su ücretsiz balmumu gömme sonra bile zor doku hacmi tahminlerini yapan mercan dokusunun yapısal bütünlüğünün kaybı. Bu öncesi ve işlendikten sonra, hem mercan doku hacimleri belirlenmesi önemini vurgulamaktadır.
Mercan floresan proteinleri konfokal karakterizasyonu Great Barrier Reef mercanlar için tamamlanmış ve koruyucu spektral özellikleri mercan yaşam 32 derinliği ile ilişkilendirilmiştir. Ancak, bu çalışmada biz ağız dokularında dışında derin su mercan her yerde kromatoforların önemli bir azalma olduğunu, iki-foton mikroskopi kullanılarak ilk kez göstermektedir. Buna ek olarak, kromatoforlardaki göre zooxanthellae dağılımında belirgin bir değişiklik M. derinlik transekt arasında gözlenmiştir annularis, nereyee sığ su mercan dokuları tam kromatoforların ile kaplıdır. Yüksek büyütme görüntüleme (Şekil 8C ve 8D) tarafından sağlanan çözünürlük ile, artık tam zooxanthellae tarafından alınan alan ve hacim ölçmek olabilir ve bunların doku yoğunluk oranları diğer hücre bileşenlerine göre belirlenebilir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmada SBFI entegrasyonu ve iki-foton floresan spektral görüntüleme mercan dokuların morfolojisi ve yapısı içine hayati önemli yeni anlayışlar vermiştir. Bu veriler, bireysel polip düzeyinde veya tüm bir mercan kafasına sömürge polip arasındaki etkileşimin bağlamsal seviyede, mercan dokusu bileşenleri tek tek ölçmek için yardımcı olacaktır. Şimdi deniz seviyesi su derinliği ve parlaklığındaki değişikliklere mercan holobiont adaptif yanıtını izin verecektir Bu bağlam niceliksel takip ve tahmin edilmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
