Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сочетание Microstereolithography и электропрядения Произвести Мембраны Оснащен ниши для роговицы регенерации

Published: September 12, 2014 doi: 10.3791/51826
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 3, 2, 1, 1
1Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 2Department of Chemistry, University of Sheffield, 3L. V. Prasad Eye Institute

Summary

Мы сообщаем технику для изготовления micropockets пределах electrospun мембран, в которых для изучения поведение клеток. В частности, мы описываем комбинацию microstereolithography и электроформования для производства PLGA (поли (лактид-со-гликолида)) роговицы биоматериала устройств, оснащенных microfeatures.

Abstract

Роговицы проблемы затрагивают миллионы людей во всем мире, снижающих качество их жизни значительно. Заболевания роговицы может быть вызвано заболеваниями, такими как аниридией или Стивена Джонсона, а также внешними факторами, такими как химические ожоги или радиации. Текущие процедуры (я) использование пересадке роговицы и (II) использование стволовых клеток расширенной в лаборатории и доставлен на носителях (например, амниотической мембраны); эти процедуры являются относительно успешно, но, к сожалению, они могут не через 3-5 лет. Существует необходимость в разработке и производстве новых роговицы биоматериала устройств, способных имитировать подробно физиологическую среду, в которой стволовые клетки находятся в роговице. Лимбальных стволовые клетки находятся в лимба (круговой области между роговицы и склеры) в конкретных нишах, известных как Palisades из Vogt. В этой работе мы разработали новую технологическую платформу, которая объединяет две технологии производства передовые (microstereolithography и electrospinnлуг) для изготовления мембран роговицы, которые имитируют в определенной степени лимба. Наши мембраны содержат искусственные micropockets, которые направлены, чтобы обеспечить клетки с защитой как Палисады из Фогт сделать в глаза.

Introduction

Роговица, лишенной сосудов центральный наружный самых ткани глаза, является одним из наиболее важных тканей, участвующих в видении 1. Есть несколько типов клеток, которые поддерживают функцию роговицы. Верхний наружный слой роговицы состоит из эпителиальных клеток, которые могут быть около 5-7 слои толщиной 2. Этот слой предотвращает бактериальной инвазии в роговицу 3 и позволяет вводить кислорода 4. Было сообщено, что стволовые клетки эпителия роговицы лежат в нишах или крипт (с размерами 120-150 мкм) в периферийной области роговицы, известного как лимба 5,6. Как стволовые клетки делятся, дочерние клетки также известные как переходных усилительных ячеек путешествовать из ниш и как подразделение продолжает клетки двигаться центростремительно внутрь и вверх в результате терминально дифференцированных клеток в центральной роговицы области 7,8. Эти клетки обычно вытер с миганием глаз еxposing новые клетки под 9.

В дополнение к тому, расположение эпителиальных стволовых клеток, лимба также играет определенную роль в поддержании васкуляризованная конъюнктиву от области роговицы 10. Повреждение лимба может быть вызвано тепловой / химических ожогов, радиации, а также генетических заболеваний 10. Когда это происходит, лимба барьер разбивается позволяя конъюнктивы клетки, чтобы перейти на роговицу, vascularizing регион, вызывая боль и слепоту в некоторых случаях. Состояние известно как дефицита лимбальных стволовых клеток (LSCD) 10.

Различные природные субстраты были зарегистрированы в качестве возможных носителей стволовых клеток для оказания помощи в роговицы регенерации. Например, на основе коллагена мембраны используется Дравида и др. 11 и Рамы и сотрудниками 12 сообщили об использовании фибрина в исследовании с 112 пациентами. В настоящее время, однако наиболее часто используемых метода леченияявляется использование человеческого амниотической мембраны из банка тканей и культуры лимбальных эпителиальных клеток на поверхности 13,14. После того, как монослой сформировался, амниотической мембраны клеток приклеен стороной вверх на поврежденной роговицы, которая имеет все конъюнктивальный клетки и рубцовой ткани хирургическим путем удалены от нее до этого трансплантации клеток 14. Амниотической мембраны снижается в течение нескольких недель или месяцев, покидающих эпителиальные клетки, прикрепленные на обнаженную область для регенерации эпителия 15,16. Эта техника была успешной в восстановлении зрения, однако, есть еще несколько практических вопросов, которые ограничивают его широкое поглощение клинически. В амниотической мембраны ткани человека он должен пройти скрининг с помощью хорошие ткани банковские процедуры перед использованием для трансплантации клеток на больных. Этот скрининг только снижает риск передачи заболеваний, но не может полностью устранить его 17. В дополнение к этому у нас есть сообщения изменчивости в рнаилучших показателей амниотической мембраны вследствие среди вариации доноров 18,19 и различных методов 19,20 обработки. Наряду с небольшим риском передачи болезней есть потребность в хирургических центрах, чтобы иметь доступ к хорошо управляемых банков тканей, не доступных для всех.

Несмотря на то, амниотической мембраны относительно успешным, существует необходимость в разработке новых синтетических биологически разлагаемых альтернатив несущих клеток для лечения заболеваний роговицы. Синтетические носители бы преодолеть необходимость банковских процедур, а также устраняя небольшой риск передачи заболеваний и изменчивости между донорами. В этом смысле материалы, такие как полиэтиленгликоль и PLGA 21,22 23,24 изучались.

При разработке синтетический альтернативу амниотической мембраны человека есть также возможность проектировать в нее желаемые качества, мы надеемся помочь выживанию культивируемых клеток. Вклучастия и вовлечения из microfeatures пределах биоматериала устройств для конкретного контроля поведения клеток является новым область интересов. Многие авторы сообщили о своей работе в направлении развития искусственных стволовых клеток ниши 25-30. Эта группа недавно сообщила о создании микроизготовленном PEGDA фибронектином biofunctionalized искусственного лимба на поставку лимбальных эпителиальных клеток 22 и методологии для изготовления electrospun биоразлагаемых мембран, содержащих микроизготовленном карманы для поддержки лимбальных эпителиальных клеток 31.

Целью данной работы является разработка инновационных технологий производства, для развития биоматериала устройств, содержащих microfeatures которые имитируют до такой степени, в микросреды, в которой стволовые клетки находятся в организме. Мы разработали методику, которая объединяет microstereolithography и электропрядения, что позволяет изготовление биоразлагаемых микроструктурированном мембран, которые показывают GREAт потенциал для применения регенерации тканей.

Важно заметить, что, хотя в этой работе этот метод был применен к изготовлению колец для регенерации роговицы, технология может быть применена для изготовления устройств для регенерации широком диапазоне эпителиальных тканей, например, кожи, ротовой эпителий слизистой оболочки, кишечника, дыхательных и мочевого пузыря. В частности, в данном исследовании мы разработали синтетический биоразлагаемый мембраны, который функционирует таким же образом, чтобы амниотической мембраны для доставки клеток к роговице. Эта мембрана содержит micropockets в размере около 300 мкм (больше, чем лимбальных криптах Pallisades из Фогт (около 150 мкм)). Наконец, мы создали упаковку протокол, который позволит эти мембраны должны храниться при температуре -20 ° С в течение более 6 месяцев, не проявляя никаких признаков поломки.

Protocol

О себе Этика: Глаза, используемые в этом исследовании были использованы в соответствии с Декларацией о гласности по исследованиям животных:

1 Изготовление ПМГК Биоразлагаемые мембран Оснащен Micropockets

  1. Кольцевые леса были созданы с помощью комбинации microstereolithography и электроформования техники 31. В сущности, процесс можно свести к 2 части (I) создания шаблонов PEGDA по microstereolithography и (II) электропрядения на шаблонах для воспроизводства, лежащей в основе структуры PEGDA (в этом случае в микроизготовленном кольца). Эти два этапа подробно описано ниже (фиг.1 и 2).
    1. Изготовление шаблонов PEGDA по microstereolithography (microSL)
      1. Изготовление кольца с использованием модели 2 слоя, с первого слоя (L1), являющаяся основой структуры, а второй слой (L2) представляя 6 micropockets с подковой Morphologiэс в диапазоне размеров от 300-500 мкм. Изготовление колец PEGDA недавно описывается этой группы 22.
        1. Создать L1, рисуя 1,2 см черный круг, используя любой подходящий редактор.
        2. Создание L2 таким же образом, но включают в себя 8 белый 0,5 х 0,35 мм подковообразные структуры. Распределите маленькие белые в форме подков в черном структуры окружности.
        3. Сохранить L1 и L2 в формате JPEG.
      2. В темном стеклянную пробирку, перемешивают полиэтиленгликоль диакрилат (PEGDA, Mn = 250 г / моль) с 1% вес / вес Камфорхинон, фотоинициатора, на магнитной мешалке в течение 20 мин.
      3. Развернуть лазерный луч microstereolithography настройки, используя расположение телескопический объектив, а затем проецировать его на компьютерной программируемый цифровой многопробочной устройства (УФ-включен DMD Starter Kit). ПРИМЕЧАНИЕ: DMD отражает образ (в данном случае кольцо) на зеркало через 10 см с фокусным расстоянием трубки объективом. Затем изображение режиссера серебряной-шаTed зеркало в пробирку, содержащую фотоотверждаемый полимер (PEGDA).
      4. Отрегулируйте и тщательно очистите оптику microstereolithography создана.
      5. Поместите 300 мкл смеси PEGDA в лунку планшета для культуры ткани 12-луночного. Убедитесь лунки предварительно покрыты тефлоном или другим антипригарным материалом для легкого удаления структуры после отверждения.
      6. Включите голубого лазера (MBL-III 473 нм; 150 мВт) и загрузить L1 в ALP3 основного программного обеспечения, ранее установленный на ПК. Облучать первый слой в течение 60 сек. ПРИМЕЧАНИЕ: ALP3-основной является интерфейс USB, что обеспечивает связь между ПК и микрозеркальным устройства Digital.
      7. Добавить в скважине 250 мкл более из PEGDA, загружать L2, как описано выше, и облучение L2 в течение 60 сек.
      8. Снимите неотвержденный полимера и мыть кольцо с изопропанол O / N.
    2. Изготовление биоразлагаемых ПМГК мембран с использованием электропрядения
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кольца PEGDA были использованы в качестве шаблонас, над которыми ПМГК был electrospun с ПМГК воспроизведения основной рельеф, поскольку это вращается над этими шаблонами. После прядения, лист ПМГК полимера очищенные от коллектора. Окончательный ПМГК мембрана не содержат кольца PEGDA которые остались прикреплены к металлическим коллектором.
      1. Распределите кольца PEGDA на гальваническим алюминиевым листом (12 см х 20 см) для создания статического электропрядения коллектор.
      2. Прикрепите кольца, используя проводящий углерода ленту. Примечание: Эти кольца, образованные, как только может быть повторно использованы в качестве матриц для электропрядения.
      3. Подготовьте раствор полимера для прядения. Растворить PLGA (50/50 DL-лактид (52 моль%): гликолида (48 моль%), 44 кг / моль) в дихлорметане (ДХМ) при 20% вес / вес концентрации.
      4. Перемешать O / N перед использованием.
      5. Место 4 инсулиновые шприцы (с тупыми концами, иглы 0,8 см Внутренний диаметр) на шприцевой насос. ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре шприцы обеспечивается более быстрое электропрядения, чем работать с одной шприц.
      6. Загрузка 2,5 мл PLGA раствора в каждом шприце.
      7. Electrospin используя скорость 30 мкл / мин и напряжения в диапазоне от 12 до 15 кВ. Оставьте расстояние между иглами и коллектором 15 см.
      8. Electrospin в течение 1 часа и 30 минут, и, наконец, тщательно очистить electrospun лист PLGA от коллектора, поддерживающего кольца PEGDA.
      9. Нарежьте electrospun строительные леса в 22 округах мм в диаметре, используя круглую дырокол, и оставляя все кольцевую структуру, расположенную в центре.

2 Долгосрочная Хранение ПМГК микроизготовленном мембран

Примечание: Кольца ПМГК были сфабрикованы и стерилизуют аккредитованных внешних компаний; Образцы облучали при внешнем диапазоне доз 25-40 кГр.

  1. Установите мембрану в небольшой контейнер (пластиковые чашки Петри) и поместите его в сумке медицинской класса.
  2. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы создать маленькие сумки фильтров для осушителей. То создании сумки, сложить фильтровальную бумагу (125 мм в диаметре) и сократить в результате полукруг пополам; затем запечатать концы вместе с помощью липкой ленты.
    1. Заполните три фильтра бумажные мешки с 1 г силикагеля, оранжевый, кобальт (II) хлорида и меди (II) сульфата, соответственно.
    2. Положите три мешка осушителя внутри мешка медицинского класса вместе с electrospun мембраны.
  3. Добавить в сумке имеющийся в продаже шесть спот индикатора влажности карту для обнаружения любого скопления влаги в период хранения.
  4. Используйте вакуумный термосваривание машину пылесосить и плотно закройте пакет.
  5. Отправить кольцевые мембраны к внешнему компании для γ-облучения.
  6. Магазин γ-облучении PLGA мембран в широком диапазоне температур от -20 ° С до 37 ° С во влажной среде в инкубаторе, содержащем 5% CO 2.
  7. Сообщение хранения, изучения индикатор влажности, чтобы подтвердить, что уровень влажности находится ниже 30%.
  8. USE сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с целью оценки целостности волокна.

3 Выделение лимбальных эксплантов

Кролик на лимбе эксплантаты были выделены из глаз кролика (полученные от фермы, где выращивают кроликов для потребления).

  1. Лечить кролика глаза, используя антисептический раствор (3%).
  2. Очистите глаза, удаляя излишки ткани, окружающие роговицу.
  3. Отделить лимбальную область (определенную в виде тонкой круглой области между роговицей (прозрачный) и склеры (белый)) от остальной части роговицы с помощью микроскопа рассечение.
  4. Нарезать сегментов (длинных около 1,5 см) под микроскопом рассечение.
  5. Обеззараживание лимбальных сегменты в 1,5% раствором антисептика в течение 1 мин.
  6. Нарежьте лимбальных сегменты на мелкие кусочки (100-500 мкм) с лезвие скальпеля.
  7. Хранить небольшие кусочки ткани в культуральной среде Игла (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% фетальной бычьей сыворотки, 1 Е / мл ручкаicillin, 100 мг / мл стрептомицина, 2,5 мкг / мл амфотерицина, 10 нг / мл ЭФР, и 5 мкг / мл инсулина) при 37 ° С и 5% СО 2 до использования (не более 60 мин).

4 вырост клеток от лимбальных эксплантов

Кролик на лимбе эксплантаты помещали на обоих недавно выделенных микроизготовленном мембран и мембран, которые были в вакуумной упаковке и хранении в течение 6 месяцев при температуре -20 ° С.

  1. Шерсть кольцевые леса с 15 мкл фибринового клея (1: 1 смеси фибриногена из плазмы крови человека в концентрации 18,75 мг / мл и тромбина из плазмы крови человека в концентрации 2,5 ед / мл) с помощью мобильного скребок для распределения фибрин равномерно.
  2. Поместите ткани эксплантов непосредственно на micropockets ПМГК использованием 25 г иглу и рассекает микроскопом.
  3. Добавить для культивирования клеток очень осторожно, чтобы избежать отсоединения эксплантов.
    1. Изменение СМИ каждые 3 дня (СМИ рецепт, описанный в разделе 3.7) и КEEP в культуре в течение 2 недель в в увлажненном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2.
  4. Закрепить образцы с 3,7% забуференном формальдегиде в течение 10 мин с последующим промыванием 3 PBS.
  5. Контрастное путем инкубации в 1 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или пропидий йодида (PI) в течение 10 мин при комнатной температуре.
  6. Промыть 3 раза в PBS и хранить образцы, покрытые фольгой.
  7. Изображение образцы с помощью флуоресцентного микроскопа на длинах волн 543 нм и 800 нм (двухфотонного).

5. наладка Кролик Раненый Роговица 3D-модели

  1. Очистите и продезинфицируйте кролика глаза, как описано выше.
  2. Раны в глаз кролика при погружении их в 0,14% гидроксида аммония в течение 5 мин.
  3. Промойте глаза в PBS и соскрести эпителий с склеротома ножом.
  4. Вырезать и изолировать кнопку роговицы-склеры удаления оставшегося ткани.
  5. Поместите роговицы эпителиальных стороной вниз настерильный стакан и залейте 0,5% агара, сделанные в DMEM.
  6. После установки, поставить роговицы эпителиальных стороной вверх, в небольших чашках Петри и добавить питательных сред (рецепт описано выше) до лимбальных области. ПРИМЕЧАНИЕ: Не покрывать всю роговицу; держать органной культуре на поверхности раздела воздух-жидкость.

6 Выделение лимбальных эксплантов и Включение Ring Строительные леса в роговице кроликов 3D Модели

  1. Покрывают кольцо мембраны с 15 мкл фибринового клея (1: 1 смеси фибриногена в концентрации 18,75 мг / мл и тромбина в концентрации 2,5 ед / мл) .Используйте клеточным скребком, как описано выше.
  2. Поместите ткани эксплантов непосредственно на micropockets ПМГК использованием 25 г иглу и рассекает микроскопом.
  3. Поместите кольца с ткани эксплантов на оголенных роговицы с эксплантов вверх и на условиях раздела воздух-жидкость. (Эти условия были описаны ранее 22).
  4. Поддержание модели органной культуре для4 недели в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 меняется СМИ каждые 2 дня.

7 Оценка роговицы регенерации и стволовых клеток обслуживание

  1. Через 4 недели исправить роговицы, используя 3,7% формальдегида.
  2. Процесс роговицу для обычных гистология производить 6 мкм разделы парафиновые.
  3. Пятно гематоксилином и эозином (H & E).
  4. Для иммуногистохимии, депарафинизации секции в ксилоле (3 мин) и увлажняет в 100% этаноле (1 мин), 70% этанола (1 мин), и дистиллированной воды (2 мин).
  5. Очертить разделы, используя ручку Dako для разделения небольших участков и избежать чрезмерного использования антител.
    1. Обработать очерченные участки с 0,05% трипсина (100 мкл) в течение 20 мин (37 ° C).
  6. Тщательно промойте PBS и добавьте 100 мкл сыворотки 10% козьего (блокирующего) в течение 1 часа.
  7. Инкубируйте образцы с 100 мкл мышиного моноклонального антитела cytokeraолово 3 (CK3) и 100 мкл p63 в 1% козьего сыворотки O / N при 4 ° С.
  8. Промыть PBS и обрабатывали 100 мкл биотинилированного вторичного антитела анти-мыши (1: 1000 в 1% козьей сывороткой) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  9. Добавить 100 мкл FITC-стрептавидина (1: 100 в 1% козьей сывороткой) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  10. Treat образцы с DAPI, как описано выше.
  11. Изображение образцы с помощью флуоресцентного микроскопа на длинах волн 800 нм (двухфотонного) и 488 нм.

Representative Results

Electrospun микроизготовленном кольца были изготовлены с использованием комбинации microstereolithography и электропрядения (рисунки 1 и 2). PEGDA кольца разных размеров были изготовлены с использованием microstereolithography (рисунок 3); Эта техника позволяет изготовления структур в порядке см и одновременного включения microfeatures. В этом случае, кольца диаметром от 1,2-1,6 см, содержащих micropockets 350-500 мкм были изготовлены (рисунок 4).

С точки зрения производства, стерилизации и упаковки материалов для будущего клинического использования было установлено, что вакуумная упаковка в мешки медицинских классов значительно улучшили способность достигать долгосрочного хранения ПМГК мембран (рисунок 5); использование сумке медицинского назначения (ПЭТ / фольга / LDPE) с толщиной 0,12 мм позволил нам достичь более длительный срок хранения. Это была исследована путем отправки MembrAnes в наших сотрудников в Индии и мембран хранили в течение нескольких месяцев при температуре -20 ° С, при комнатной температуре и при 37 ° С в намеренно влажных условиях (влажный инкубатор). Рисунок 5 показывает, что с помощью намеренно провокационные условия хранения при 37 ° C во влажных условиях, мембраны были единственным стабильным в течение приблизительно 1 месяц под не-вакуумной упаковке условия, но достиг 3 месяца хранения при вакуумной упаковке условиях (рисунок 5 и таблица 1).

Таблица 1 демонстрирует улучшение условий хранения, которые могут быть достигнуты даже в условиях, выбранных для будет способствовать поглощению воды и набуханию волокон, если обратить внимание на выбор используемого мешка.

Кольца поддерживается клеток отросток из лимбальных эксплантов в различных условиях (I) колец недавно сделанные и (II) кольца, хранившиеся в течение 6 месяцев (Рисунок 6). Клеточного переноса было достигнуто после 4 недель, когда PLочка одним ударом мембраны PLGA на 3D раненых моделей. Клетки росли из тканевых эксплантов размещенных на мембранах, создающих новый эпителий на ранее оголенных роговицы (рисунок 7). Положительные (роговицы без всякого лечения) и отрицательных контролей (раненые роговицы) были также поддерживали в культуре за те же периоды времени. Отрицательных контролей подтвердили отсутствие формирования нового эпителия в отсутствии добавленных клеток. Иммуноцитохимическая показали, что клетки, растущие из эксплантов были эпителиальные клетки роговицы, так как они были положительными на роговичной маркера дифференцировки CK3 (рисунок 7E).

Рисунок 1
Рис.1 Схема microstereolithography настроить для создания колец PEGDA.

her.within-страница = "всегда"> Рисунок 2
Рисунок 2 Схема электропрядения процесс, используя PEGDA микроизготовленном кольца как шаблонов.

Рисунок 3
Рисунок 3 (А) показан пример статического коллектора (гальваническим алюминиевого листа с PEGDA колец) для прядения микроизготовленном мембран ПМГК. (B) и (E) показывают различные electrospun коврики время очищенные от статических коллекторов. (C) показывает Шаблоны PEGDA различных размеров, освещающих универсальность с помощью microstereolithography для изготовления подстилающей поверхности. (D) показан PLGA микроизготовленном реплику./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 СЭМ-изображение кольца PEGDA с подковообразной microfeature (А); большим увеличением СЭМ изображение микроизготовленном кармана (B). Фаза контраст образ кольца ПМГК с подковообразной microfeature (C); высокого увеличения фазового контраста образ микроизготовленном кармане (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5Рисунок 5 Влияние температуры и времени по хранению вакууме и не-вакуумной упаковке PLGA (50/50) мембраны (44 кг / моль) с микро-сфабрикованы колец над 6 месяцев. Мембрана целостности оценивали как полностью нетронутыми волокон (+++), некоторые волокна отек (++), волоконно-слияния (+) или нет интактные волокна (-). СЭМ изображения и три осушители (кремнезем оранжевые, кобальта (II) хлорид, и медь (II) сульфат) не показывают изменения в целостности волокна или влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рис.6 Флуоресцентные изображения, показывающие вырост LEC от лимбальных эксплантов на свежеприготовленных биоразлагаемых колец ПМГК (A, B) и на кольцах после 6 месяцев хранения при -20° С (С, D). Изображения (А) и (В) соответствуют клеток, окрашенных DAPI (синий) и пропидийиодидом (красный), соответственно. Изображение б является ортогональным вид из конфокальной Z-стек эксплантате размещенной на микроизготовленном кармане. Изображения (C) и (D) показывают положительное окрашивание для p63 (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рисунок 7 (А) показывает кролика ранены роговицы модель с кольцом лесов и ткани эксплантов, расположенных на эшафоте, который был ранее покрытой фибринового клея (B) и (C) положительные и отрицательные контроли.; положительный контроль является свежий раввин . т роговицы и отрицательный контроль роговицы эпителий, где намеренно удалены (отрицательный контроль был также культивировали в течение 4 недель) (D), представляет собой Н & Е изображение ткани инженерии роговицы после 4 недель в культуре; рисунке показана новая многоуровневую эпителий, образованный клеток, выходящих из эксплантов, размещенных на нишах (E) является иммуноцитохимия изображение, показывающее клеток вырост из лимбальных эксплантата.; ядра окрашивали DAPI (синий) и клетки показывает положительное окрашивание для цитокератина 3, роговицы дифференциация маркер (зеленый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

х; "> целостности волокна для мембран, хранящихся в 37 ° C влажная 64px; "> -
PLGA (50/50)
День 0 Месяц 1 Месяц 2 Месяц 3 Месяц 4 Месяц 5 Месяц 6
Номера для вакуумной упаковке +++ - - - - - -
Пылесосом (сумка) (PE, PA Composite) Толщина: 0,14 мм +++ + - - - -
Пылесосом (сумка B) (ПЭТ / фольга / LDPE) Толщина: 0,75 мм +++ +++ +++ + - - -

Таблица 1 Влияние вакуумных и отличается хранения сумок на целостности PLGA (50/50) мембраны (44 кг / моль) исследовали более 6 месяцев хранения. Мембрана целостности оценивали как полностью неповрежденные волокна (+++), некотором слое отек (++), волоконно-слияние (+) или нет интактные волокна (-).

Discussion

Это исследование описывает (а) технику для изготовления electrospun мембран, содержащей microfeatures внутри них и (б) Как подготовить такие мембраны для клинического использования вакуумной упаковке, гамма-облучения и затем хранение до использования. В данном конкретном приложении мы разработали PLGA мембран, содержащих micropockets которые имитируют физические особенности лимбальных ниши стволовых клеток. Целями данного исследования являются (я) для описания методов предоставить читателям знания, необходимые для проектирования и изготовления строительных лесов, содержащие microfeatures для исследований в вклада стволовых клеток ниш к регенерации тканей и (II), чтобы предоставить читателю лучше понять о том, как сохранить electrospun каркасов в течение длительных периодов времени.

С точки зрения клинического применения, хранение кольцевых оболочек имеет первостепенное значение. В этой работе, деградация кольца изучали в течение 6 месяцев. ДеградацияМембраны приводится в действие таким образом, гидролиз, просто держать мембраны, свободной от влаги процесс останавливается. Blackwood и соавт. Сообщили, что путем изменения соотношения PLA, чтобы PGA, деградация мембраны изменяется 32. Это исследование также показало, что при увеличении количества ФГА, скорость деградации electrospun мембран увеличилась в естественных условиях 22. При этом было показано, что при вакуумной упаковки мембран вместе с некоторым осушителем и облучение их и хранить их при низких температурах в течение 6 месяцев, нет никаких изменений в целостности и деградации волокон. В настоящее время 6 месяцев является, насколько мы изучали с эти мембраны, содержащие micropockets но хранение данных за 1 год, как сообщается на простых electrospun мембран при -20 ° С 22 и у нас теперь есть неопубликованные данные для их хранения при температуре -20 ° C в течение 2 лет без признаков деградации. Таким образом, для длительного хранения он будет рекомендуется хранить их сухой при -206; C, но можно хранить их при комнатной температуре даже в Индии, по крайней мере 6 месяцев (возможно, гораздо больше). Включение индикатора влажности дает простое средство проверки, что упаковка сохранила мембран сухие и в этом случае они будут пригодны для этой цели.

Передача клеток из этих колец в 3D-моделей роговицы было показано при размещении лимбальных эксплантов в течение micropockets. Эта группа недавно сообщила передачу клеток на в пробирке кролика роговицы модели, акцент эксплантов на равнине ПМГК мембран (оболочек без кольцевых структур) 24. С помощью настоящего микроизготовленном лесов передачу клеток было принято еще один шаг вперед, как мы можем теперь специально найти ткани эксплантов в течение microfeatures. Возможность размещения эксплантов непосредственно в нишах также позволяет хирургу использовать мембраны непосредственно в хирургическом театре избегая необходимость чистого помещения на первом расширять лимбальных стволовые клетки. Хотя этот кусок врк было сосредоточено на разработке устройств для заболеваниями роговицы, это микротехнологий технология может быть также применен для разработки устройств для многих других приложений. Будущая работа будет исследовать изготовление конструкций для регенерации других тканей, таких как кожа и кости.

В то время как дизайн и начальная изготовление микроструктур PEGDA может занять много времени, как только сфабрикованы структуры можно использовать много раз без ухудшения. Таким образом, последующее изготовление PLGA микроструктурированных биоразлагаемых мембран электропрядения может быть выполнена при сопоставимой скоростью, чтобы при производстве плоских ('неструктурированных') мембран после сборки мусора. Хотя в этой работе мы использовали microstereolithography для изготовления пресс-формы, может быть также использованы другие способы изготовления, такие как 3D-печати или литья под давлением. Таким образом, в основе формы могут быть изготовлены из других полимеров или металлов, а из ПЭGDA. Таким эта техника является очень гибким и исследователи могут легко адаптировать метод для удовлетворения их собственных потребностей и средств.

Дом в-microstereolithography настройки используются в данном исследовании не позволит подготовку конструкций с особенностями в рамках 30 мкм; это не является ограничением для роговицы применения описанного здесь, но это может иметь решающее значение в оформлении других моделей. В таком случае других методов, таких как 2 фотона полимеризации (2PP) может представлять интерес, однако техника электропрядения не может позволить воспроизводство структур на шкале субмикронного (это в настоящее время изучается нашей группой).

Критические шаги в процессе изготовления являются (я) Избегая overcuring шаблонов PEGDA, которые можно контролировать, регулируя время и количество фотоинициатора. (II) Управление электропрядения условия, такие как температура и влажность. (III) Хранение соответствующим образом в electrospuн кольцевые мембраны, использующие вакуум-упаковку и осушители.

Таким образом, путем размещения лимбальных эксплантов ткани в microfeatures мембраны мы показали клеток отросток из эксплантатов на ниши, клеточного переноса на кролика раненых роговицы и последующей повторной эпителизации роговицы. Деградация мембран хранили при различных температурах также были изучены и упаковка протокол, который обеспечивает долговременное хранение мембран была разработана, причем последний важное значение в развитии мембраны для клинического применения.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly (lactic-co-glycolic acid) Purac PDLG5004
Dichloromethane Sigma Aldrich Or Fisher 270997 Or D/1850/17 >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit Texas Instruments 1076N732 (UV)
473 nm Laser Laser 2000 MBL-III 150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylate Sigma Aldrich 475629 Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + Glutamax Fisher 12077549
Ham’s F12 Labtech biosera LMH1236/500
Fetal Bovine Serum Labtech biosera FB-1090/50
EGF R&D 236-EG-200
Insulin Sigma Aldrich 91077C-1G
Amphotericin Sigma Aldrich A2942-100ml
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ml
DAPI Sigma Aldrich 32670
Propidium iodide Sigma Aldrich P4864
Thrombin Sigma Aldrich T9326
Fibrinogen Sigma Aldrich F3879
p63 Sigma Aldrich P3737
CK3 Merck Millipore CLB218
Hematoxylin SLS HHS16-500ML
Eosin Sigma Aldrich HT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch Riverside Medical Ltd. Derby, UK Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
Gamma- irradiation (Sterilization) Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy
Silica gel orange Sigma Aldrich 10087
Cobalt (II) chloride Sigma Aldrich 232696
Copper (II) sulfate Sigma-Aldrich C-1297
Six spot humidity indicator card SCC, USA 6HIC200
Vacuum heat seal machine Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK VS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK BR2805
Scanning Electron Microscope (SEM) Philips/FEI XL-20 SEM
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Videne Antiseptic Solution Ecolab, Swindon, UK 3%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
  2. Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
  3. Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
  4. Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
  5. Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
  6. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
  7. Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
  8. Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
  9. Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
  10. Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
  11. Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
  12. Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
  13. Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
  14. Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
  15. Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
  16. Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
  17. Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
  18. Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
  19. Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
  20. Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
  21. Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
  22. Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
  23. Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
  24. Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
  25. Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
  26. Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
  27. Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
  28. Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
  29. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
  30. Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
  31. Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
  32. Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).

Tags

Биоинженерия выпуск 91 электропрядения microstereolithography ниши стволовых клеток хранения на лимбе экспланты
Сочетание Microstereolithography и электропрядения Произвести Мембраны Оснащен ниши для роговицы регенерации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortega, Í., Sefat, F., Deshpande,… More

Ortega, Í., Sefat, F., Deshpande, P., Paterson, T., Ramachandran, C., Ryan, A. J., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration. J. Vis. Exp. (91), e51826, doi:10.3791/51826 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter