Summary
Vi rapporterar en teknik för tillverkning av micropockets inom elektrospunna membran på sig att studera cellens beteende. Specifikt beskriver vi en kombination av microstereolithography och electro för framställning av PLGA (poly (laktid-sam-glykolid)) korneala biomaterial enheter utrustade med microfeatures.
Abstract
Hornhinnan problem påverkar miljontals människor världen minskar deras livskvalitet avsevärt. Hornhinnan sjukdom kan orsakas av sjukdomar som aniridi eller Steven Johnsons syndrom och av externa faktorer såsom kemiska brännskador eller strålning. Nuvarande behandlingar är (i) användning av hornhinnan transplantat och (ii) användning av stamceller expand i laboratoriet och levereras på bärare (t.ex. fosterhinnan); Dessa behandlingar är relativt framgångsrika, men tyvärr kan de inte efter 3-5 år. Det finns ett behov av att konstruera och tillverka nya hornhinnan biomaterial enheter som kan efterlikna i detalj den fysiologiska miljö där stamceller är bosatta i hornhinnan. Limbus stamceller finns i limbus (cirkulär yta mellan hornhinnan och senhinnan) i specifika nischer som kallas Palisades av Vogt. I detta arbete har vi utvecklat en ny plattform teknik som kombinerar två banbrytande tillverkningsteknik (microstereolithography och electrospinning) för tillverkningen av korneala membran som efterliknar i viss utsträckning limbus. Våra membran innehåller artificiella micropockets som syftar till att förse cellerna med skydd som Palisades i Vogt gör i ögat.
Introduction
Hornhinnan, den avaskulära centrala yttre mest vävnad i ögat, är en av de viktigaste vävnaderna är involverade i syn 1. Det finns flera typer av celler som upprätthåller funktionen av hornhinnan. Den översta yttersta skiktet av hornhinnan består av epitelceller som kan vara ca 5-7 skikt i tjocklek 2. Detta skikt förhindrar bakterieinvasion i hornhinnan 3 och tillåter inträde av syre 4. Det har rapporterats att stamcellema hornhinneepitelet lie i nischer eller kryptor (med storlekar av 120 till 150 | im) vid det perifera området av hornhinnan kallas limbus 5,6. Eftersom stamcellerna delar, dottercellerna även känd som övergående förstärkningsceller resa ut av de nischer och som division fortsätter cellerna rör sig centripetalt inåt och uppåt vilket resulterar i terminalt differentierade celler i det centrala hornhinnan området 7,8. Dessa celler rutinmässigt torkas bort med blink i ögat exposing nyare celler under 9.
Förutom att vara platsen för de epitelstamceller, limbus spelar också en roll i att hålla vaskulariserad bindhinnan bort från hornhinnan regionen 10. Skador på limbus kan orsakas av termisk / kemiska brännskador, strålning och även genetiska sjukdomar 10. När detta händer är limbus barriären bryts ned vilket gör att konjunktivala celler att gå vidare till hornhinnan, vascularizing regionen, orsakar smärta och blindhet i vissa fall. Tillståndet kallas limbus stamceller brist (LSCD) 10.
Olika naturliga substrat har rapporterats som möjliga stamcellsbärare för medhjälp i hornhinnan förnyelse. Till exempel var kollagenbaserade membran används av et al. Dravida 11 och Rama och medarbetare 12 rapporterade användningen av fibrin i en studie med 112 patienter. För närvarande emellertid den mest använda metoden för behandlingär att använda mänskliga fosterhinnan från en vävnadsbank och kultur limbus epitelceller på ytan 13,14. När ett monolager har bildats, är den fosterhinnan limmade cellsidan upp på den skadade hornhinnan, som har alla konjunktivala celler och ärrvävnad opererats bort från det före detta celltransplantation 14. Den fosterhinnan degraderar inom veckor till månader lämnar epitelcellerna bifogas den blottlagda området för att regenerera epitel 15,16. Denna teknik har varit framgångsrik i att återställa synen men det finns fortfarande några praktiska frågor som begränsar dess utbredda upptag kliniskt. Eftersom fosterhinnan är mänsklig vävnad den behöver genomgå säkerhetskontroll med bra vävnadsbankförfaranden innan de används för celltransplantation på patienter. Denna screening sänker bara risken för överföring av sjukdomar, men kan inte helt eliminera den 17. Utöver detta har det förekommit rapporter om variabilitet i pULLGÖRANDE av fosterhinnan på grund av bland donator variation 18,19 och olika bearbetningsmetoder 19,20. Vid sidan av den lilla risken för överföring av sjukdomar finns kravet på kirurgiska centra för att få tillgång till välskötta vävnadsbanker, som inte är tillgängliga för alla.
Trots att fosterhinnan är relativt framgångsrika, finns det ett behov för utvecklingen av nya syntetiska bionedbrytbara cell carrier alternativ för behandling av korneal sjukdom. Syntetiska bärare skulle övervinna behovet av bankförfaranden samt eliminera den lilla risk för sjukdomsspridning och interdonator variabilitet. I denna mening har material såsom polyetylenglykol 21,22 och PLGA 23,24 studerats.
Vid utvecklingen av ett syntetiskt alternativ till den humana fosterhinnan finns det också möjlighet att designa in i den önskvärda särdrag för att förhoppningsvis hjälpa överlevnaden av de odlade cellerna. Den inclusion av microfeatures inom biomaterial anordningar för särskilda kontrollen av cellbeteende är ett framväxande område av intresse. Många författare har rapporterat arbete för att utveckla artificiella stamceller nischer 25-30. Denna grupp har nyligen rapporterat att skapa en mikro PEGDA fibronektin-biofunctionalized artificiella limbus för leverans av limbus epitelceller 22 och en metod för tillverkning av elektrospunna nedbrytbara membraner som innehåller mikrofabricerade fickor för att stödja limbus epitelceller 31.
Syftet med detta arbete är att utveckla en ny tillverkningsteknik för utveckling av biomaterial som innehåller microfeatures som efterliknar en omfattning de mikromiljöer där stamceller är bosatta i kroppen. Vi har utvecklat en teknik som kombinerar microstereolithography och electro som möjliggör tillverkning av biologiskt nedbrytbara mikrostrukturerade membran som visar great potential för vävnadsregenereapplikationer.
Det är viktigt att notera att även i detta arbete denna teknik har tillämpats på tillverkning av ringar för hornhinnan förnyelse, kan tekniken tillämpas på tillverkning av anordningar för regenerering av ett brett spektrum av epitelvävnader, t.ex. huden, oralt slemhinnor, tarm, andnings och blås epitel. Specifikt i denna studie har vi utvecklat en syntetisk bionedbrytbar membran, som fungerar på ett liknande sätt till det amnionmembran att leverera celler till hornhinnan. Detta membran innehåller micropockets på cirka 300 m (större än limbus kryptor i Pallisades av Vogt (ca 150 nm)). Slutligen har vi etablerat en förpacknings protokoll som gör dessa membran som ska förvaras vid -20 ° C i mer än 6 månader utan att visa några tecken på nedbrytning.
Protocol
Etik Uttalande: Ögonen användes i denna studie användes enligt förklaringen om offentlighet på Animal Research:
1 Tillverkning av PLGA nedbrytbara membraner Utrustad med Micropockets
- Ring ställningar skapades genom en kombination av microstereolithography och electroteknik 31. I huvudsak kan processen sammanfattas i två delar (i) skapandet av PEGDA mallar genom microstereolithography och (ii) elektrospinning på mallarna för reproduktion av den underliggande PEGDA strukturen (i detta fall en mikroring). Dessa två steg beskrivs i detalj nedan (figurerna 1 och 2).
- Tillverkning av PEGDA mallar med microstereolithography (microSL)
- Tillverka ringarna med hjälp av en 2 lager modell, med det första lagret (L1) är basen i strukturen och det andra lagret (L2) presenterar 6 micropockets med hästsko morphologies i olika storlekar från 300 till 500 nm. Tillverkningen av PEGDA ringar har nyligen beskrivits av denna grupp 22.
- Skapa L1 genom att rita en 1,2 cm svart cirkel med hjälp av något lämpligt ritprogram.
- Skapa L2 på samma sätt men innefattar åtta vita 0,5 x 0,35 mm hästskoformade strukturer. Fördela små vita hästskoformade inom den svarta cirkeln strukturen.
- Spara L1 och L2 i JPEG-format.
- I en mörk glasflaska, blanda polyetylenglykol-diakrylat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) med 1% vikt / vikt kamferkinon, en fotoinitiator, på en magnetisk omrörare under 20 minuter.
- Expandera laserstrålen i microstereolithography installation med hjälp av en teleskopisk linsarrangemang och sedan projicera den på en dator programmerbar digital multimirror enhet (UV-aktiverade DMD startpaket). OBS: DMD speglar bilden (i detta fall en ring) på en spegel via en 10 cm brännvidd röret lins. Bilden riktas därefter genom silver-coated spegel i en flaska innehållande den fotopolymer (PEGDA).
- Justera och rengör försiktigt optik microstereolithography inrättas.
- Sätt 300 pl av PEGDA blandningen i en brunn i en 12-brunnars vävnadsodlingsplatta. Se till brunnar förbelagda med teflon eller annat icke-vidhäftande material för enkel borttagning av strukturen efter härdning.
- Slå på den blå laser (MBL-III 473 nm, 150 mW) och ladda upp L1 i ALP3-grundläggande programvara som tidigare installerat på datorn. Bestråla det första skiktet för 60 sek. OBS: ALP3-basic är ett USB-gränssnitt som ger sambandet mellan PC och Digital Microanordningen.
- Lägg till brunnen 250 pl mer av PEGDA, upload L2 såsom beskrivits ovan och bestråla L2 för 60 sek.
- Ta den ohärdade polymeren och tvätta ringen med isopropanol O / N.
- Tillverka ringarna med hjälp av en 2 lager modell, med det första lagret (L1) är basen i strukturen och det andra lagret (L2) presenterar 6 micropockets med hästsko morphologies i olika storlekar från 300 till 500 nm. Tillverkningen av PEGDA ringar har nyligen beskrivits av denna grupp 22.
- Tillverkning av Biologiskt nedbrytbart PLGA membran med hjälp av electro
OBS: De PEGDA ringar användes som malls över vilka PLGA var electrospun med PLGA reproducera den underliggande topografi som den rullas över dessa mallar. Efter spinning, ades arket av PLGA-polymer skalad från kollektorn. Den slutliga PLGA membranet innehöll inte de PEGDA ringar som fanns kvar fäst på metallsamlare.- Fördela PEGDA ringarna på ett elektropläterat aluminiumplåt (12 cm x 20 cm) för att skapa en statisk electrosamlare.
- Fäst ringarna med hjälp av ledande kol tejp. OBS: Dessa ringar gång bildats kan återanvändas som mallar för electro.
- Bered polymerlösningen för spinning. Lös PLGA (50/50 DL-laktid (52 mol%): glykolid (48 mol%), 44 kg / mol) i diklormetan (DCM) vid 20% vikt / vikt koncentration.
- Rör O / N före användning.
- Place 4 insulinsprutor (trubbiga ändar, nålar 0,8 cm innerdiameter) på en sprutpump. OBS: Fyra sprutor säker snabbare electro än att arbeta med en enda spruta.
- Ladda 2.5 ml PLGA lösning i varje spruta.
- Electrospin med användning av en 30 | il / min flödeshastighet och spänning som sträcker sig från 12 till 15 kV. Lämna ett avstånd mellan nålarna och samlare av 15 cm.
- Electrospin för 1 h och 30 min och slutligen försiktigt skala av PLGA electrospun arket från kollektorn stödja PEGDA ringarna.
- Skär elektrospunna ställningar i 22 cirklar mm diameter med hjälp av ett cirkulärt hål punch och lämnar ringstruktur placerad i mitten.
- Tillverkning av PEGDA mallar med microstereolithography (microSL)
2 Långsiktig lagring av PLGA mikrofabricerad Membran
Obs: PLGA ringarna tillverkades och steriliserades av ackrediterade externa företag; Proverna bestrålades vid en extern dosintervallet 25-40 kGy.
- Montera membranet i en liten behållare (plast petriskål) och placera den inuti en medicinsk kvalitet påse.
- Använd filterpapper för att skapa små filterpåsar för torkmedel. To skapa väskor, viker filterpapper (125 mm diameter) och skär den resulte halvcirkel på mitten; sedan försegla ändarna tillsammans med tejp.
- Fyll tre filterpapperspåsar med en g kiseldioxid apelsin, kobolt (II) klorid och koppar (II) sulfat, respektive.
- Sätt de tre påsar med torkmedel inuti medicinsk kvalitet påsen tillsammans med electrospun membranet.
- Lägg till påsen en kommersiellt tillgänglig sex spot fuktindikator kort för att upptäcka eventuell fukt ackumulering under lagringsperioden.
- Använd en vakuumvärmeförseglingsmaskin för att dammsuga och förslut påsen.
- Skicka ringmembran till ett externt företag för γ-strålning.
- Store γ-bestrålade PLGA membranen vid ett brett temperaturintervall från -20 ° C till 37 ° C i en fuktig miljö i en inkubator innehållande 5% CO2.
- Post lagring, granska luftfuktighetsindikatorn för att bekräfta att nivån på luftfuktigheten är under 30%.
- USE Svepelektronmikroskopi (SEM) för att utvärdera fiberintegritet.
3. Isolering av limbus Explantat
Kanin limbus explantat isolerades från kaninögon (erhållna från en gård där kaniner föds upp för konsumtion).
- Desinficera kaninögonen med användning antiseptisk lösning (3%).
- Rengör ögonen genom att ta bort eventuell överflödig vävnad som omger hornhinnan.
- Separera den limbus regionen (identifierad som en tunn cirkulär area mellan hornhinnan (genomskinlig) och senhinnan (vitt)) från resten av hornhinnan med användning av ett dissekeringsmikroskop.
- Skär i segment (cirka 1,5 cm långa) under dissektion mikroskop.
- Desinficera limbus segmenten i 1,5% antiseptisk lösning för 1 min.
- Skär limbus segmenten i små bitar (100-500 nm) med ett skalpellblad.
- Lagra de små bitar av vävnad i odlingsmedia (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% fetalt bovint serum, 1 U / ml Penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 pg / ml amfotericin, 10 ng / ml av EGF och 5 | ig / ml av insulin) vid 37 ° C och 5% CO 2 tills användning (inte mer än 60 min).
4. utväxt av celler från limbus Explantat
Kanin limbus explantat placerades på båda nyligen spunna mikrofabricerade membran och membran som var vakuumförpackad och lagras i 6 månader vid -20 ° C.
- Coat ring ställningar med 15 pl av fibrinlim (1: 1 blandning av fibrinogen från human plasma vid en koncentration av 18,75 mg / ml och trombin från humant plasma vid en koncentration av 2,5 U / ml) med användning av en cellskrapa för fördelning av den fibrin jämnt.
- Placera vävnadsexplantat direkt på PLGA micropockets användning av en 25 G nål och ett dissektionsmikroskop.
- Lägg cellodlingsmedia mycket försiktigt för att undvika att lossa explantaten.
- Ändra media var 3 dagar (media recept som beskrivs i avsnitt 3.7) och kEEP i odling under två veckor i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Fäst prover med 3,7% buffrad formaldehyd i 10 minuter följt av 3 tvättar med PBS.
- Motfärg genom inkubation i 1 | ig / ml av 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) eller propidiumjodid (PI) för 10 min vid RT.
- Tvätta tre gånger i PBS och lagra proverna täckta med folie.
- Bild proverna med användning av en fluorescensmikroskop vid våglängder av 543 nm och 800 nm (två-foton-).
5. etableringsstöd Kanin Wounded Cornea 3D-modeller
- Rengör och desinficera kaninögon enligt ovan.
- Wound de kaninögon genom att nedsänka dem i 0,14% ammoniumhydroxid för 5 min.
- Skölj ögonen i PBS och skrapa bort epitelet med en sclerotome kniv.
- Klipp och isolera hornhinnan-skleral knapp tar bort eventuell kvarvarande vävnad.
- Placera hornhinnorna epitelial sidan ner påen steril kopp och fyll med 0,5% agar gjord i DMEM.
- När inställningen sätter hornhinnorna epitelial uppåt i små petriskålar och tillodlingsmedia (recept som beskrivs ovan) upp till limbus området. OBS: Täck inte hela hornhinnan; hålla organkultur vid luft-vätskegränssnittet.
6 Isolering av limbus Explantat och inkludering av ring Ställningar i Rabbit Cornea 3D-modeller
- Coat ring membran med 15 pl av fibrinlim (1: 1 blandning av fibrinogen vid en koncentration av 18,75 mg / ml och trombin i en koncentration av 2,5 U / ml) .Använd en cellskrapa såsom beskrivits ovan.
- Placera vävnadsexplantat direkt på PLGA micropockets användning av en 25 G nål och ett dissektionsmikroskop.
- Placera ringarna med vävnadsexplantat på de blottlagda hornhinnor med explantaten vända upp och på villkor för gränssnitten luft vätska. (Dessa villkor har tidigare beskrivits 22).
- Underhålla organkulturmodeller för4 veckor i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 föränderliga media var 2 dagar.
7 Bedömning av hornhinnan Regeneration och Stamcells Underhåll
- Efter 4 veckor, fixa hornhinnorna använder 3,7% formaldehyd.
- Behandla hornhinnor för konventionell histologi att producera 6 um paraffin.
- Fläcken med hematoxylin och eosin (H & E).
- För immunocytokemi avvaxa sektionerna i xylen (3min) och rehydrera i 100% etanol (1 min), 70% etanol (1 min), och destillerat vatten (2 min).
- Avgränsa de delar med en Dako penna för att avgränsa små områden och undvika överdriven användning av antikroppar.
- Behandla de avgränsade områden med 0,05% trypsin (100 | il) under 20 min (37 ° C).
- Tvätta noggrant med PBS och tillsätt 100 pl 10% get serum (blockering) under 1 timme.
- Inkubera proven med 100 | il monoklonal musantikropp cytokeratenn 3 (CK3) och 100 ^ p63 i 1% get serum O / N vid 4 ° C.
- Tvätta med PBS och behandla med 100 | il biotinylerad sekundär anti-mus-antikropp (1: 1000 i 1% getserum) under 1 h vid RT.
- Lägg 100 pl av FITC-streptavidin (1: 100 i 1% getserum) under 30 min vid RT.
- Behandla proven med DAPI såsom beskrivits ovan.
- Bild proverna med användning av en fluorescensmikroskop vid våglängder av 800 nm (två-foton-) och 488 nm.
Representative Results
Elektrospunna mikrofabricerad ringar tillverkades med användning av en kombination av microstereolithography och electrospinning (figurerna 1 och 2). PEGDA ringar av olika storlekar tillverkades med användning microstereolithography (figur 3); denna teknik gör det möjligt för fabrikations strukturer i storleksordningen cm och det samtidiga införlivandet av microfeatures. I det här fallet, ringar av diametrar som sträcker sig från 1,2 till 1,6 cm innehållande micropockets av 350-500 um tillverkades (Figur 4).
När det gäller att producera, sterilisering och förpackning av material för framtida klinisk användning fann man att vakuumförpackning i medicinsk kvalitet påsar förbättrats avsevärt möjligheten att uppnå långsiktig förvaring av PLGA membran (Figur 5); användningen av en medicinsk kvalitet påse (PET / Folie / LDPE) med en tjocklek på 0,12 mm tillät oss att uppnå en längre hållbarhet. Detta undersöktes genom att skicka MEMBRanes till våra medarbetare i Indien och membranen lagrades under en period av månader vid -20 ° C, vid RT och vid 37 ° C i medvetet fuktiga förhållanden (en fuktig inkubator). Figur 5 visar att med användning av de avsiktligt provokativa lagringsförhållanden vid 37 ° C under fuktiga förhållanden, var membran enda stabila för ca 1 månad under icke-vakuumförpackade förhållanden, men uppnådde 3 månaders lagring i vakuumförpackade förhållanden (Figur 5 och tabell 1).
Tabell 1 visar den förbättring av lagringsförhållanden som kan uppnås även under förhållanden som valts ut främjar vattenupptagning och fiber svullnad om man uppmärksammar valet av påsen används.
Ringarna stöds cell utväxt från limbus explantat i olika förhållanden (i) ringar nyligen gjort och (ii) ringar lagras i 6 månader (Figur 6). Cell överföring uppnåddes efter 4 veckor när placing PLGA-membran på 3D sårade modeller. Celler växte ut ur vävnadsexplantat ställs på membranen skapar ett nytt epitel på tidigare blottlagda hornhinnor (Figur 7). Positiva (hornhinnor utan någon behandling) och negativa kontroller (sårade hornhinnor) var också hålls i kultur under samma tidsperioder. De negativa kontrollerna bekräftade avsaknaden av bildning av ett nytt epitel i frånvaro av några tillsatta celler. Immuncytokemi visade att cellerna som växer ut från explantaten var korneaepitelialceller eftersom de var positiva för hornhinnans differentieringsmarkör CK3 (Figur 7E).
Figur 1 Schematisk bild av microstereolithography inrättats för att skapa PEGDA ringar.
her.within-page = "always"> 
Figur 2 Schematisk elektrospinning processen med hjälp PEGDA mikrofabricerade ringar som en mall.
Figur 3 (A) visar ett exempel på en statisk uppsamlare (elektropläterad aluminiumark med PEGDA ringar) för spinning av mikrofabricerade PLGA membran. (B) och (E) visar olika elektrospunna mattor skalas från statiska samlare. (C) visar PEGDA mallar av olika storlekar som belyser mångsidighet använder microstereolithography för tillverkning av den underliggande ytan. (D) visar en PLGA mikrofabricerade replika./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. SEM-bild av en PEGDA ring med en hästsko mikrokännetecken (A); hög förstoring SEM-bild av en mikrotillverkad ficka (B). Faskontrast bild av en PLGA ring med en hästsko mikrokännetecken (C); hög förstoring faskontrastbild av en mikro ficka (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 Effekt av temperatur och tid på lagring av vakuum och icke-vakuumförpackad PLGA (50/50) membran (44 kg / mol) med mikro-fabricerade ringar över 6 månader. Membran integritet bedömdes som fullt intakta fibrer (+++), vissa fibrer svullnad (++), fiber sammanslagning (+) eller inga intakta fibrer (-). SEM-bilder och tre torkmedel (kiseldioxid apelsin, kobolt (II) klorid och koppar (II) sulfat) visar inga förändringar i fiber integritet eller fukt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 Fluorescens bilder som visar utväxt av LEC från limbus explants på nybakade biologiskt nedbrytbara PLGA ringar (A, B) och på ringar efter 6 månaders lagring vid -20° C (C, D). Bilder (A) och (B) motsvarar celler färgade med DAPI (blå) och propidiumjodid (röd) respektive. Bild b är en ortogonal vy från en konfokala z-stack för ett explantat placerades på en mikro ficka. Bilder (C) och (D) visar positiv färgning för p63 (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 (A) visar en kanin sårade kornea modell med en ring scaffold och vävnadsexplantat belägna på ställningen som tidigare belagda med fibrinlim (B) och (C) är positiva och negativa kontroller. den positiva kontrollen är en färsk rabbin . t hornhinnan och den negativa kontrollen en hornhinna där epitelet medvetet bort (den negativa kontrollen var också odlades i 4 veckor) (D) är en H & E bild av en vävnadsteknisk hornhinna efter 4 veckor i odling; figuren visar den nya flerskiktade epitel bildas av cellerna som kommer ut från explantaten ställs på nischer (E) är en immuncytokemi bild som visar cell utväxt från en limbus Explantation.; kärnor färgas med DAPI (blå) och cellerna visar positiv färgning för cytokeratin 3, en hornhinnan differentieringsmarkör (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PLGA (50/50) | x; "> Fiber integritet för membran som lagrats vid 37 ° C fukt|||||||
| Dag 0 | Månad 1 | Månad 2 | Månad 3 | Månad 4 | Månad 5 | Månad 6 | |
| Icke-vakuumförpackad | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Sugits (Bag A) (PE, PA Composite) Tjocklek: 0,14 mm | +++ | + | - | 64px; "> -- | - | - | |
| Sugits (Bag B) (PET / Folie / LDPE) Tjocklek: 0,75 mm | +++ | +++ | +++ | + | - | - | - |
Tabell 1 Effekt av vakuum och annorlunda förvaringspåsar på integritet PLGA (50/50) membran (44 kg / mol) undersökte över 6 månaders lagring. Membran integritet bedömdes som fullt intakta fibrer (+++), vissa fiber svullnad (++), fiber sammanslagning (+) eller inga intakta fibrer (-).
Discussion
Denna studie beskriver (a) en teknik för tillverkning av elektrospunna membran innehåller microfeatures inom dem och (b) hur man förbereder sådana membran för klinisk användning av vakuumförpackning, gammastrålning och sedan lagring före användning. I denna speciella tillämpning har vi utvecklat PLGA membran innehållande micropockets som efterliknar de fysiska funktionerna i limbus stamcells nischer. Syftet med denna studie är (i) för att beskriva metoder för att ge läsarna den kunskap som behövs för att utforma och tillverka ställningar innehåller microfeatures för forskning om bidrag stamcells nischer för vävnadsregenerering och (ii) för att ge läsaren en bättre förståelse av hur man lagrar elektrospunna ställningar under långa tidsperioder.
I termer av klinisk tillämpning, är lagringen av de ringmembran av största vikt. I detta arbete var nedbrytningen av ringen studerades under en period av 6 månader. Nedbrytning avmembran drivs genom hydrolys så genom att helt enkelt hålla membranen fuktfri processen stoppas. Blackwood et al. Rapporterade att genom att variera förhållandet av PLA till PGA, nedbrytningen av membranet förändrar 32. Denna studie visade också att genom att öka mängden av PGA, nedbrytningshastigheten av elektrospunna membran ökade in vivo 22. Här har det visat sig att med vakuum förpackning membranen tillsammans med några torkmedel och bestråla dem och lagra dem vid låga temperaturer i 6 månader, finns det ingen förändring i fiber integritet och nedbrytning. För närvarande är så långt vi har studerat dessa membran innehåller micropockets men datalagring för 1 år har rapporterat om vanligt elektrospunna membran vid -20 ° C 22 och vi har nu opublicerade data för lagring vid -20 ° C 6 månader i 2 år utan några tecken på nedbrytning. Sålunda för långtidsförvaring det skulle rekommenderas att lagra dem torka vid -206; C, men det är möjligt att förvara dem vid RT även i Indien under minst 6 månader (eventuellt mycket längre). Införandet av en indikator luftfuktighet ger en enkel kontroll av att förpackningen har hållit membran torrt i vilket fall de kommer att passa för ändamålet.
Överföring av celler från dessa ringar till 3D hornhinna modeller visades vid placering limbus explants inom micropockets. Denna grupp rapporterade nyligen överföring av celler på en in vitro kaninhornhinna modell genom att placera explants på vanligt PLGA membran (membran utan ringstrukturer) 24. Med användning av föreliggande mikrofabricerade byggnadsställningar cellöverföring har tagits ett steg längre eftersom vi nu specifikt kan lokalisera vävnadsexplantat inom microfeatures. Förmågan att placera explantaten direkt inom de nischer tillåter även kirurgen att använda membranen direkt på det kirurgiska teater undvika behovet av ett renrum för att först expandera limbus stamceller. Även denna del av work har fokuserat på utvecklingen av anordningar för hornhinnans sjukdom, kan denna mikrofabrikation teknik tillämpas även för att utveckla produkter för många andra tillämpningar. Framtida arbete kommer att undersöka tillverkningen av konstruktioner för regenerering av andra vävnader såsom hud och ben.
Medan konstruktionen och inledande tillverkningen av PEGDA mikrostrukturer kan vara tidskrävande, en gång fabricerade strukturerna kan återanvändas många gånger utan försämring. Därför kan den efterföljande tillverkningen av PLGA mikro nedbrytbara membraner genom elektrospinning utföras i samma takt som produktionen av vanligt ("ostrukturerade") membran efter monteringen av samlare. Även i detta arbete har vi använt microstereolithography för tillverkning av formarna, kan andra tillverkningsmetoder såsom 3D-tryckning eller formsprutning användas också. Följaktligen kan den underliggande form vara gjorda av andra polymerer eller metaller i stället för PEGDA. Som sådan här tekniken är mycket mångsidig och forskare kan lätt anpassa metoden för att matcha sina egna behov och faciliteter.
Den egna microstereolithography installation som används i denna studie kommer inte att tillåta framställning av konstruktioner med funktioner inom 30 um; Detta är inte en begränsning för hornhinnans ansökan beskrivs här, men det kan vara avgörande för utformningen av andra modeller. I så fall andra tekniker såsom 2 fotonen polymerisation (2PP) kan vara av intresse men electro tekniken kanske inte tillåta reproduktion av strukturer på under micron skala (detta håller på att studeras av vår grupp).
Kritiska steg inom tillverkningsprocessen är (i) Undvika overcuring av PEGDA mallar som kan kontrolleras genom att justera tid och mängder fotoinitiator. (Ii) Styra electro betingelser såsom temperatur och fuktighet. (Iii) Lagring lämpligt att electrospun ringmembran som utnyttjar vakuum-förpackning och torkmedel.
Sammanfattningsvis genom att placera limbus vävnadsexplantat inom microfeatures membranets vi har visat cell utväxt från explantaten på nischområden, överföring cellen på en kanin sårad hornhinnan och därefter åter läkningen av hornhinnan. Nedbrytningen av membranen som är lagrade vid olika temperaturer har också studerats och en förpackningsprotokoll som tillåter långtidslagring av membran har utvecklats, varvid den senare är viktig i att utveckla membraner för klinisk användning.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
