Summary
Biz hücre davranışlarını incelemek için hangi electrospun zarlar içinde mikrocepler imalatı için bir teknik rapor. Özellikle, PLGA (poli (laktid-ko-glikolid)) microfeatures ile donatılmış kornea biyomalzeme cihazların üretimi için microstereolithography ve üretebilmektedir bir kombinasyonunu tarif eder.
Abstract
Kornea sorunlar tüm dünyada yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltarak milyonlarca insanı etkilemektedir. Kornea hastalığı gibi Aniridi veya Steven Johnson Sendromu gibi gibi kimyasal yanıklar ve radyasyon gibi dış etkenlerden hastalıklardan kaynaklanabilir. Mevcut tedaviler, (i) korneal greft kullanımı olup, (i) laboratuarda genişletilmiş ve taşıyıcılar (örneğin, amniyotik membran) teslim kök hücre kullanımı; Bu tedaviler nispeten başarılı olan ama ne yazık ki 3-5 yıl sonra başarısız olabilir. Tasarımı ayrıntılı olarak kök hücreler kornea ikamet fizyolojik ortamının taklit edebilen yeni bir biyo materyal kornea cihazların üretimi için, bir ihtiyaç vardır. Limbal kök hücreler Vogt Palisades'de olarak bilinen özel nişler (kornea ve sklera arasındaki dairesel alan) limbusta bulunmaktadır. Bu çalışmada iki kesim-kenar üretim teknikleri (microstereolithography ve electrospinn birleştiren yeni bir platform teknolojisini geliştirdikbir ölçüde limbusa taklit kornea zarların imalatı için) ing. Bizim membranlar Vogt Palisades göz gibi koruma hücreleri sağlamayı hedefliyoruz yapay mikrocepler içerir.
Introduction
Kornea, gözün avasküler merkezi en dış doku, görme 1 'de yer en önemli dokuların biridir. Kornea işlevini korumak çeşitli hücre türleri vardır. Korneanın en dış tabaka kalınlığı 2 ile ilgili olarak 5-7 kat olabilir epitel hücreleri içerir. Bu katman, kornea 3 içine bakteri istilasını engeller ve oksijen 4 girişine izin verir. Bu rapor edilmiştir limbusu 5,6 olarak bilinen kornea periferal bölgesinde (120-150 um boyutundaki) niş ve kript kornea epitel yalan kök hücreleri. Kök hücre bölünmeleri, aynı zamanda geçici yükseltme hücreleri olarak bilinen yavru hücre nişler dışına seyahat gibi bölünme hücreler sentripetal içeriye doğru hareket ve Çoklu santral kornea bölgede 7,8 de terminal olarak farklılaşmış hücreler elde ediyor. Bu hücreler rutin göz e açıp kapayıncaya ile sildi edilir9 altında yeni hücreleri xposing.
Epitel kök hücrelerin yer olmanın yanı sıra, aynı zamanda kenar şeridi kornea bölgesinin 10 uzak vaskülarize konjonktiva tutulmasında önemli bir rol oynar. Limbusa hasar termal / kimyasal yanıklar, radyasyon ve genetik hastalıklar 10 neden olabilir. Bu durumda, Limbustan bariyer, konjonktiva hücre kornea üzerine taşımak için izin bölgeyi vascularizing, bazı durumlarda ağrı ve körlüğe neden bozuldu. Durum limbal kök hücre yetmezliği (LSCD) 10 olarak bilinir.
Farklı doğal substratlar kornea rejenerasyonuna yardımcı maksimum kök hücre taşıyıcılar olarak bildirilmiştir. Örneğin kolajen-bazlı membranlar Dravida ve ark. 11 Rama'nın ve çalışma arkadaşları tarafından 12 112 hasta ile yapılan bir çalışmada, fibrin kullanımını rapor kullanılmıştır. Mevcut tedavi, ancak en yaygın olarak kullanılan yöntem deyüzeyinde 13,14 üzerinde bir doku bankası kültür ve limbal epitel hücrelerinden insan amniyotik zar kullanmaktır. Bir tek tabakalı oluştuktan sonra, amniyotik membran cerrahi öncesinde bu hücre nakli 14 ondan kaldırıldı tüm konjonktiva hücreleri ve skar dokusu hasarlı kornea üzerine kadar hücre tarafı yapıştırılır. Amniyon zarı epitel 15,16 yenilemek için soyulmuş alana bağlı epitel hücreleri bırakarak haftalar ve aylar içinde düşürür. Ancak bu teknik, klinik olarak yaygın alımını kısıtlamak, bir kaç pratik sorunlar hala var vizyonunu yeniden başarılı olmuştur. Amniyotik membran insan dokusu olduğu gibi hastalarda hücre nakli için kullanılmadan önce iyi doku bankacılık prosedürleri kullanılarak tarama geçmesi gerekiyor. Bu tarama, sadece hastalıkların bulaşma riskini azaltır ama tamamen o 17 yok edemez. Buna ek olarak p değişkenlik raporlar bulunmaktadırnedeniyle arası donör varyasyon 18,19 ve farklı işleme yöntemleri 19,20 ile amniyotik membranın performansı alabilirsiniz. Hastalık bulaşma riski küçük yanında cerrahi merkezleri hepsi için geçerli değil de işletilen doku bankaları, erişimi için gereksinim yoktur.
Amniyotik membran göreceli olarak başarılı olsa da, kornea hastalığının tedavisi için yeni sentetik biyolojik olarak parçalanabilir bir taşıyıcı hücre alternatifler geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır. Sentetik taşıyıcılar prosedürleri bankacılık yanı sıra hastalık bulaşması ve inter-donör değişkenlik küçük riskini ortadan kaldırmak için ihtiyaç aşmak olur. Bu anlamda, bu tür polietilen glikol 21,22 ve 23,24 PLGA gibi maddeler incelenmiştir.
Insan amniyotik zara sentetik bir alternatif geliştirilmesinde umutla kültürlenmiş hücrelerin hayatta kalma yardımcı içine istenen tasarım özellikleri olasılığı da vardır. Inchücre davranışı belirli kontrolü için biyomalzeme cihazlar içinde microfeatures bir ham hayal ilgi gelişmekte olan bir alandır. Yapay kök hücrelerin gelişimi 25-30 nişler doğru Birçok yazar çalışmalarını bildirdi. Bu grup, son zamanlarda, limbal epitel hücrelerinin 22 teslim ve epitel hücreleri, limbal 31 desteklenmesi için mikrofabrike cepleri ihtiva eden biyolojik olarak parçalanabilir bir electrospun zarların üretimi için kullanılan bir yöntem için bir mikrofabrike PEGDA fibronektin biofunctionalized yapay limbusun oluşturulmasını rapor etmiştir.
Bu çalışmanın amacı, bir ölçüde hücreler vücutta bulunan kök olduğu mikroçevrelerde taklit microfeatures ihtiva eden biyo-malzeme cihazların geliştirilmesi için yeni bir üretim teknolojisinin geliştirilmesidir. Bu veric gösteren biyolojik olarak parçalanabilir bir mikrostrüktürlü zarların imalat sağlar ve elektrospinning microstereolithography birleştiren bir teknik geliştirdilerdoku rejenerasyonu uygulamalar t potansiyeli.
Bu, bu çalışmada bu teknik, kornea yenilenme halkalarının imalatı için uygulanmış olsa da, teknoloji epitelyal dokuların geniş bir rejenerasyonu, örneğin, deri, ağız için cihazların imalatı için tatbik edilebilir olduğunu fark etmek önemlidir mukoza, bağırsak, solunum ve mesane epitel. Spesifik olarak, bu çalışmada, kornea hücreleri sunmak için amniotik zara benzer bir şekilde işlev gören bir biyo-bozunabilir sentetik zar geliştirdik. Bu membran yaklaşık 300 um mikrocepler içerir ((büyük Vogt Pallisades bir limbal crypts 150 civarında mikron)). Son olarak, bu membranların bozulma görülmeksizin fazla 6 ay boyunca -20 ° C de saklanmasını sağlayan bir ambalaj protokolunu oluşturmuşlardır.
Protocol
Etik Açıklama: Bu çalışmada kullanılan gözler Hayvan Araştırma Açıklık üzerinde Bildirgesine göre kullanılmıştır:
Mikrocepler ile donatılmış PLGA Biyobozunur Membranlarının 1. Fabrikasyon
- Halka iskeleleri microstereolithography ve elektro teknikleri 31 bir kombinasyonu ile oluşturulmuştur. Esas olarak, işlem microstereolithography ve (ii) temel PEGDA yapının üretimi için kalıp üzerinde electrospinning (bu durumda bir mikrofabrike halka) PEGDA şablonları 2 bölüm (i) oluşturulması özetlenebilir. Bu iki adım (Şekiller 1 ve 2), aşağıda ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.
- Microstereolithography tarafından PEGDA şablonlar Fabrikasyon (microSL)
- Birinci tabaka (L1), yapının taban ve at nalı morfolojiye 6 mikrocepler gösteren ikinci tabaka (L2) sahip olan, bir 2 tabakalı modeli kullanılarak imal halkaları300-500 mikron boyutlarda bir dizi es. PEGDA halkaların imalatı yakın zamanda bu grup 22 tarafından tanımlanmıştır.
- Uygun herhangi bir çizim programı kullanarak bir 1,2 cm siyah bir daire çizerek L1 oluşturun.
- Aynı şekilde, ancak 8 L2 oluşturma beyaz, 0.5 x 0.35 mm, at nalı şekilli yapılar yer alır. Siyah daire yapısı içinde küçük beyaz at nalı şekiller dağıtın.
- JPEG formatında kaydet L1 ve L2.
- Koyu renkli bir cam şişe içinde, 20 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde, kamforkinon, katiyonik bir ışık başlatan 1 w / w ile% polietilen glikol diakrilat (PEGDA, Mn = 250 g / Mol) karıştırılır.
- Set-up teleskopik lens düzenlemesini kullanarak microstereolithography lazer ışını genişletmek ve daha sonra bir bilgisayar programlanabilir dijital multimirror cihazı (UV-etkin DMD starter kit) üzerine proje. NOT: DMD 10 cm odak uzaklığı tüp lens aracılığıyla bir ayna üzerine (bu durumda bir halka) görüntüyü yansıtıyor. Görüntü daha sonra gümüş-COA tarafından yönlendirilirted ışıkla polimer (PEGDA) ihtiva eden bir şişe içine yansıtır.
- Ayarlayın ve dikkatle kurmak microstereolithography bir optik temizleyin.
- 12-çukurlu bir doku kültür plakasının bir kuyuya PEGDA karışımın 300 ul koyun. Oyuklar, sertleştirme sonunda yapısının kolay çıkarılması için teflon veya diğer yapışmayan malzeme ile önceden kaplanmış olduğundan emin olun.
- Mavi lazer Anahtarı (MBL-III 473 nm; 150 mW) ALP3-temel yazılım içine ve L1 karşıya önceden PC'de yüklü. 60 sn için ilk katmanı ışın tedavisi. NOT: ALP3-Temel PC ve Dijital micromirror cihaz arasındaki bağlantıyı sağlayan USB arayüzü.
- , PEGDA 250 ul daha iyi bir eklemek, yukarıda tarif edilen ve 60 saniye boyunca ışın L2 olarak L2 yükleyin.
- Sabitlenmemiş polimerin çıkarın ve izopropanol O / N ile halka yıkayın.
- Birinci tabaka (L1), yapının taban ve at nalı morfolojiye 6 mikrocepler gösteren ikinci tabaka (L2) sahip olan, bir 2 tabakalı modeli kullanılarak imal halkaları300-500 mikron boyutlarda bir dizi es. PEGDA halkaların imalatı yakın zamanda bu grup 22 tarafından tanımlanmıştır.
- Biyobozunur PLGA'nın Fabrikasyon elektrospinning kullanarak Membranı
Not: PEGDA halkaları kalıp olarak kullanılmıştırs, üzerinde PLGA bu şablonlar üzerinde bükülmüş olarak PLGA yatan topografya üreyen ile electrospun edildi. Iplik sonra, PLGA polimerin tabaka kolektöründen soyuldu. Nihai zar PLGA metalik toplayıcıya bağlı kalmıştı PEGDA halkaları içermiyordu.- Statik bir elektro toplayıcı oluşturmak için bir elektrolitik alüminyum levha üzerine PEGDA halkaları (12 cm x 20 cm) dağıtın.
- Iletken karbon bant kullanarak halkaları takın. NOT: Bir kez Elektrospinning için şablon olarak yeniden kullanılabilir oluşan bu halkalar.
- Eğirme için polimer solüsyonu hazırlayın. Konsantrasyon ağ / ağ% 20 olan diklorometan (DCM) 'de: PLGA (glikolid (48 mol%), 44 kg / mol' 50/50 DL-laktit (52 mol%)) içinde çözülür.
- Stir O / N kullanmadan önce.
- Bir şırınga pompası Place 4 insülin enjektörleri (uçlu, 0.8 cm iç çapı iğne künt). NOT: Dört şırıngalar bir tek şırınga ile çalışmaktan daha hızlı elektrospinning sağlanmalıdır.
- Her şırıngada PLGA solüsyonu, 2.5 ml yükleyin.
- Electrospin kullanılarak 30 ul / dak akış hızı ve 12 kV arasında değişen 15 gerilimleri göstermektedir. Iğne ve 15 cm kolektör arasında mesafe bırakın.
- 1 saat ve 30 dakika boyunca dikkatli bir şekilde Electrospin ve son olarak PEGDA halkaları destek kolektöründen PLGA electrospun Ön soyun.
- Dairesel bir delik zımba kullanılarak ve merkezinde konumlandırılmış halka yapısı bırakarak 22 mm çaplı daire içine electrospun iskeleleri kesin.
- Microstereolithography tarafından PEGDA şablonlar Fabrikasyon (microSL)
PLGA Microfabricated Membranlarının 2. Uzun vadeli Depolama
Not: PLGA halkaları fabrikasyon ve akredite dış şirketler tarafından sterilize edildi; Örnekler 25-40 KGy bir dış doz aralığında ışınlanmıştır.
- Küçük bir kapta membran (Plastik petri) mount ve bir tıbbi sınıf torba içine koyun.
- Desikantlar için küçük bir filtre çanta oluşturmak için filtre kağıdı kullanın. To, çanta oluşturmak filtre kağıdı (125 mm çapında) kat ve yarım sonuçlanan yarım daire kesilmiş; Daha sonra bant kullanarak bir araya biter mühür.
- Sırasıyla silika portakal, kobalt (II) klorür ve bakır (II) sülfat, 1 g üç filtre kağıt poşet doldurun.
- Electrospun membran ile birlikte tıbbi sınıf çantanın içindeki kurutucu üç çanta koymak.
- Depolama süresince herhangi bir nem birikimini tespit etmek çantası için piyasada mevcut altı nokta nem göstergesi kartı ekleyin.
- Vakum ve çanta mühür bir vakum ısı mühür makinesi kullanın.
- Γ-ışınlama için harici bir şirkete halka zarları gönderin.
- Mağaza% 5 CO2 içeren bir inkübatör içerisindeki nemli bir ortamda 37 ° C -20 ° C arasındaki sıcaklıklarda bir geniş olarak PLGA zarların γ-maruz bırakıldı.
- Mesaj depolama, nem seviyesi% 30 altında olduğunu doğrulamak için nem göstergesini inceleyin.
- Use Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) lif bütünlüğünü değerlendirmek için.
Limbal Eksplantlarından 3. İzolasyon
Tavşan limbal eksplant (tavşan tüketimi için yetiştirilen bir çiftlikte elde edilen) tavşan gözlerinde izole edilmiştir.
- Antiseptik çözeltisi (% 3) kullanarak tavşan gözlerini dezenfekte.
- Korneayı çevreleyen herhangi bir aşırı doku kaldırarak gözleri temizleyin.
- Bir disseksiyon mikroskobu kullanılarak kornea geri kalanından (kornea (şeffaf) ve sklera (beyaz) arasında ince, daire şeklindeki bir alan olarak tanımlanan) limbal bölgeyi ayırın.
- Diseksiyon mikroskop altında (1.5 civarında cm uzunluğunda) parçalar halinde kesilir.
- 1 dakika boyunca% 1.5 antiseptik solüsyon ile limbal kesimleri dezenfekte edin.
- Bir neşter bıçağı ile küçük parçalara (100-500 mikron) içine limbal kesimleri kesmek.
- Kültür ortamı içindeki dokunun küçük parçalar halinde saklayın (DMEM Glutamax: Ham's F12 (1: 1),% 10 fetal sığır serumu, 1 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomisin, 2.5 ug / ml amfoterisin, EGF, 10 ng / ml ve 37 ° C'de insülin 5 mg / ml) ve% 5 CO2, kullanılıncaya kadar (en fazla 60 dakika).
Limbal eksplantlardan 4. Hücrelerin üremesi
Tavşan, limbal eksplantlar vakumlanmış ve -20 ° C'de 6 ay boyunca saklanabilir her ikisi taze eğrilmiş mikrofabrike membranlar membran üzerine yerleştirilmiştir.
- Kat fibrin yapıştırıcı 15 ul halka iskeleleri: fibrin dağıtmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak (1, 2.5 U / ml 'lik bir konsantrasyonda, insan plazmasından 18,75 mg / ml trombin bir konsantrasyonda insan plazmasından fibrinojen 1 karışımı) eşit.
- Bir 25 G iğne bir teşrih mikroskobu ile PLGA mikrocepler doğrudan doku eksplantlar.
- Eksplantlarının koparmasını önlemek için çok hafifçe hücre kültürü ortamı ekleyin.
- Her 3 gün (medya bölümünde 3.7 tarif tarifi) ve k medya değiştirin37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 2 hafta boyunca kültür EEP ve% 5 CO2.
- PBS ile 3 yıkama ile takip edilen, 10 dakika boyunca% 3.7 tamponlu formaldehid ile örnekleri sabitleyin.
- 4 1 ug / ml 'de inkübasyon ile Counterstain, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ya da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca propidyum iyodür (PI).
- PBS içinde 3 kez yıkayın ve folyo ile kaplı örnekleri saklamak.
- Görüntü 543 nm ve 800 nm (iki-fotonlu) dalga boylarında, bir floresans mikroskobu kullanılarak örnekleri.
5. Ayar-up Tavşan Yaralı Kornea 3D Modeller
- Temiz ve yukarıda tarif edildiği gibi tavşan gözlerini dezenfekte.
- 5 dakika için% 0.14 amonyum hidroksit içine daldırılarak tavşan gözlerini yara.
- PBS içinde yıkayınız ve bir sclerotome bıçakla epitel kazınması.
- Kesme ve kalan doku kaldırarak kornea-skleral düğmesini izole.
- Üzerine kornealar aşağı epitel tarafı yerleştirinsteril bir fincan ve DMEM'de yapılan% 0.5 agar ile doldurun.
- Bir kez küçük tabaklara kadar kornealar epitel yan koymak ve limbal alana kadar kültür ortamı (yukarıda tarif tarifi) ekleyin, ayarlayın. NOT: Bütün kornea örtmeyin; hava-sıvı ara organ kültürü tutun.
Limbal Eksplantlarından ve Tavşan Kornea 3D Modelleri Yüzük iskelelerinin İçerme 6. İzolasyonu
- Kat fibrin yapıştırıcı 15 ul halka zarlar: yukarıdaki hücre kazıyıcı .Use (1 2.5 U / ml bir konsantrasyonda 18.75 mg / ml trombin konsantrasyonunda fıbrinojen, 1 karışımı) tarif edildiği gibi.
- Bir 25 G iğne bir teşrih mikroskobu ile PLGA mikrocepler doğrudan doku eksplantlar.
- Yukarı bakacak şekilde eksplant ile ve hava-sıvı arayüz şartlarında çıplak bırakılmış kornealar dokusu eksplantlan ile halkaları yerleştirin. (Bu koşullar, daha önce 22 tarif edilmiştir).
- Için organ kültürü modellerini korumak37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatör içinde 4 hafta ve% 5 CO2 her 2 günde bir ortam değiştirilmesi.
Değerlendirme Kornea Rejenerasyon 7. ve Hücre Bakım Kök
- 4 hafta sonra,% 3.7 formaldehit kullanarak kornealar sabitleyin.
- Geleneksel histoloji 6 mikron parafin bölümleri üretmek için kornealar işleyin.
- Hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyayın.
- Donmuş kesitler imünosito kimya, ksilen (3 dk) olarak bölümleri mumunun ve% 100 etanol (1 dakika),% 70 etanol (1 dakika) ve damıtılmış su (2 dakika) nemlendirir.
- Küçük alanları sınırlandırmak ve antikorun aşırı kullanımını önlemek için bir Dako kalem kullanarak bölümleri Delineate.
- 20 dakika boyunca (37 ° C),% 0.05 tripsin (100 ul) ile tarif bölgelerini tedavi.
- PBS ile iyice yıkayın ve 1 saat boyunca% 10 keçi serumu (engelleme) 100 ul ekleyin.
- Fare monoklonal antikoru cytokera 100 ul ile inkübe örneklerikalay 3 (CK3) ve 4 ° C 'de% 1 keçi serumu O / N p63 100 ul.
- PBS ile yıkayın ve biyotinile edilmiş ikincil anti-fare antikoru 100 ile tedavi ul (1: 1000,% 1 keçi serumu) oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (100,% 1 keçi serumu 1) FITC streptavidin 100 ul ilave edin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi DAPI ile örnekleri tedavi edin.
- Görüntü 800 nm'de (iki-fotonlu) ve 488 nm dalga boyunda bir flüoresan mikroskop kullanılarak örnekleri.
Representative Results
Electrospun mikrofabrike halkaları (Şekiller 1 ve 2) ve microstereolithography üretebilmektedir bir kombinasyonu kullanılarak elde edilmiştir. Farklı boyutlarda PEGDA halkalar microstereolithography (Şekil 3) kullanılarak imal edildi; Bu teknik cm civarında olması ve microfeatures aynı anda dahil edilmesi üretim yapıları sağlar. Bu durumda, değişik çaplarda halkaların 350-500 um'lik mikrocepler içeren 1.2-1.6 sm kadar (Şekil 4) imal edildi.
, Üreten sterilizasyon ve gelecekteki klinik kullanım için malzemelerin ambalaj açısından tıbbi dereceli poşetlerde olduğu vakum paketleme anlamlı PLGA membranların (Şekil 5) uzun süreli saklama ulaşmak için yeteneği gelişmiş bulundu; 0.12 mm kalınlığında bir tıbbi sınıf, torba (PET / Folyo / LDPE) ile kullanılması, uzun bir raf ömrü elde etmek için izin verdi. Bu Membr göndererek araştırıldıHindistan ve zarlarda işbirlikçilerimizden için anes oda sıcaklığında ve kasıtlı olarak nemli koşullarda (nemli bir kuluçka makinesinde) 37 ° C, -20 ° C 'de aylık bir periyot süresince depolanmıştır. Şekil 5, Şekil bu depolama kasıtlı olarak tahrik edici koşulları kullanılarak da Nemli koşullarda 37 ° C, membranlar koşullar dolu olmayan vakum altında yaklaşık 1 ay boyunca sadece kararlı, ama vakumlu koşullarda (Şekil 5 ve Tablo 1) kapsamında 3 ay saklanmasını sağladılar.
Tablo 1 bile, su emme ve lif, bir ikinci torba seçimine özen ise şişme vesile olmak için seçilen şartlar altında elde edilebilir depolama şartlarında bir iyileşmeyi ortaya koymaktadır.
Halkalar Farklı koşullar altında (I) 'in, taze yapılmış ve (ii) 6 ay (Şekil 6) depolanabilir yüzükler limbal eksplantlar hücre büyümesinin desteklenir. Hücre devir 4 hafta sonra elde edilmiştir zaman çoğ3D yaralı modelleri PLGA membranlar acing. Hücreler, daha önceden soyulmuş kornea yeni epitel (Şekil 7) oluşturmak zarlar üzerine yerleştirilen doku eksplantlarında doğmuştur. Ve negatif kontroller (yaralı kornea) Pozitif (herhangi bir tedavi olmadan kornea) de zaman aynı dönemler için kültür içinde muhafaza edilmiştir. Negatif kontroller, hiçbir ilave hücrelerin yokluğunda yeni epitel oluşumu eksikliği doğrulandı. İmmünositokimya onlar kornea farklılaşma işaretleyici Ck3 (Şekil 7E) için pozitif beri eksplantlardan dışarı büyüyen hücreler kornea epitel hücreleri olduğunu gösterdi.
Microstereolithography Şekil 1. Şematik PEGDA halkaları oluşturulması için kurulmuş.
her.within-sayfa "her zaman" => 
Bir şablon olarak PEGDA mikrofabrike halkaları kullanılarak sürecini electrospinning Şekil 2. şematik.
Şekil 3 (A). Mikrofabrike PLGA zarların iplik için statik bir toplayıcı (PEGDA halkalar ile elektrolitik alüminyum levha) bir örneğini gösterir (B) ve (E) farklı electrospun paspaslar statik toplayıcıları soyulacağına gösterir. (C) gösteriler altta yatan bir yüzeyin imalatı için microstereolithography kullanarak çok yönlülüğünü vurgulayan farklı boyutlarda PEGDA şablonları. (D), bir PLGA mikrofabrike kopyasını gösterir./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
At nalı microfeature (A) bir PEGDA halkasının Şekil 4. SEM görüntüsü; bir microfabricated cepte (B) yüksek büyütme SEM görüntüsü. At nalı microfeature (C), bir PLGA halkanın Faz kontrast bir görüntü; bir microfabricated cepte (D) yüksek büyütme faz kontrast görüntü. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil taze biyolojik olarak parçalanabilir bir PLGA halkalarında, limbal eksplantlardan LEC gelişimini gösteren 6. Floresan görüntüleri (A, B) ve -20 ° C'de 6 ay süreyle saklamanın ardından halkalarda° C (C, D). Görüntü (A) ve (B) 'DAPI (mavi) ve sırasıyla, propidyum iyodür (kırmızı) ile boyanmış hücrelere karşılık gelmektedir. Resim b mikrofabrike cebe yerleştirilen bir eksplant bir konfokal z yığınından bir dikey görünüşüdür. Görüntüler (C) ve (D) p63 (yeşil) için pozitif boyanma gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 7 (A) Daha önce fibrin yapıştırıcı ile kaplanmış olan bir platform üzerinde yer alan bir halka iskele ve dokusu eksplantlan ile bir tavşan kornea yaralı bir modelini göstermektedir (B) ve (C), pozitif ve negatif kontroller olarak; pozitif kontrol taze bir haham . t, saydam tabaka ve negatif kontrol epitel kasıtlı olarak kullanılmıştır (negatif kontrol 4 hafta kültüre oldu) uzaklaştırılmıştır, bir saydam tabaka (D) kültür içinde 4 hafta sonra, bir doku mühendisliği korneanın H & E ile bir görüntüdür; Şekil niş yerleştirilen eksplantlar çıkan hücreler tarafından oluşturulan yeni çok-tabakalı epitelyum gösterir (E), limbal eksplanttan hücre gelişimini gösteren bir immünositokimya görüntüdür. çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı ve hücreler sitokeratin 3 pozitif boyanma gösterir vardır, bir kornea farklılaşma işaretleyici (yeşil). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| PLGA (50/50) | x, 37 ° C'de nemli bir saklandı zarlar için "> Elyaf bütünlüğü|||||||
| Gün 0 | Ay 1 | Ay 2 | Aylık 3 | Ay 4 | Ay 5 | Ay 6 | |
| Paketli Sigara Vakum | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Vakumlu (Çanta A) (PE, PA Kompozit) Kalınlığı: 0.14 mm | +++ | + | - | 64px; "> -- | - | - | |
| Vakumlu (Çanta B) (PET / Folyo / AYPE) Kalınlığı: 0.75 mm | +++ | +++ | +++ | + | - | - | - |
PLGA bütünlüğünü ve farklı vakum saklama torbası Tablo 1. etkisi (50/50) membran (44 kg / mol), depolamadan 6 ay boyunca incelendi. Membran bütünlüğünün tamamen sağlam fiberler (+++) bazı Lif şişmesi olarak skorlandı (++), elyaf birleştirme (+) veya bozulmamış elyaf (-).
Discussion
Bu çalışma, içlerinde ihtiva microfeatures electrospun zarların imalat ve nasıl vakum ambalaj, gama ışıması ve daha sonra depolama, kullanımdan önce, klinik kullanım için bu tür membranlar hazırlamak için (b) (a) bir yöntem açıklanır. Bu özel uygulama biz limbal kök hücre nişler fiziksel özelliklerini taklit mikrocepler içeren PLGA zarlarını geliştirdik. Bu çalışmanın amacı, (i) doku rejenerasyonu ve (ii) daha iyi anlaşılması ile okuyucuya sunmak için kök hücre nişler katkýya araştırma için microfeatures içeren iskeleleri tasarım ve imal için gerekli bilgi ile okuyuculara sunmak yöntemlerini tanımlamak için vardır süresi uzun süreler boyunca electrospun iskeleleri saklamak için nasıl.
Klinik uygulama açısından, halka zarların depolama büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, halkanın bozulması 6 aylık bir süre boyunca çalışılmıştır. Parçalanmazarları sadece nemsiz işlemi durdurulur membranlar tutarak çok hidroliz ile tahrik edilir. Blackwood et al. PGA için PLA oran değiştirilerek, membranın bozulması 32 değiştirir bildirmiştir. Bu çalışma ayrıca, PGA miktarının arttırılmasıyla, electrospun membran bozulma oranı, in vivo 22 artış göstermiştir. Burada vakum bazı kurutucu ile birlikte membranlar, paketleme ve onları aydınlatma ve 6 ay boyunca düşük sıcaklıklarda saklayarak ile, lif bütünlüğü ve yıkımı hiçbir değişiklik olmadığını gösterilmiştir. Şu anda, 6 ay kadar biz 1 yıl, -20 ° C'de 22 de düz electrospun zarlarında rapor ve şimdi -20 ° C'de depolanması için yayınlanmadı verilere sahip olmuştur bu membranlar mikrocepler ancak depolama verilerini içeren okumuş gibidir herhangi bir bozulma belirtisi olmadan 2 yıl boyunca. Böylece uzun süreli depolama için -20 onları kuru saklamak için tavsiye edilebilir6 C ama (muhtemelen daha uzun) en az 6 ay için daha da Hindistan oda sıcaklığında saklayın mümkündür. Bir nem göstergesi dahil ambalaj onlar amaca uygun olacak, bu durumda kuru zarları muhafaza ettiğini kontrol kolay bir araç verir.
Mikrocepler içinde limbal eksplantlarını verirken 3D kornea modelleri bu halkaları hücrelerinin transferi gösterilmiştir. Bu grup, en son düz bir PLGA membranlar (halka yapıları olmadan membranlar) üzerinde eksplantların 24 yerleştirerek bir in vitro tavşan kornea modeli üzerine hücre transferi bildirilmiştir. Mevcut mikrofabrike iskeleleri hücre aktarımını kullanarak biz şimdi özellikle microfeatures içindeki doku eksplantlarını bulmak gibi bir adım daha atılmıştır. Nişler içinde doğrudan eksplantlarının yerleştirmek için yeteneği de cerrah ilk limbal kök hücreleri genişletmek için bir temiz oda ihtiyacı kaçınarak cerrahi tiyatro doğrudan membranlar kullanmanıza olanak sağlar. Kel bu parça olmasına rağmenk, kornea hastalığı için cihazların geliştirilmesinde üzerine odaklanmıştır, bu mikroimalat teknolojisi, aynı zamanda pek çok diğer uygulama için cihazlar geliştirmek için de uygulanabilir. Gelecekteki çalışmalar gibi deri ve kemik gibi diğer dokuların yenilenmesi için yapıların imalat inceleyeceğiz.
PEGDA mikroyapıların tasarımı ve ilk fabrikasyon zaman alıcı olabilir iken, bir kez yapıların bozulma olmadan birçok kez tekrar edilebilir fabrikasyon. Bu nedenle, elektroeğirme PLGA mikrostrüktür biyolojik olarak parçalanabilir bir membran daha sonra imalat kollektörün montajından sonra düz ('yapılandırılmamış') zarların üretimi için benzer bir hızda gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada, çok kalıpların imal edilmesi için microstereolithography açıklanmasına rağmen, örneğin 3D-baskı veya enjeksiyon tipi kalıplama gibi başka üretim yöntemleri de kullanılabilir. Bu duruma göre, temel kalıp PE yerine diğer polimerler ya da metallerden yapılabilmektedirGDA. Gibi, bu tekniği çok yönlü ve araştırmacılar kolayca kendi ihtiyaçları ve imkanları maç yöntemini uyarlayabilirsiniz.
30uM altında özelliklere sahip yapıların hazırlanmasını izin vermez, bu çalışmada kullanılan içi microstereolithography kurulum; Bu Burada anlatılan kornea uygulama için bir sınırlama değil ama diğer modellerin tasarımında önemli olabilir. Bu durumda diğer teknikleri gibi 2 foton polimerizasyon (2PP) Ancak elektro tekniği (bu şu anda bizim grup tarafından incelenmiştir ediliyor) alt-mikron ölçekte yapıların çoğalmasını izin vermeyebilir ilgi olabilir.
Üretim sürecinde kritik adım ve zaman foto-başlatıcı miktarları ayarlanarak kontrol edilebilir PEGDA şablonlarının overcuring kaçınmak (i). (Ii) bu sıcaklık ve nem gibi elektro koşullarını kontrol. (Iii) uygun bir şekilde saklanması electrospuvakum ambalaj ve kurutucu kullanarak n halka membranlar.
Özet olarak, membranın microfeatures içinde, limbal doku eksplantlarında yerleştirerek bir tavşan kornea yaralı ve korneanın yeniden epitelizasyonunu sonra üzerine hücresi alanları, hücre transfer eksplantlar hücre büyümesinin göstermiştir. Farklı sıcaklıklarda saklandı zarların bozulması üzerine de çalışmalar yapılmış ve membranlar, uzun süreli depolama izin veren bir paket protokol, klinik kullanım için membranlar geliştirilmesinde önemli olmakla, ikinci geliştirilmiştir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
