Summary
نفيدكم تقنية لتصنيع micropockets داخل الأغشية electrospun للدراسة سلوك الخلية. على وجه التحديد، ونحن تصف مزيج من microstereolithography وelectrospinning لإنتاج PLGA (بولي (lactide-CO-glycolide)) أجهزة بيولوجية القرنية مجهزة microfeatures.
Abstract
مشاكل القرنية تؤثر على الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم خفض نوعية حياتهم إلى حد كبير. يمكن أن يكون سبب مرض القرنية من الأمراض مثل انعدام القزحية أو متلازمة ستيفن جونسون، فضلا عن العوامل الخارجية مثل الحروق الكيميائية أو الإشعاع. العلاجات الحالية هي (ط) استخدام الطعوم القرنية و (ب) استخدام الخلايا الجذعية توسعت في المختبر وتسليمها في ناقلات (مثل الغشاء الذي يحيط بالجنين). هذه العلاجات الناجحة نسبيا ولكن للأسف أنها يمكن أن تفشل بعد 3-5 سنوات. هناك حاجة إلى تصميم وتصنيع الأجهزة الجديدة مادة بيولوجية القرنية قادرة على تقليد بالتفصيل البيئة الفسيولوجية حيث توجد الخلايا الجذعية في القرنية. تقع الخلايا الجذعية الحوفي في حوف (منطقة دائرية بين القرنية والصلبة) في قطاعات محددة تعرف باسم الحواجز من فوغت. في هذا العمل قمنا بتطوير تقنية المنصة الجديدة التي تجمع بين اثنين من تقنيات التصنيع المتطورة (microstereolithography وelectrospinnجي) لتصنيع أغشية القرنية التي تحاكي إلى حد ما حوف. الأغشية لدينا تحتوي على micropockets اصطناعية والتي تهدف إلى توفير حماية الخلايا مع مثل الحواجز من فوغت القيام به في العين.
Introduction
القرنية، واوعائي المركزية معظم الأنسجة الخارجية للعين، هو واحد من الأنسجة أهم المشاركين في الرؤية 1. هناك عدة أنواع من الخلايا التي تحافظ على وظيفة القرنية. الطبقة الخارجية العليا من القرنية تتكون من خلايا الظهارية التي يمكن أن تكون في حوالي 5-7 طبقات سماكة 2. هذه الطبقة تمنع الغزو البكتيري في القرنية 3 وتسمح بدخول الأكسجين 4. وقد أفيد أن الخلايا الجذعية تكمن ظهارة القرنية في محاريب أو أقبية (مع أحجام 120-150 ميكرون) في المنطقة الطرفية من القرنية المعروفة باسم حوف 5،6. كما تنقسم الخلايا الجذعية، وخلايا ابنة المعروف أيضا باسم خلايا تضخيم عابرة السفر من محاريب ويستمر انقسام الخلايا وتتحرك centripetally الداخل والناجمة صعودا في خلايا متباينة عضال في المنطقة القرنية المركزية 7،8. يتم محو هذه الخلايا بشكل روتيني بعيدا مع طرفة العين الإلكترونيةxposing الخلايا الجديدة تحت 9.
بالإضافة إلى كونه موقع الخلايا الجذعية الظهارية، حوف أيضا يلعب دورا في الحفاظ على الملتحمة أوعية دموية بعيدا عن المنطقة القرنية 10. يمكن أن يكون سبب الأضرار التي لحقت حوف بواسطة الحروق الحرارية / الكيميائي والإشعاع والأمراض الوراثية أيضا 10. عندما يحدث هذا، هو كسر حاجز حوف أسفل السماح للخلايا الملتحمة للتحرك على القرنية، vascularizing المنطقة، مما تسبب الألم والعمى في بعض الحالات. ومن المعروف أن الشرط كما نقص الخلايا الجذعية الحوفي (LSCD) 10.
وقد تم الإبلاغ عن ركائز طبيعية مختلفة ممكن ناقلات الخلايا الجذعية للمساعدة في تجديد القرنية. على سبيل المثال، تم استخدام الأغشية القائم على الكولاجين بواسطة درافيدا وآخرون 11 وراما وزملاء العمل 12 ذكرت استخدام الليفين في الدراسة 112 مرضى. في الوقت الحاضر ولكن الطريقة الأكثر شيوعا للعلاجهو استخدام الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري من بنك الأنسجة والثقافة الخلايا الظهارية الحوفي على سطحه 13،14. مرة واحدة وقد شكلت أحادي الطبقة، يتم لصقها الغشاء الذي يحيط بالجنين جانب خلية حتى على القرنية المتضررة، والتي لديها كل خلايا الملتحمة وندبا ازالتها جراحيا منه قبل ذلك زرع الخلايا 14. ويتحلل الغشاء الذي يحيط بالجنين في غضون أسابيع أو شهور تاركة الخلايا الظهارية التي تعلق على منطقة الجرداء لتجديد البشرة 15،16. وكان هذا الأسلوب ناجحا في استعادة الرؤية ولكن لا يزال هناك عدد قليل من القضايا العملية التي تقيد امتصاص على نطاق واسع سريريا. كما الغشاء الذي يحيط بالجنين والأنسجة البشرية التي يحتاج للخضوع لفحص الأنسجة باستخدام إجراءات مصرفية جيدة قبل استخدامها لزرع الخلايا في المرضى. هذا الفحص يقلل فقط من خطر انتقال الأمراض ولكن لا يمكن القضاء عليه تماما 17. وبالإضافة إلى ذلك كانت هناك تقارير من التباين في صerformance من الغشاء الذي يحيط بالجنين بسبب أمور الاختلاف 18،19 المانحة وطرق المعالجة المختلفة 19،20. إلى جانب خطر صغير من انتقال المرض هناك شرط المراكز الجراحية في الحصول على بنوك الأنسجة التي تتمتع بإدارة جيدة، وليس المتاحة للجميع.
على الرغم من أن الغشاء الذي يحيط بالجنين ناجحا نسبيا، وهناك حاجة لتطوير البدائل الاصطناعية القابلة للتحلل الناقل خلية جديدة لعلاج مرض القرنية. ان ناقلات الاصطناعية التغلب على الحاجة إلى الإجراءات المصرفية، فضلا عن القضاء على خطر صغير من انتقال المرض وتقلبه بين الجهات المانحة. في هذا المعنى، وقد درست مواد مثل البولي ايثيلين جلايكول 21،22 و 23،24 PLGA.
على إيجاد بديل اصطناعي لغشاء يحيط بالجنين البشري هناك أيضا إمكانية لتصميم فيه ميزات مرغوبة للمساعدة نأمل بقاء الخلايا المستزرعة. والمؤتمر الوطني العراقيlusion من microfeatures داخل أجهزة بيولوجية لمراقبة معينة من سلوك الخلية هو المجال الناشئ للاهتمام. وأفادت العديد من المؤلفين العمل نحو تطوير خلايا جذعية مصطنعة الكوات 25-30. وقد ذكرت هذه المجموعة مؤخرا إنشاء PEGDA-biofunctionalized فبرونيكتين حوف الاصطناعي microfabricated لإيصال الخلايا الظهارية الحوفي 22 و منهجية لتصنيع الأغشية القابلة للتحلل electrospun تحتوي على جيوب microfabricated لدعم الخلايا الظهارية الحوفي 31.
الهدف من هذا العمل هو تطوير تقنية التصنيع الجديدة لتطوير الأجهزة التي تحتوي على مادة بيولوجية microfeatures التي تحاكي إلى حد ما في microenvironments فيها الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم. قمنا بتطوير الأسلوب الذي يجمع بين microstereolithography وelectrospinning التي تسمح للتصنيع الأغشية microstructured القابلة للتحلل التي تظهر العظمى!ر إمكانات التطبيقات تجديد الأنسجة.
من المهم أن نلاحظ أنه على الرغم من تم تطبيق هذه التقنية في هذا العمل إلى تلفيق من حلقات عن تجديد القرنية، والتكنولوجيا يمكن تطبيقها على تصنيع أجهزة لتجديد مجموعة واسعة من الأنسجة الطلائية، مثل الجلد، عن طريق الفم الظهارة المخاطية والأمعاء والجهاز التنفسي، والمثانة. على وجه التحديد، في هذه الدراسة قمنا بتطوير غشاء القابلة للتحلل الاصطناعية التي تعمل بطريقة مماثلة لالغشاء الذي يحيط بالجنين لتقديم الخلايا القرنية. يحتوي هذا الغشاء micropockets حوالي 300 ميكرون (أكبر من الخبايا الحوفي من Pallisades من فوغت (حوالي 150 ميكرون)). أخيرا، قمنا بتأسيس بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تسمح هذه الأغشية ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أكثر من 6 أشهر دون أن تظهر أي علامات على انهيار.
Protocol
بيان الأخلاق: استخدمت عيون المستخدمة في هذه الدراسة وفقا للإعلان على الانفتاح على البحوث الحيوانية:
1. تصنيع PLGA تحلل الأغشية مجهزة Micropockets
- تم إنشاء السقالات عصابة من قبل مجموعة من microstereolithography وتقنيات electrospinning 31. في جوهرها، عملية يمكن تلخيصها في 2 أجزاء (ط) إنشاء قوالب PEGDA بواسطة microstereolithography و (ii) electrospinning على نماذج لاستنساخ هيكل PEGDA الكامنة (في هذه الحالة حلقة microfabricated). يتم وصف هذه الخطوات اثنين بالتفصيل أدناه (الشكلان 1 و 2).
- تصنيع قوالب PEGDA بواسطة microstereolithography (microSL)
- افتعال حلقات باستخدام نموذج 2 طبقة، مع الطبقة الأولى (L1) كونها قاعدة لهيكل والطبقة الثانية (L2) عرض 6 micropockets مع morphologi حدوة حصانوفاق في مجموعة من أحجام 300-500 ميكرون. وصفت تلفيق حلقات PEGDA مؤخرا من قبل هذه المجموعة 22.
- خلق L1 عن طريق رسم دائرة 1.2 سم سوداء باستخدام أي برنامج رسم مناسب.
- خلق L2 في نفس الطريق ولكن تشمل 8 هياكل على شكل حدوة حصان أبيض 0.5 X 0.35 ملم. توزيع الأشكال حدوة حصان صغيرة بيضاء داخل هيكل دائرة سوداء.
- حفظ L1 و L2 في شكل JPEG.
- في قارورة زجاجية داكنة، مزيج البولي ايثيلين جلايكول diacrylate (PEGDA، المنغنيز = 250 جم / مول) مع 1٪ ث / ث Camphorquinone، وهو photoinitiator، على محرك مغناطيسي لمدة 20 دقيقة.
- توسيع شعاع الليزر من microstereolithography انشاء باستخدام الترتيب عدسة منظار وفوق المشروع فإنه على الكمبيوتر للبرمجة جهاز multimirror الرقمي (تمكين الأشعة فوق البنفسجية DMD كاتب كيت). ملاحظة: إن DMD يعكس الصورة (في هذه الحالة حلقة) على مرآة عبر 10 سم البعد البؤري عدسة أنبوب. الصورة ثم إخراج الفضة التميمتيد تعكس إلى قارورة تحتوي على البوليمر photocurable (PEGDA).
- ضبط وتنظيف بعناية البصريات من microstereolithography اقامة.
- وضع 300 ميكرولتر من الخليط PEGDA في بئر من 12 لوحة جيدا زراعة الأنسجة. تأكد من الآبار قبل المغلفة مع تفلون أو غيرها من المواد غير عصا لسهولة إزالة الهيكل بعد علاج.
- التبديل على الليزر الأزرق (MBL-III 473 نانومتر، و 150 ميغاواط) وتحميل L1 في البرمجيات ALP3 الأساسية المثبتة مسبقا على الكمبيوتر. أشرق الطبقة الأولى لمدة 60 ثانية. ملاحظة: ALP3-الأساسي هو واجهة USB الذي يوفر وصلة بين الكمبيوتر والجهاز micromirror الرقمية.
- إضافة إلى البئر 250 ميكرولتر أكثر من PEGDA، وتحميل L2 كما هو موضح أعلاه وأشرق L2 لمدة 60 ثانية.
- إزالة البوليمر غير مخمر وتغسل الحلبة مع الأيزوبروبانول O / N.
- افتعال حلقات باستخدام نموذج 2 طبقة، مع الطبقة الأولى (L1) كونها قاعدة لهيكل والطبقة الثانية (L2) عرض 6 micropockets مع morphologi حدوة حصانوفاق في مجموعة من أحجام 300-500 ميكرون. وصفت تلفيق حلقات PEGDA مؤخرا من قبل هذه المجموعة 22.
- تصنيع الأغشية القابلة للتحلل PLGA باستخدام electrospinning
ملاحظة: استخدمت حلقات PEGDA كقالبق على الذي electrospun PLGA مع PLGA استنساخ تضاريس الأساسي كما هو نسج على مدى هذه القوالب. بعد الغزل، ومقشر ورقة من البوليمر PLGA من جامع. لم الغشاء PLGA النهائي لا يحتوي على حلقات PEGDA التي تركت تعلق على جامع المعدنية.- توزيع حلقات PEGDA على ورقة الألمنيوم مطلي (12 سم × 20 سم) لإنشاء مجمع electrospinning ساكنة.
- إرفاق حلقات باستخدام موصل الشريط الكربون. ملاحظة: هذه الحلقات مرة واحدة شكلت يمكن إعادة استخدامها كقوالب لelectrospinning.
- إعداد حل البوليمر للغزل. حل PLGA (50/50 DL-lactide (52٪ مول): glycolide (48٪ مول)، 44 كجم / مول) في ثنائي كلورو ميثان (DCM) بنسبة 20٪ ث / ث التركيز.
- ضجة O / N قبل الاستخدام.
- مكان الحقن 4 الأنسولين (كليلة العضوية، والإبر قطرها 0.8 سم الداخلية) على ضخ حقنة. ملاحظة: ضمنت أربعة المحاقن electrospinning أسرع من العمل مع حقنة واحدة.
- تحميل 2.5 مل من محلول PLGA في كل حقنة.
- Electrospin باستخدام 30 ميكرولتر / دقيقة معدل التدفق والفولتية تتراوح من 12 إلى 15 كيلو فولت. ترك المسافة بين الإبر وجامع 15 سم.
- Electrospin لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة وأخيرا تقشر بعناية ورقة electrospun PLGA من جامع دعم حلقات PEGDA.
- قطع السقالات electrospun إلى 22 دوائر مم باستخدام حفرة لكمة دائرية وترك هيكل حلقة المتمركزة في المركز.
- تصنيع قوالب PEGDA بواسطة microstereolithography (microSL)
2. التخزين على المدى الطويل PLGA Microfabricated الأغشية
ملاحظة: تم تلفيق حلقات PLGA وتعقيمها قبل شركات خارجية معتمدة. تم المشع في عينات مجموعة جرعة الخارجي من 25-40 كيلو جراى.
- جبل الغشاء في وعاء صغير (طبق بتري البلاستيك) ووضعه داخل كيس الصف الطبية.
- استخدام ورق الترشيح لخلق مرشح أكياس صغيرة للالمجففات. Tس تهيئة الحقائب، وأضعاف ورقة الترشيح (125 مم) وقطع نصف دائرة مما أدى إلى النصف. ثم ختم نهايات معا باستخدام الشريط.
- ملء ثلاثة أكياس ورق الترشيح مع 1 غرام من البرتقال السيليكا والكوبالت (II) كلوريد، والنحاس (II) كبريتات، على التوالي.
- وضع أكياس من ثلاثة المجففة داخل كيس الصف الطبية جنبا إلى جنب مع غشاء electrospun.
- إضافة إلى حقيبة والمتاحة تجاريا ستة بقعة بطاقة مؤشر الرطوبة للكشف عن أي تراكم الرطوبة خلال فترة التخزين.
- استخدام فراغ آلة ختم الحرارة إلى فراغ وختم الحقيبة.
- إرسال الأغشية حلقة إلى شركة خارجية لγ-التشعيع.
- متجر γ-المشع الأغشية PLGA في مجموعة واسعة من درجات الحرارة من -20 درجة مئوية إلى +37 درجة مئوية في بيئة رطبة داخل حاضنة تحتوي على 5٪ CO 2.
- تخزين آخر، دراسة مؤشر الرطوبة للتأكد من أن مستوى الرطوبة تحت 30٪.
- Uحد ذاته المجهر الإلكتروني (SEM) لتقييم سلامة الألياف.
3. عزل الحوفي إإكسبلنتس
تم عزل الأرانب إإكسبلنتس الحوفي من عيون الأرانب (تم الحصول عليها من المزرعة حيث تربى الأرانب للاستهلاك).
- تطهير عيون الأرانب باستخدام محلول مطهر (3٪).
- تنظيف العين من خلال إزالة أي نوع من الأنسجة الزائدة المحيطة القرنية.
- فصل المنطقة الحوفي (التي تم تحديدها كمنطقة دائرية رقيقة بين القرنية (شفافة) والصلبة (أبيض)) عن بقية القرنية باستخدام مجهر تشريح.
- مقطعة إلى شرائح (حوالي 1.5 سنتيمترا) تحت المجهر تشريح.
- تطهير قطاعات الحوفي في 1.5٪ محلول مطهر لمدة 1 دقيقة.
- قطع شرائح الحوفي الى قطع صغيرة (100-500 ميكرون) بشفرة المشرط.
- تخزين قطع صغيرة من الأنسجة في وسائل الإعلام ثقافة (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1)، و 10٪ مصل بقري جنيني، 1 U / مل القلمicillin، 100 ملغ / مل الستربتوميسين، و 2.5 ميكروغرام / مل الأمفوتريسين، 10 نانوغرام / مل من EGF، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى استخدام (لا يزيد عن 60 دقيقة).
4. ثمرة من خلايا من الحوفي إإكسبلنتس
وضعت الأرنب إإكسبلنتس الحوفي على كل من الأغشية والأغشية microfabricated نسج حديثا التي كانت وتخزينها لمدة 6 أشهر في -20 ° C-معبأة فراغ.
- معطف السقالات حلقة مع 15 ميكرولتر من الغراء الليفين (1: 1 خليط من الفيبرينوجين من البلازما البشرية بتركيز 18.75 ملغ / مل والثرومبين من البلازما البشرية عند تركيز 2.5 U / مل) باستخدام مكشطة خلية لتوزيع الليفين بالتساوي.
- وضع إإكسبلنتس الأنسجة مباشرة على micropockets PLGA باستخدام إبرة 25 G ومجهر تشريح.
- إضافة وسائط زراعة الخلايا بلطف شديد لتجنب فصل لل explants.
- تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام (وصفة وسائل الإعلام هو موضح في القسم 3.7) و kالآثار البيئية في الثقافة لمدة 2 أسابيع في في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- إصلاح عينات مع 3.7٪ الفورمالديهايد مخزنة لمدة 10 دقيقة تليها 3 غسلات مع برنامج تلفزيوني.
- مباين بواسطة حضانة في 1 ميكروغرام / مل من 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) أو يوديد propidium (PI) لمدة 10 دقيقة في RT.
- تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني وتخزين العينات مغطاة بورق.
- صورة العينات باستخدام مجهر مضان في موجات من 543 نانومتر و 800 نانومتر (ثنائي الفوتون).
5. إعداد ما يصل الأرنب الجرحى القرنية 3D نماذج
- تنظيف وتطهير عيون الأرانب كما هو موضح أعلاه.
- الجرح عيون الأرانب عن طريق غمر لهم في هيدروكسيد الأمونيوم 0.14٪ لمدة 5 دقائق.
- شطف العينين في برنامج تلفزيوني وكشط بعيدا ظهارة بسكين مبضع الصلبة.
- قطع وعزل زر القرنية صلبوية إزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية.
- وضع القرنيات الجانب الظهارية أسفل علىكوب معقم وملء مع 0.5٪ أجار المحرز في DMEM.
- مجموعة مرة واحدة، ووضع القرنيات الجانب الظهارية تصل، في أطباق بتري الصغيرة وإضافة وسائط الثقافة (وصفة المذكورة أعلاه) حتى منطقة الحوفي. ملاحظة: لا تغطي القرنية بأكملها. الحفاظ على الثقافة الجهاز في واجهة الهواء السائل.
6. عزل الحوفي إإكسبلنتس وإدراج حلقة السقالات في القرنية الأرنب 3D نماذج
- معطف الأغشية حلقة مع 15 ميكرولتر من الغراء الليفين (1: 1 خليط من الفيبرينوجين بتركيز 18.75 ملغ / مل والثرومبين بتركيز 2.5 U / مل). استخدام مكشطة خلية كما هو موضح أعلاه.
- وضع إإكسبلنتس الأنسجة مباشرة على micropockets PLGA باستخدام إبرة 25 G ومجهر تشريح.
- وضع حلقات مع لل explants الأنسجة على القرنيات الجرداء مع إإكسبلنتس مواجهة الظروف وعلى واجهة الهواء السائل. (هذه الشروط وقد وصفت سابقا 22).
- الحفاظ على نماذج الثقافة الجهاز ل4 أسابيع في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.
7. تقييم القرنية تجديد وصيانة الخلايا الجذعية
- بعد 4 أسابيع، وإصلاح القرنيات باستخدام 3.7٪ الفورمالديهايد.
- معالجة القرنيات عن الأنسجة التقليدية لإنتاج 6 ميكرون أقسام البارافين.
- وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E).
- للمناعية، dewax المقاطع في الزيلين (المتوسطة 3min) وترطيب في الإيثانول بنسبة 100٪ (1 دقيقة)، 70٪ من الإيثانول (1 دقيقة)، والماء المقطر (2 دقيقة).
- ترسيم أقسام باستخدام قلم داكو لتحديد مناطق صغيرة وتجنب الاستخدام المفرط للأجسام المضادة.
- علاج المناطق المحددة مع 0.05٪ التربسين (100 ميكرولتر) لمدة 20 دقيقة (37 درجة مئوية).
- يغسل جيدا مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر من المصل 10٪ الماعز (حجب) لمدة 1 ساعة.
- احتضان العينات مع 100 ميكرولتر من الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة cytokeraالقصدير 3 (CK3) و 100 ميكرولتر من P63 في 1٪ الماعز المصل O / N في 4 درجات مئوية.
- يغسل مع برنامج تلفزيوني وعلاج مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز الثانوي المضادة للماوس (1: 1 في 1،000٪ مصل الماعز) لمدة 1 ساعة عند RT.
- إضافة 100 ميكرولتر من FITC-streptavidin (1: 100 في 1٪ مصل الماعز) لمدة 30 دقيقة في RT.
- معالجة العينات مع دابي كما هو موضح أعلاه.
- صورة العينات باستخدام مجهر مضان في موجات من 800 نانومتر (ثنائي الفوتون) و 488 نانومتر.
Representative Results
تم تصنيع Electrospun microfabricated حلقات باستخدام مزيج من microstereolithography وelectrospinning (الشكلان 1 و 2). ملفقة حلقات PEGDA من أحجام مختلفة باستخدام microstereolithography (الشكل 3)؛ هذه التقنية تسمح للتصنيع الهياكل في ترتيب سم وإدراج المتزامن لmicrofeatures. في هذه الحالة، وخواتم من أقطار تتراوح 1،2-1،6 سم تحتوي على micropockets من 350-500 ميكرون ملفقة (الشكل 4).
من حيث إنتاج والتعقيم والتعبئة والتغليف من المواد للاستخدام السريري في المستقبل تبين أن التعبئة في أكياس فراغ الصف الطبية تحسن كبير في القدرة على تحقيق التخزين على المدى الطويل من الأغشية PLGA (الشكل 5)؛ استخدام حقيبة الصف الطبية (PET / احباط / LDPE) مع سمك 0.12 مم سمح لنا لتحقيق حياة أطول الرف. وكان التحقيق هذا عن طريق إرسال membrتم تخزينها أنيس إلى المتعاونين لدينا في الهند والأغشية لمدة أشهر في -20 درجة مئوية، في RT وعند 37 درجة مئوية في ظروف رطبة عمدا (حاضنة الرطبة). الشكل 5 يظهر أن استخدام الظروف استفزازية عمدا من التخزين في 37 درجة مئوية تحت ظروف رطبة، كانت الأغشية مستقرة فقط لحوالي 1 شهر تحت ظروف غير فراغ معبأة، ولكن حققت تخزين 3 أشهر تحت فراغ معبأة الشروط (الشكل 5 والجدول 1).
يوضح الجدول 1 التحسن في ظروف التخزين الذي يمكن تحقيقه حتى في ظل ظروف المحددة لأن تفضي إلى امتصاص الماء والألياف تورم إذا كان أحد يدفع الانتباه إلى اختيار حقيبة المستخدمة.
حلقات دعمت ثمرة خلية من إإكسبلنتس الحوفي في ظروف مختلفة (ط) حلقات الطازجة و (ب) حلقات تخزينها لمدة 6 أشهر (الشكل 6). وقد تحقق نقل الخلية بعد 4 أسابيع عند رر التفوق الأغشية PLGA على نماذج 3D الجرحى. نمت خلايا الخروج من إإكسبلنتس الأنسجة وضعت على الأغشية خلق ظهارة جديدة على القرنيات الجرداء سابقا (الشكل 7). واستمرت الإيجابية (القرنيات دون أي علاج) والضوابط السلبية (القرنيات الجرحى) أيضا في الثقافة لنفس الفترات الزمنية. وأكدت الضوابط السلبية عدم وجود تشكيل ظهارة جديدة في غياب أي خلايا المضافة. أظهرت أن خلايا مناعية نابتا من لل explants كانت الخلايا الظهارية القرنية لأنها كانت إيجابية للالقرنية التمايز علامة CK3 (الشكل 7E).
ضبط الشكل 1. تخطيطي لmicrostereolithography تصل لإنشاء حلقات PEGDA.
her.within الصفحات = "دائما"> 
الشكل 2. تخطيطي لعملية electrospinning باستخدام حلقات PEGDA microfabricated بمثابة القوالب.
الرقم 3. (A) يظهر مثال على (ورقة الألمنيوم مطلي مع حلقات PEGDA) جامع ثابت للغزل الأغشية PLGA microfabricated. (B) و (E) تظهر الحصير electrospun مختلفة يجري مقشر من جامعي ثابتة. (C) المعارض قوالب PEGDA من مختلف الأحجام تسليط الضوء على براعة استخدام microstereolithography لتصنيع السطح السفلي (D) يظهر PLGA microfabricated المتماثلة./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. SEM صورة من حلقة PEGDA مع microfeature حدوة حصان (A). تضخم عالية SEM صورة لجيب microfabricated (B). المرحلة تباين الصورة من حلقة PLGA مع microfeature حدوة حصان (C). عالية التكبير صورة المرحلة النقيض من جيب microfabricated (D). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الصور الإسفار تظهر ثمرة كرا من إإكسبلنتس الحوفي على الطازجة حلقات PLGA القابلة للتحلل (A، B) وعلى حلقات بعد 6 أشهر التخزين في -20° C (C، D). الصور (A) و (B) تتوافق مع الخلايا ملطخة دابي (الأزرق) ويوديد propidium (الحمراء) على التوالي. صورة ب هي وجهة نظر متعامد من متحد البؤر Z-كومة من ازدراع ضعت على جيب microfabricated. الصور (C) و (D) تظهر تلطيخ إيجابي لP63 (الخضراء). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. (A) يظهر أرنب الجرحى نموذج القرنية مع حلقة سقالة والأنسجة إإكسبلنتس تقع على منصة الاعدام الذي كان سابقا المغلفة مع الغراء الليفين (B) و (C) والضوابط الإيجابية والسلبية؛ السيطرة الإيجابية هي حاخام جديدة ر القرنية والسيطرة السلبية على القرنية حيث تمت إزالة الظهارة عمدا (كانت سيطرة سلبية أيضا تربيتها لمدة 4 أسابيع) (D) هي H & E صورة الأنسجة المهندسة القرنية بعد 4 أسابيع في الثقافة. يوضح الشكل ظهارة متعددة الطبقات الجديدة التي شكلتها خلايا الخروج من إإكسبلنتس وضعت على المنافذ (E) هو صورة مناعية تظهر ثمرة خلية من ازدراع الحوفي؛ هي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق) والخلايا يظهر تلطيخ إيجابي لcytokeratin 3، علامة التمايز القرنية (الخضراء). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| PLGA (50/50) | س؛ "> سلامة الألياف لأغشية المخزنة عند 37 درجة مئوية رطبة|||||||
| اليوم 0 | 1 شهر | شهر 2 | شهر 3 | شهر 4 | شهر 5 | شهر 6 | |
| غير فراغ معبأة | + + + | - | - | - | - | - | - |
| فراغ فضاء (حقيبة A) (PE، PA المركب) السماكة: 0.14 ملم | + + + | + | - | 64px؛ "> -- | - | - | |
| فراغ فضاء (حقيبة B) (PET / احباط / LDPE) السماكة: 0.75 مم | + + + | + + + | + + + | + | - | - | - |
الجدول 1. تأثير الفراغ وتخزين أكياس مختلفة على سلامة PLGA (50/50) الأغشية فحص (44 كجم / مول) أكثر من 6 أشهر من التخزين. وسجل سلامة الأغشية والألياف سليمة بالكامل (+ + +)، وبعض الألياف تورم (+ +)، دمج الألياف (+) أو أي ألياف سليمة (-).
Discussion
توضح هذه الدراسة (أ) تقنية لتصنيع الأغشية electrospun microfeatures تحتوي داخلها و (ب) كيفية تحضير هذه الأغشية للاستخدام السريري بواسطة التعبئة فراغ، وأشعة جاما ثم التخزين قبل استخدامها. في هذا التطبيق معينة قمنا بتطوير أغشية PLGA تحتوي micropockets التي تحاكي الميزات المادية للالحوفي محاريب الخلايا الجذعية. أهداف هذه الدراسة هي (ط) لوصف طرق لتزويد القراء بالمعرفة اللازمة لتصميم وتصنيع السقالات التي تحتوي على microfeatures للبحث في مساهمة محاريب الخلايا الجذعية لتجديد أنسجة و (ii) لتزويد القارئ بفهم أفضل كيفية تخزين السقالات electrospun لفترات طويلة من الزمن.
من حيث التطبيق السريري، تخزين الأغشية الدائري هو من أهمية قصوى. في هذا العمل، تم دراسة تدهور حلقة على مدى فترة 6 أشهر. تدهوروالدافع الأغشية قبل التحلل ذلك ببساطة عن طريق الحفاظ على الأغشية وتوقف المجانية الرطوبة العملية. بلاكوود آخرون ذكرت أن من خلال تغيير نسبة لجيش التحرير الشعبى الصينى PGA، وتدهور الغشاء يغير 32. وأظهرت هذه الدراسة أيضا أن زيادة كمية PGA، فإن معدل تدهور الأغشية electrospun زيادة في الجسم الحي 22. هنا وقد تبين أنه مع فراغ التعبئة الأغشية مع بعض المجففة واضاءة عليها وتخزينها لهم في درجات حرارة منخفضة لمدة 6 أشهر، ليس هناك تغيير في نزاهة الألياف وتدهورها. في الوقت الحاضر، 6 أشهر هي بقدر ما درسنا مع هذه الأغشية تحتوي على micropockets لكن تخزين البيانات لتم الإبلاغ 1 سنة على الأغشية electrospun العادي في -20 ° C 22 و لدينا الآن بيانات غير منشورة لتخزينها في -20 ° C لمدة 2 سنة من دون أي علامات التدهور. وبالتالي لتخزين على المدى الطويل وسيكون موضع أوصى لتخزينها في -20 الجاف6؛ C ولكن من الممكن تخزينها في RT حتى في الهند لمدة 6 أشهر على الأقل (ربما أكثر من ذلك بكثير). إدراج مؤشر الرطوبة يعطي وسيلة سهلة للتحقق من أن العبوة أبقت الأغشية الجافة في هذه الحالة سيكون لائقا لهذا الغرض.
وقد تبين نقل الخلايا من هذه الحلقات لنماذج 3D القرنية عند وضع إإكسبلنتس الحوفي داخل micropockets. وذكرت هذه المجموعة مؤخرا نقل الخلايا في المختبر على أرنب نموذج القرنية عن طريق وضع إإكسبلنتس على الأغشية PLGA العادي (الأغشية دون الهياكل حلقة) 24. باستخدام السقالات microfabricated نقل خلية الحالي قد اتخذت خطوة أبعد ويمكننا الآن تحديد موقع على وجه التحديد إإكسبلنتس الأنسجة داخل microfeatures. القدرة على وضع إإكسبلنتس مباشرة داخل محاريب أيضا يسمح للجراح لاستخدام الأغشية مباشرة في المسرح الجراحي تجنب الحاجة لغرف الأبحاث لتوسيع أولا الخلايا الجذعية الحوفي. على الرغم من أن هذه القطعة من العوقد تركز ك على تطوير أجهزة لمرض القرنية، ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا التصنيع الدقيق أيضا للأجهزة العديد من التطبيقات الأخرى النامية. والعمل المستقبلي استكشاف تصنيع التركيبات لتجديد الأنسجة الأخرى مثل الجلد والعظام.
في حين تصميم وتصنيع الأولي للPEGDA المجهرية يمكن أن يكون مضيعة للوقت، مرة واحدة ملفقة الهياكل يمكن إعادة استخدامها مرات عديدة دون تدهور. ولذلك، فإن تلفيق لاحقة من الأغشية القابلة للتحلل PLGA microstructured بواسطة electrospinning يمكن أن يؤديها بنفس المعدل لإنتاج العادي ('غير منظم') الأغشية التالية تجميع المجمع. على الرغم من أن في هذا العمل استخدمنا microstereolithography لافتعال قوالب وأساليب أخرى مثل تصنيع 3D الطباعة أو حقن صب يمكن أن تستخدم أيضا. وفقا لذلك، يمكن إجراء القالب الكامنة من البوليمرات أو المعادن الأخرى بدلا من PEGDA. ومثل هذه التقنية متعددة جدا، ويمكن أن تتكيف بسهولة الباحثين طريقة لتتناسب مع احتياجات والمرافق الخاصة بها.
وmicrostereolithography في المنزل انشاء المستخدمة في هذه الدراسة لن تسمح إعداد بنيات مع ميزات تحت 30μm. هذا ليس وجود قيود لتطبيق القرنية وصفها هنا ولكن يمكن أن يكون حاسما في تصميم نماذج أخرى. في هذه الحالة تقنيات أخرى مثل 2 الفوتون البلمرة (2PP) يمكن أن تكون ذات فائدة إلا أن تقنية electrospinning قد لا تسمح للاستنساخ الهياكل على مقياس الفرعي ميكرون (وهذا ما يجري حاليا دراستها من قبل مجموعتنا).
الخطوات الحاسمة في إطار عملية تصنيع هي (ط) تجنب overcuring من القوالب PEGDA التي يمكن التحكم فيها عن طريق ضبط الوقت وكميات photoinitiator. (ب) السيطرة على الأوضاع electrospinning مثل درجة الحرارة والرطوبة. (ج) تخزين مناسب electrospuالأغشية ن حلقة باستخدام فراغ التعبئة والمجففات.
وباختصار، من خلال وضع إإكسبلنتس الأنسجة الحوفي داخل microfeatures الغشاء أظهرنا ثمرة خلية من إإكسبلنتس على المناطق المتخصصة، ونقل الخلايا إلى أرنب جرح القرنية وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري لاحقة من القرنية. كما تم درس تدهور الأغشية المخزنة في درجات حرارة مختلفة، ولقد تم تطوير بروتوكول التعبئة والتغليف والتي تتيح تخزين على المدى الطويل من الأغشية، وهذا الأخير هو أساسي في تطوير أغشية للاستخدام السريري.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
