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Bioengineering

Microstereolithography और Electrospinning का संयोजन कॉर्नियल उत्थान के लिए niches के साथ लैस झिल्ली उत्पादन करने के लिए

Published: September 12, 2014 doi: 10.3791/51826

Summary

हम सेल व्यवहार का अध्ययन करने में जो electrospun झिल्ली के भीतर micropockets के निर्माण के लिए एक तकनीक की रिपोर्ट. विशेष रूप से, हम PLGA (पाली (Lactide सह Glycolide)) microfeatures से लैस कॉर्निया biomaterial उपकरणों के उत्पादन के लिए microstereolithography और electrospinning का एक संयोजन का वर्णन.

Abstract

कॉर्नियल समस्याओं दुनिया भर में उनके जीवन की गुणवत्ता में काफी कम करने के लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं. कॉर्नियल रोग ऐसे Aniridia या स्टीवन जॉनसन सिंड्रोम के रूप में के रूप में भी इस तरह के रासायनिक जल या विकिरण के रूप में बाह्य कारकों से बीमारियों की वजह से हो सकता है. वर्तमान उपचार (मैं) कॉर्निया ग्राफ्ट का उपयोग कर रहे हैं और (द्वितीय) प्रयोगशाला में विस्तार किया है और वाहक (जैसे, एमनियोटिक झिल्ली) पर दिया स्टेम सेल का उपयोग; इन उपचार अपेक्षाकृत सफल रहे हैं, लेकिन दुर्भाग्य से वे 3-5 साल के बाद विफल कर सकते हैं. डिजाइन और विस्तार में स्टेम कोशिकाओं कॉर्निया में रहते हैं जहां शारीरिक वातावरण की नकल करने में सक्षम नई कॉर्निया biomaterial उपकरणों का निर्माण करने की आवश्यकता है. अंगीय स्टेम कोशिकाओं Vogt की Palisades के रूप में जाना विशिष्ट niches में (कॉर्निया और श्वेतपटल के बीच परिपत्र क्षेत्र) किनारी में स्थित हैं. इस काम में हम दो अत्याधुनिक विनिर्माण तकनीक (microstereolithography और electrospinn जोड़ती है जो एक नया मंच तकनीक विकसित की हैएक निश्चित सीमा किनारी को नकल कि कॉर्निया झिल्ली के निर्माण के लिए) आईएनजी. हमारे झिल्ली Vogt की Palisades आंख में कर के रूप में संरक्षण के साथ कोशिकाओं उपलब्ध कराने के उद्देश्य जो कृत्रिम micropockets होते हैं.

Introduction

कॉर्निया, आंख की avascular केंद्रीय सबसे बाहरी ऊतक, दृष्टि 1 में शामिल सबसे महत्वपूर्ण ऊतकों में से एक है. कॉर्निया के समारोह का कहना है कि कोशिकाओं के कई प्रकार हैं. कॉर्निया के ऊपर सबसे बाहरी परत मोटाई 2 में लगभग 5-7 परतों हो सकता है जो उपकला कोशिकाओं के शामिल हैं. इस परत कॉर्निया 3 में बैक्टीरिया आक्रमण से बचाता है और ऑक्सीजन 4 के प्रवेश की अनुमति देता है. यह बताया गया है कि किनारी 5,6 के रूप में जाना जाता है कॉर्निया के परिधीय क्षेत्र में (120-150 माइक्रोन के आकार के साथ) आलों या तहखाने में कॉर्निया उपकला झूठ की स्टेम कोशिकाओं. स्टेम कोशिकाओं के विभाजन के रूप में, यह भी क्षणिक amplifying कोशिकाओं के रूप में जाना जाता बेटी कोशिकाओं niches के बाहर यात्रा करते हैं और के रूप में विभाजन कोशिकाओं centripetally अंदर की ओर ले जाते हैं और ऊपर की तरफ केंद्रीय कॉर्निया क्षेत्र 7,8 पर टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप जारी है. इन कोशिकाओं को नियमित नेत्र ई की झपकी के साथ भाग नष्ट कर रहे हैं9 के नीचे नए कोशिकाओं xposing.

उपकला स्टेम कोशिकाओं का स्थान होने के अलावा, किनारी भी कॉर्निया क्षेत्र 10 से दूर vascularized कंजाक्तिवा रखने में एक भूमिका निभाता है. किनारी को नुकसान थर्मल / रासायनिक जल, विकिरण और भी आनुवंशिक रोगों 10 की वजह से हो सकता है. जब ऐसा होता है, किनारी बाधा, नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं कॉर्निया पर स्थानांतरित करने की अनुमति क्षेत्र vascularizing, कुछ मामलों में दर्द और अंधापन के कारण टूट गया है. हालत अंगीय स्टेम सेल की कमी (LSCD) 10 के रूप में जाना जाता है.

विभिन्न प्राकृतिक substrates कॉर्निया उत्थान में सहायता के लिए संभव स्टेम सेल वाहक के रूप में सूचित किया गया है. उदाहरण के लिए, कोलेजन आधारित झिल्ली द्रविड़ एट अल. 11 और राम और सहकर्मियों 12 से 112 मरीजों के साथ एक अध्ययन में आतंच के उपयोग की सूचना दी इस्तेमाल किया गया. उपचार की वर्तमान हालांकि सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधिइसकी सतह 13,14 पर एक ऊतक बैंक और संस्कृति अंगीय उपकला कोशिकाओं से मानव एमनियोटिक झिल्ली का प्रयोग होता है. एक monolayer का गठन किया है एक बार, एमनियोटिक झिल्ली शल्य चिकित्सा से पहले इस सेल प्रत्यारोपण 14 करने के लिए इसे से हटा सभी नेत्रश्लेष्मला कोशिकाओं और निशान ऊतक है जो क्षतिग्रस्त कॉर्निया पर अप सेल साइड चिपके है. एमनियोटिक झिल्ली उपकला 15,16 पुनर्जीवित करने के लिए denuded क्षेत्र से जुड़ी उपकला कोशिकाओं छोड़ने के महीने के लिए सप्ताह के भीतर degrades. इस तकनीक हालांकि चिकित्सकीय इसके व्यापक तेज प्रतिबंधित जो कुछ व्यावहारिक मुद्दों पर अभी भी कर रहे हैं दृष्टि बहाल करने में सफल रहा है. एमनियोटिक झिल्ली मानव ऊतक है कि यह रोगियों पर सेल प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले अच्छा ऊतक बैंकिंग प्रक्रियाओं का उपयोग स्क्रीनिंग से गुजरना करने की जरूरत है. इस स्क्रीनिंग केवल रोगों के संचरण के जोखिम को कम करती है, लेकिन यह पूरी तरह से 17 को खत्म नहीं कर सकते हैं. इस के अलावा पी में परिवर्तनशीलता की रिपोर्ट किया गया हैकारण इंटर दाता भिन्नता 18,19 और विभिन्न प्रसंस्करण विधियों 19,20 को एमनियोटिक झिल्ली की erformance. रोग संचरण का छोटा सा जोखिम के बगल शल्य चिकित्सा केन्द्रों सभी के लिए उपलब्ध नहीं अच्छी तरह से चलाने के ऊतक बैंकों, के लिए उपयोग करने के लिए आवश्यकता होती है.

एमनियोटिक झिल्ली अपेक्षाकृत सफल है, कार्निया की बीमारी के इलाज के लिए नई सिंथेटिक biodegradable सेल वाहक विकल्प के विकास के लिए एक की जरूरत है. सिंथेटिक वाहक प्रक्रियाओं बैंकिंग के रूप में अच्छी तरह से रोग संचरण और अंतर दाता परिवर्तनशीलता के छोटे जोखिम को नष्ट करने के लिए आवश्यकता को दूर करेगा. इस अर्थ में, इस तरह के पॉलीथीन ग्लाइकोल 21,22 और PLGA 23,24 के रूप में सामग्री का अध्ययन किया गया है.

मानव एमनियोटिक झिल्ली को एक सिंथेटिक विकल्प के विकास में उम्मीद है कि संवर्धित कोशिकाओं के अस्तित्व में मदद करने के लिए इसे में वांछित सुविधाओं डिजाइन करने के लिए वहाँ भी संभावना है. इंकसेल व्यवहार के विशिष्ट नियंत्रण के लिए biomaterial उपकरणों के भीतर microfeatures के lusion हित के एक उभरते क्षेत्र है. कृत्रिम स्टेम कोशिकाओं के विकास को 25-30 niches के प्रति कई लेखकों काम की सूचना दी है. इस समूह ने हाल ही में अंगीय उपकला कोशिकाओं 22 के वितरण और अंगीय उपकला कोशिकाओं 31 के समर्थन के लिए microfabricated जेब युक्त electrospun biodegradable झिल्ली के निर्माण के लिए एक पद्धति के लिए एक microfabricated PEGDA फ़ाइब्रोनेक्टिन-biofunctionalized कृत्रिम किनारी की रचना की सूचना दी है.

इस काम का उद्देश्य एक हद तक कोशिकाओं को शरीर में रहते स्टेम जिसमें microenvironments नकल जो microfeatures युक्त biomaterial उपकरणों के विकास के लिए एक नई विनिर्माण प्रौद्योगिकी विकसित करने का है. हम grea बताते हैं कि biodegradable microstructured झिल्ली के निर्माण की अनुमति देता है कि microstereolithography और electrospinning को जोड़ती है जो एक तकनीक विकसित की हैऊतक उत्थान अनुप्रयोगों के लिए टी संभावित.

यह इस काम में इस तकनीक का कार्निया उत्थान के लिए छल्ले का निर्माण करने के लिए लागू किया गया है, हालांकि, प्रौद्योगिकी उपकला ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला के उत्थान, जैसे, त्वचा, मौखिक के लिए उपकरणों का निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि सूचना के लिए महत्वपूर्ण है म्यूकोसा, आंत, श्वसन, और मूत्राशय epithelia. विशेष रूप से, इस अध्ययन में हम कॉर्निया कोशिकाओं देने के लिए एमनियोटिक झिल्ली को एक समान तरीके से काम करता है जो एक कृत्रिम biodegradable झिल्ली का विकास किया है. यह झिल्ली के आसपास 300 मीटर की micropockets शामिल ((बड़ा Vogt की Pallisades की अंगीय तहखाने से लगभग 150 मीटर)). अंत में, हम इन झिल्ली टूटने के कोई लक्षण दिखाने के बिना अधिक से अधिक 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा होने की अनुमति देता है जो एक पैकेजिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की है.

Protocol

आचार विवरण: इस अध्ययन में इस्तेमाल आँखों पशु अनुसंधान पर खुलेपन पर घोषणा के अनुसार इस्तेमाल किया गया:

Micropockets से लैस PLGA Biodegradable झिल्ली की 1 निर्माण

  1. अंगूठी scaffolds microstereolithography और electrospinning तकनीक 31 के संयोजन के द्वारा बनाया गया था. संक्षेप में, प्रक्रिया microstereolithography और (ii) अंतर्निहित PEGDA संरचना के प्रजनन के लिए टेम्पलेट्स पर electrospinning (इस मामले में एक microfabricated अंगूठी) द्वारा PEGDA टेम्पलेट्स के 2 भागों (i) के निर्माण में संक्षेप किया जा सकता है. इन दो चरणों (आंकड़े 1 और 2) नीचे विस्तार में वर्णित हैं.
    1. Microstereolithography द्वारा PEGDA टेम्पलेट्स का निर्माण (microSL)
      1. पहली परत (एल 1) संरचना का आधार है और घोड़े की नाल Morphologi साथ 6 micropockets पेश दूसरी परत (एल 2) होने के साथ एक 2 परत मॉडल का उपयोग छल्ले बनाना300-500 माइक्रोन से आकार के एक रेंज में तों. PEGDA छल्ले का निर्माण हाल ही में इस समूह में 22 से वर्णित किया गया था.
        1. किसी भी उपयुक्त ड्राइंग प्रोग्राम का उपयोग कर एक 1.2 सेमी काले सर्किल बनाकर एल 1 बनाएँ.
        2. उसी तरह से L2 बनाएँ लेकिन 8 सफेद 0.5 x 0.35 मिमी घोड़े की नाल के आकार का संरचनाओं शामिल हैं. काले सर्किल के ढांचे के भीतर छोटे सफेद घोड़े की नाल आकार बांटो.
        3. जेपीईजी प्रारूप में सहेजें एल 1 और एल 2.
      2. एक काले कांच की शीशी में, 20 मिनट के लिए एक चुंबकीय दोषी पर, Camphorquinone, एक photoinitiator डब्ल्यू / डब्ल्यू 1% के साथ पॉलीथीन ग्लाइकोल diacrylate (PEGDA, करोड़ = 250 छ / mol) मिश्रण.
      3. सेट अप एक दूरबीन लेंस व्यवस्था का उपयोग microstereolithography की लेजर बीम का विस्तार और फिर एक कंप्यूटर प्रोग्राम डिजिटल multimirror डिवाइस (यूवी सक्षम DMD स्टार्टर किट) पर यह परियोजना. नोट: DMD एक 10 सेमी फोकल लंबाई ट्यूब लेंस के माध्यम से एक दर्पण पर (इस मामले में एक अंगूठी) छवि को दर्शाता है. छवि तो चांदी सीओए द्वारा निर्देशित हैटेड photocurable बहुलक (PEGDA) युक्त एक शीशी में दर्पण.
      4. समायोजित करें और ध्यान से सेट अप microstereolithography की प्रकाशिकी साफ.
      5. एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के एक कुएं में PEGDA मिश्रण के 300 μl रखो. कुओं के इलाज के बाद संरचना की आसान हटाने के लिए Teflon या अन्य गैर छड़ी सामग्री के साथ पूर्व में लिपटे रहे हैं सुनिश्चित करें.
      6. नीले लेजर पर स्विच (MBL-III 473 एनएम, 150 मेगावाट) ALP3 बुनियादी सॉफ्टवेयर में और एल 1 अपलोड पहले पीसी पर स्थापित. 60 सेकंड के लिए पहली परत चमकाना. नोट: ALP3 बुनियादी पीसी और डिजिटल micromirror डिवाइस के बीच लिंक प्रदान करता है कि एक यूएसबी इंटरफ़ेस है.
      7. , PEGDA के 250 μl अधिक अच्छी तरह से जोड़ें ऊपर वर्णित और 60 सेकंड के लिए L2 चमकाना रूप L2 अपलोड करें.
      8. Uncured बहुलक निकालें और isopropanol हे / एन के साथ अंगूठी धोने.
    2. Biodegradable PLGA का निर्माण electrospinning का उपयोग झिल्ली
      नोट: PEGDA छल्ले टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गयाएस जिस पर PLGA यह इन टेम्पलेट्स के ऊपर घूमती है के रूप में PLGA अंतर्निहित स्थलाकृति reproducing साथ electrospun था. कताई के बाद, PLGA बहुलक की चादर कलेक्टर से खुली था. अंतिम PLGA झिल्ली धातु कलेक्टर से जुड़ी छोड़ दिया गया जो PEGDA अंगूठियां शामिल नहीं किया था.
      1. एक स्थिर electrospinning कलेक्टर बनाने के लिए एक electroplated एल्यूमीनियम शीट पर PEGDA छल्ले (12 सेमी x 20 सेमी) बांटो.
      2. प्रवाहकीय कार्बन टेप का उपयोग छल्ले देते हैं. नोट: एक बार electrospinning के लिए टेम्पलेट्स के रूप में फिर से इस्तेमाल किया जा सकता का गठन ये छल्ले.
      3. कताई के लिए बहुलक समाधान तैयार है. एकाग्रता डब्ल्यू / डब्ल्यू 20% पर dichloromethane (डीसीएम) में: PLGA (Glycolide (48 मोल%), 44 किलो / मोल 50/50 डीएल Lactide (52 मोल%)) भंग.
      4. हिलाओ हे / एन उपयोग करने से पहले.
      5. एक सिरिंज पंप पर जगह 4 इंसुलिन सीरिंज (एंडेड, 0.8 सेमी भीतरी व्यास सुई कुंद). नोट: चार सीरिंज एक ही सिरिंज के साथ काम करने की तुलना में अधिक तेजी से electrospinning सुनिश्चित की.
      6. प्रत्येक सिरिंज में PLGA समाधान के 2.5 एमएल लोड.
      7. Electrospin का उपयोग कर एक 30 μl / मिनट प्रवाह दर और 12 से 15 केवी से लेकर voltages. सुइयों और 15 सेमी के कलेक्टर के बीच एक दूरी छोड़ दें.
      8. 1 घंटा और 30 मिनट के लिए Electrospin और अंत में ध्यान से PEGDA छल्ले समर्थन कलेक्टर से PLGA electrospun शीट छील.
      9. एक परिपत्र छेद पंच का उपयोग करने और केंद्र में तैनात अंगूठी संरचना छोड़ने 22 मिमी व्यास हलकों में electrospun scaffolds काटें.

PLGA microfabricated झिल्ली के 2 लंबी अवधि के भंडारण

नोट: PLGA छल्ले गढ़े और मान्यता प्राप्त बाहरी कंपनियों द्वारा निष्फल रहे थे; नमूने 25-40 KGy के एक बाहरी खुराक सीमा पर विकिरणित किया गया.

  1. एक छोटे कंटेनर में झिल्ली (प्लास्टिक पेट्री डिश) माउंट और एक चिकित्सा ग्रेड बैग के अंदर जगह है.
  2. Desiccants के लिए छोटे फिल्टर बैग बनाने के लिए फिल्टर पेपर का प्रयोग करें. टीहे, बैग बनाने फिल्टर पेपर (125 मिमी व्यास) गुना और आधे में जिसके परिणामस्वरूप अर्धवृत्त में कटौती; तो टेप का उपयोग कर एक साथ समाप्त होता सील.
    1. क्रमशः, सिलिका नारंगी, कोबाल्ट (द्वितीय) क्लोराइड, और तांबे (द्वितीय) सल्फेट की 1 ग्राम से तीन फिल्टर पेपर बैग भरें.
    2. Electrospun झिल्ली के साथ साथ चिकित्सा ग्रेड बैग के अंदर desiccant के तीन बैग रखो.
  3. भंडारण की अवधि के दौरान किसी भी नमी संचय का पता लगाने के बैग के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध छह स्थान नमी सूचक कार्ड जोड़ें.
  4. शून्य और बैग सील करने के लिए एक वैक्यूम गर्मी सील मशीन का प्रयोग करें.
  5. Γ-विकिरण के लिए एक बाहरी कंपनी को रिंग झिल्ली भेजें.
  6. स्टोर 5% सीओ 2 से युक्त एक मशीन के भीतर एक नम वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से तापमान की एक विस्तृत श्रृंखला में PLGA झिल्ली γ-विकिरणित.
  7. डाक भंडारण, नमी का स्तर 30% नीचे है कि पुष्टि करने के लिए नमी सूचक की जांच.
  8. यूएसई स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) फाइबर अखंडता का आकलन करने के लिए.

अंगीय explants के 3 अलगाव

खरगोश अंगीय explants (खरगोश की खपत के लिए पैदा कर रहे हैं, जहां एक खेत से प्राप्त) खरगोश आंखों से अलग थे.

  1. एंटीसेप्टिक समाधान (3%) का उपयोग खरगोश आंखों कीटाणुरहित.
  2. कॉर्निया के आसपास के किसी भी अतिरिक्त ऊतक को हटाने से आंखों को साफ करें.
  3. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कॉर्निया के बाकी हिस्सों से (कॉर्निया (पारदर्शी) और श्वेतपटल (सफेद) के बीच एक पतली परिपत्र क्षेत्र के रूप में पहचान) अंगीय क्षेत्र अलग करें.
  4. विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे (1.5 चारों ओर सेमी लंबे) खंडों में काटें.
  5. 1 मिनट के लिए 1.5% एंटीसेप्टिक समाधान में अंगीय क्षेत्रों कीटाणुरहित.
  6. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ छोटे टुकड़ों (100-500 माइक्रोन) में अंगीय क्षेत्रों काटें.
  7. संस्कृति मीडिया में ऊतक के छोटे टुकड़े की दुकान (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 यू / एमएल कलमicillin, 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 माइक्रोग्राम / एमएल Amphotericin, EGF की 10 एनजी / एमएल, और 37 डिग्री सेल्सियस पर इंसुलिन के 5 माइक्रोग्राम / एमएल) और 5% सीओ 2 उपयोग करें जब तक (कोई 60 से अधिक मिनट).

अंगीय explants से कोशिकाओं की 4 परिणाम

खरगोश अंगीय explants निर्वात पैक और -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने के लिए जमा थे जो दोनों हौसले काता microfabricated झिल्ली और झिल्ली पर रखा गया था.

  1. कोट आतंच गोंद के 15 μl के साथ अंगूठी scaffolds: आतंच के वितरण के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग (1 2.5 यू / एमएल के एक एकाग्रता में मानव प्लाज्मा से 18.75 मिलीग्राम / एमएल और थ्रोम्बिन की एकाग्रता में मानव प्लाज्मा से फाइब्रिनोजेन के 1 मिश्रण) समान रूप से.
  2. एक 25 जी सुई और एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग PLGA micropockets पर सीधे ऊतक explants रखें.
  3. Explants detaching से बचने के लिए बहुत धीरे सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें.
    1. हर 3 दिन (मीडिया खंड 3.7 में वर्णित नुस्खा) और कश्मीर मीडिया बदलें37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 2 सप्ताह के लिए संस्कृति में eep और 5% सीओ 2.
  4. पीबीएस के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया 10 मिनट के लिए 3.7% बफर formaldehyde के साथ नमूनों को ठीक करें.
  5. 4 की 1 ग्राम / मिलीलीटर 'में ऊष्मायन द्वारा Counterstain, 6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) या आरटी पर 10 मिनट के लिए propidium आयोडाइड (पीआई).
  6. पीबीएस में 3 बार धोएं और पन्नी के साथ कवर नमूनों की दुकान.
  7. छवि 543 एनएम और 800 एनएम (दो फोटॉन) के तरंग दैर्ध्य में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने.

5 सेटिंग अप खरगोश घायल कॉर्निया 3D मॉडल

  1. स्वच्छ और ऊपर वर्णित के रूप में खरगोश आंखों कीटाणुरहित.
  2. 5 मिनट के लिए 0.14% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड में उन्हें डुबो कर खरगोश आँखें घाव.
  3. पीबीएस में आंखों कुल्ला और एक sclerotome चाकू के साथ उपकला दूर परिमार्जन.
  4. कट और किसी भी शेष ऊतक को हटाने कॉर्निया-scleral बटन को अलग.
  5. पर कॉर्निया नीचे उपकला पक्ष रखेंएक बाँझ कप और DMEM में किए गए 0.5% अगर साथ भरें.
  6. एक बार छोटे पेट्री डिश में, ऊपर corneas उपकला पक्ष रखा और अंगीय क्षेत्र के लिए संस्कृति मीडिया (ऊपर वर्णित नुस्खा) जोड़ने, सेट. नोट: पूरे कॉर्निया को कवर नहीं है; हवा तरल इंटरफेस में अंग संस्कृति रखना.

अंगीय explants और खरगोश कॉर्निया 3 डी मॉडल में रिंग scaffolds के शामिल किए जाने के 6 अलगाव

  1. कोट आतंच गोंद के 15 μl के साथ अंगूठी झिल्ली: ऊपर एक सेल खुरचनी .Use (1 2.5 यू / एमएल के एक एकाग्रता में 18.75 मिलीग्राम / एमएल और थ्रोम्बिन की एकाग्रता में फाइब्रिनोजेन के 1 मिश्रण) के रूप में वर्णित.
  2. एक 25 जी सुई और एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग PLGA micropockets पर सीधे ऊतक explants रखें.
  3. ऊपर का सामना करना पड़ explants साथ और एयर तरल इंटरफ़ेस शर्तों पर denuded कॉर्निया पर ऊतक explants साथ छल्ले रखें. (ये स्थितियां पहले 22 में वर्णित किया गया है).
  4. के लिए अंग संस्कृति मॉडल बनाए रखें37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 4 सप्ताह और 5% सीओ 2 हर 2 दिन मीडिया बदल रहा है.

आकलन कॉर्नियल उत्थान के 7 और सेल रखरखाव स्टेम

  1. 4 हफ्तों के बाद, 3.7% formaldehyde का उपयोग कर कॉर्निया को ठीक.
  2. पारंपरिक ऊतक विज्ञान 6 माइक्रोन आयल वर्गों का उत्पादन करने के लिए कॉर्निया की प्रक्रिया.
  3. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग.
  4. Immunocytochemistry के लिए, XYLENE (3min) में वर्गों dewax और 100% इथेनॉल (1 मिनट), 70% इथेनॉल (1 मिनट), और आसुत जल (2 मिनट) में rehydrate.
  5. छोटे क्षेत्रों का परिसीमन और एंटीबॉडी के अत्यधिक उपयोग से बचने के लिए एक Dako कलम का उपयोग कर वर्गों चित्रित करना.
    1. 20 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए 0.05% trypsin (100 μl) के साथ चित्रित क्षेत्रों का इलाज.
  6. पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें और 1 घंटे के लिए 10% बकरी सीरम (अवरुद्ध) के 100 μl जोड़ें.
  7. माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी cytokera के 100 μl के साथ नमूने सेतेटिन 3 (CK3) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% बकरी सीरम हे / एन में P63 के 100 μl.
  8. पीबीएस के साथ धोएं और biotinylated माध्यमिक विरोधी माउस एंटीबॉडी के 100 μl के साथ इलाज (1: 1000 में 1% में बकरी सीरम) आरटी पर 1 घंटे के लिए.
  9. आरटी पर 30 मिनट के लिए: (100 1 में% बकरी सीरम 1) FITC-streptavidin के 100 μl जोड़ें.
  10. जैसा कि ऊपर वर्णित DAPI के साथ नमूने समझो.
  11. छवि 800 एनएम (दो photon) और 488 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूने.

Representative Results

Electrospun microfabricated छल्ले (आंकड़े 1 और 2) microstereolithography और electrospinning का एक संयोजन का उपयोग कर निर्मित कर रहे थे. विभिन्न आकारों की PEGDA छल्ले microstereolithography (चित्रा 3) का उपयोग कर गढ़े गए थे; इस तकनीक सेमी के आदेश और microfeatures का एक साथ समावेश में निर्माण संरचनाओं की अनुमति देता है. इस मामले में, व्यास के छल्ले 350-500 माइक्रोन के micropockets युक्त 1.2-1.6 सेमी से लेकर (चित्रा 4) गढ़े गए थे.

, उत्पादन स्टरलाइज़ और भविष्य नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए सामग्री की पैकेजिंग के संदर्भ में यह चिकित्सा ग्रेड बैग में है कि वैक्यूम पैकिंग काफी PLGA झिल्ली (चित्रा 5) की लंबी अवधि के भंडारण को प्राप्त करने की क्षमता में सुधार पाया गया था; 0.12 मिमी की मोटाई के साथ एक चिकित्सा ग्रेड बैग (पीईटी / पन्नी / LDPE) का उपयोग एक लंबे समय तक शैल्फ जीवन को प्राप्त करने की अनुमति दी. इस membr भेजकर जांच की गईभारत और झिल्ली में हमारे सहयोगियों के लिए Anes आरटी पर और जानबूझकर नम स्थितियों (एक नम इनक्यूबेटर) में 37 डिग्री सेल्सियस, -20 डिग्री सेल्सियस पर महीने की अवधि के लिए जमा थे. 5 से पता चलता है कि भंडारण की जानबूझकर उत्तेजक स्थितियों में उपयोग कर नम परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस, झिल्ली शर्तों पैक गैर वैक्यूम के अंतर्गत लगभग 1 महीने के लिए ही स्थिर थे, लेकिन निर्वात पैक शर्तों (चित्रा 5 और 1 टेबल) के तहत 3 महीने भंडारण हासिल की.

1 टेबल भी पानी तेज और फाइबर एक प्रयोग किया जाता बैग के विकल्प पर ध्यान देता है अगर सूजन के लिए अनुकूल होने के लिए चयनित शर्तों के तहत प्राप्त किया जा सकता है कि भंडारण की स्थिति में सुधार को दर्शाता है.

छल्ले विभिन्न स्थितियों (मैं) ताजा बना और (ii) 6 महीने (चित्रा 6) के लिए जमा के छल्ले के छल्ले में अंगीय explants से सेल परिणाम का समर्थन किया. सेल स्थानांतरण 4 हफ्तों के बाद हासिल की थी जब पी एल3 डी घायल मॉडल पर PLGA झिल्ली acing. प्रकोष्ठों पहले denuded कॉर्निया पर एक नया उपकला (चित्रा 7) बनाने की झिल्ली पर रखा गया ऊतक explants से बाहर हो गया. और नकारात्मक नियंत्रण (घायल कॉर्निया) सकारात्मक (किसी भी उपचार के बिना कॉर्निया) भी समय की इसी अवधि के लिए संस्कृति में बनाए रखा गया. नकारात्मक नियंत्रण किसी भी जोड़ा कोशिकाओं के अभाव में एक नया उपकला के गठन की कमी की पुष्टि की. Immunocytochemistry वे कॉर्निया भेदभाव मार्कर CK3 (चित्रा 7E) के लिए सकारात्मक थे explants से बाहर बढ़ कोशिकाओं कॉर्निया उपकला कोशिकाओं थे कि प्रदर्शन किया.

चित्रा 1
Microstereolithography चित्रा 1 योजनाबद्ध PEGDA छल्ले के निर्माण के लिए निर्धारित किया है.

her.within पृष्ठ "हमेशा" => चित्रा 2
एक टेम्पलेट के रूप में PEGDA microfabricated छल्ले का उपयोग प्रक्रिया electrospinning चित्रा 2 योजनाबद्ध.

चित्रा 3
चित्रा 3 (ए). Microfabricated PLGA झिल्ली की कताई के लिए एक स्थिर कलेक्टर (PEGDA छल्ले के साथ electroplated एल्यूमीनियम शीट) का एक उदाहरण दिखाता है (बी) और (ई) अलग electrospun मैट स्थिर कलेक्टरों से खुली किया जा रहा है दिखाते हैं. (सी) से पता चलता है अंतर्निहित सतह के निर्माण के लिए microstereolithography के उपयोग की बहुमुखी प्रतिभा को उजागर करने पर विभिन्न आकार के PEGDA टेम्पलेट्स. (डी) एक PLGA microfabricated प्रतिकृति से पता चलता है./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
एक घोड़े की नाल microfeature (ए) के साथ एक PEGDA अंगूठी की चित्रा 4 SEM छवि; एक microfabricated जेब (बी) की उच्च वृद्धि SEM छवि. एक घोड़े की नाल microfeature (सी) के साथ एक PLGA अंगूठी के चरण विपरीत छवि; एक microfabricated जेब (डी) की उच्च वृद्धि चरण विपरीत छवि. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5वैक्यूम और गैर वैक्यूम के भंडारण पर तापमान और समय की आर /> चित्रा 5 प्रभाव (44 किग्रा / मोल) 6 महीने से अधिक सूक्ष्म गढ़े छल्ले के साथ. झिल्ली अखंडता पूरी तरह से बरकरार फाइबर के रूप में बना था PLGA (50/50) झिल्ली पैक (+++), कुछ फाइबर फाइबर (+) के विलय, (++) सूजन या कोई बरकरार फाइबर (-). SEM छवियों और तीन desiccants (सिलिका नारंगी, कोबाल्ट (द्वितीय) क्लोराइड, और तांबे (द्वितीय) सल्फेट) फाइबर अखंडता या नमी में कोई बदलाव नहीं दिखा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा ताजा बना biodegradable PLGA छल्ले पर अंगीय explants से LEC का परिणाम दिखा 6 प्रतिदीप्ति छवियों (ए, बी) और -20 में 6 महीने के भंडारण के बाद छल्ले परडिग्री सेल्सियस (सी, डी). छवियाँ (ए) और (बी) DAPI (नीला) और propidium आयोडाइड (लाल) के साथ दाग कोशिकाओं के अनुरूप हैं. छवि बी एक microfabricated जेब पर रखा एक explant के एक confocal z ढेर से एक orthogonal दृश्य है. छवियाँ (सी) और (डी) P63 (हरा) के लिए सकारात्मक धुंधला दिखा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 7
. चित्रा 7 (ए) पहले से आतंच गोंद के साथ लेपित किया गया था जो पाड़ पर स्थित एक अंगूठी पाड़ और ऊतक explants के साथ एक खरगोश घायल कॉर्निया मॉडल से पता चलता है (बी) और (सी) सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं; सकारात्मक नियंत्रण एक ताजा रब्बी है . टी कॉर्निया और नकारात्मक नियंत्रण उपकला जानबूझ (नकारात्मक नियंत्रण 4 हफ्तों के लिए सभ्य भी था) हटा दिया गया था जहां एक कॉर्निया (डी) संस्कृति में 4 हफ्तों के बाद एक ऊतक इंजीनियर कॉर्निया के एच ई छवि है; आंकड़ा आलों पर रखा explants से बाहर आ कोशिकाओं द्वारा गठित नई बहुस्तरीय उपकला से पता चलता है (ई) एक अंगीय explant से सेल परिणाम दिखा एक immunocytochemistry छवि है.; नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग और कोशिकाओं cytokeratin 3 के लिए सकारात्मक धुंधला से पता चलता कर रहे हैं, एक कॉर्निया भेदभाव मार्कर (हरा). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक्स, 37 डिग्री सेल्सियस नम पर संग्रहीत झिल्ली के लिए "> फाइबर अखंडता 64px; "> -
PLGA (50/50)
0 दिन महीने 1 माह 2 महीना 3 4 माह 5 महीने महीना 6
पैक्ड गैर वैक्यूम +++ - - - - - -
निर्वात (बैग एक) (पीई, पीए कम्पोजिट) ​​मोटाई: 0.14 मिमी +++ + - - - -
निर्वात (थैला बी) (पीईटी / पन्नी / LDPE) मोटाई: 0.75 मिमी +++ +++ +++ + - - -

PLGA की अखंडता पर वैक्यूम और विभिन्न भंडारण बैग की तालिका 1 प्रभाव (50/50) झिल्ली (44 किग्रा / मोल) भंडारण के 6 महीनों में जांच की. झिल्ली अखंडता पूरी तरह से बरकरार फाइबर (+++), कुछ फाइबर सूजन के रूप में बना था (++), फाइबर विलय (+) या कोई बरकरार फाइबर (-).

Discussion

इस अध्ययन में उनके भीतर microfeatures युक्त electrospun झिल्ली का निर्माण और कैसे वैक्यूम पैकिंग, गामा विकिरण और फिर भंडारण से पहले का उपयोग करने से नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए इस तरह की झिल्ली तैयार करने के लिए (ख) के लिए (एक) एक तकनीक का वर्णन है. इस विशेष आवेदन में हम अंगीय स्टेम सेल आलों की शारीरिक विशेषताओं की नकल जो micropockets युक्त PLGA झिल्ली का विकास किया है. इस अध्ययन का उद्देश्य (मैं) ऊतक उत्थान और (ii) एक बेहतर समझ के साथ पाठक प्रदान करने के लिए स्टेम सेल niches के योगदान में अनुसंधान के लिए microfeatures युक्त scaffolds के लिए डिजाइन और निर्माण के लिए आवश्यक ज्ञान के साथ पाठकों को उपलब्ध कराने के लिए विधियों का वर्णन करने के लिए कर रहे हैं के समय की लंबी अवधि के लिए electrospun scaffolds स्टोर करने के लिए कैसे.

नैदानिक ​​आवेदन के संदर्भ में, अंगूठी झिल्ली का भंडारण सर्वोपरि महत्व का है. इस काम में, अंगूठी की गिरावट 6 महीने की अवधि में अध्ययन किया गया. की गिरावटझिल्ली बस नमी मुक्त प्रक्रिया रोक दी है झिल्ली रखकर इतना हाइड्रोलिसिस से प्रेरित है. ब्लैकवुड एट अल. पीजीए को पीएलए का अनुपात अलग से, झिल्ली की गिरावट 32 कि परिवर्तन की सूचना दी. इस अध्ययन में यह भी पीजीए की राशि बढ़ाने के द्वारा, electrospun झिल्ली की गिरावट की दर विवो 22 में वृद्धि दर्ज की गई. यहाँ यह निर्वात कुछ desiccant के साथ झिल्ली पैकिंग और उन्हें irradiating और 6 महीने के लिए कम तापमान पर उन्हें भंडारण के साथ, फाइबर अखंडता और गिरावट में कोई बदलाव नहीं आया है कि दिखाया गया है. वर्तमान में, 6 महीने के रूप में अब तक हम 1 वर्ष -20 डिग्री सेल्सियस 22 पर सादे electrospun झिल्ली पर सूचना दी और अब हम -20 डिग्री सेल्सियस पर उनके भंडारण के लिए अप्रकाशित जानकारी है किया गया है के लिए इन झिल्लियों micropockets लेकिन भंडारण डेटा को रोकने के साथ अध्ययन किया है के रूप में है गिरावट के कोई लक्षण के बिना 2 साल के लिए. इस प्रकार लंबी अवधि के भंडारण के लिए यह -20 पर उन्हें सूखी स्टोर करने के लिए सिफारिश की जाएगी6, सी, लेकिन यह (संभवतः बहुत लंबे समय तक) में कम से कम 6 महीने के लिए भी भारत में आरटी पर उन्हें स्टोर करने के लिए संभव है. एक नमी सूचक का समावेश पैकेजिंग वे प्रयोजन के लिए फिट हो जाएगा, जो मामले में सूखे की झिल्ली को रखा गया है कि जाँच के लिए एक आसान साधन देता है.

Micropockets भीतर अंगीय explants रखकर जब 3 डी कॉर्निया मॉडल को इन छल्लों से कोशिकाओं का स्थानांतरण दिखाया गया था. इस समूह ने हाल ही में सादे PLGA झिल्ली (अंगूठी संरचनाओं के बिना झिल्ली) 24 पर explants रखकर इन विट्रो खरगोश कॉर्निया मॉडल पर कोशिकाओं के हस्तांतरण की सूचना दी. वर्तमान microfabricated scaffolds सेल हस्तांतरण का उपयोग हम अब विशेष रूप से microfeatures भीतर ऊतक explants ढूँढ सकते हैं के रूप में एक कदम और आगे ले जाया गया है. आलों के भीतर सीधे explants जगह करने की क्षमता भी सर्जन पहली अंगीय स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक cleanroom की जरूरत से बचने शल्य थिएटर में सीधे झिल्ली का उपयोग करने की अनुमति देता है. Wor के इस टुकड़े हालांकिकश्मीर कार्निया रोग के लिए उपकरणों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया है, इस microfabrication तकनीक भी कई अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपकरणों के विकास के लिए लागू किया जा सकता है. भविष्य के काम में इस तरह के त्वचा और हड्डी के रूप में अन्य ऊतकों के उत्थान के लिए निर्माणों के निर्माण का पता लगाने जाएगा.

PEGDA microstructures के डिजाइन और प्रारंभिक निर्माण समय लगता हो सकता है whilst, एक बार संरचनाओं गिरावट के बिना कई बार reused किया जा सकता गढ़े. इसलिए, electrospinning द्वारा PLGA microstructured biodegradable झिल्ली के बाद निर्माण कलेक्टर के विधानसभा निम्नलिखित सादा ('असंरचित') झिल्ली का उत्पादन करने के लिए एक तुलनीय दर पर किया जा सकता है. इस काम में हम नए नए साँचे fabricating के लिए microstereolithography का इस्तेमाल किया है हालांकि, इस तरह के 3 डी प्रिंटिंग या इंजेक्शन मोल्डिंग के रूप में अन्य निर्माण विधियों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. तदनुसार, अंतर्निहित ढालना पीई के बजाय अन्य पॉलिमर या धातु से बाहर किया जा सकता हैजीडीए. जैसे यह तकनीक बहुत बहुमुखी है और शोधकर्ताओं ने आसानी से अपनी जरूरतों और सुविधाओं के मैच के लिए विधि अनुकूलन कर सकते हैं.

30μm के तहत सुविधाओं के साथ निर्माणों की तैयारी की अनुमति नहीं होगी इस अध्ययन में इस्तेमाल घर में microstereolithography सेट अप; इस यहाँ वर्णित कॉर्निया आवेदन के लिए एक सीमा नहीं है, लेकिन यह अन्य मॉडल के डिजाइन में महत्वपूर्ण हो सकता है. यह मामला अन्य तकनीकों में इस तरह के रूप में 2 फोटॉन polymerization (2PP) हालांकि electrospinning तकनीक (यह वर्तमान में हमारे समूह द्वारा अध्ययन किया जा रहा है) उप माइक्रोन पैमाने पर संरचनाओं के प्रजनन की अनुमति नहीं हो सकता है ब्याज की हो सकती है.

निर्माण की प्रक्रिया के भीतर महत्वपूर्ण कदम समय और photoinitiator की मात्रा का समायोजन करके नियंत्रित किया जा सकता है, जो PEGDA टेम्पलेट्स के overcuring बचना (मैं) कर रहे हैं. (Ii) जैसे तापमान और आर्द्रता के रूप में electrospinning स्थितियों पर नियंत्रण. (Iii) उचित electrospu भंडारणवैक्यूम पैकिंग और desiccants का उपयोग n अंगूठी झिल्ली.

संक्षेप में, झिल्ली की microfeatures भीतर अंगीय ऊतक explants रखकर हम एक खरगोश घायल कॉर्निया और कॉर्निया के बाद फिर से epithelization पर आला क्षेत्रों, सेल हस्तांतरण पर explants से सेल परिणाम से पता चला है. अलग तापमान पर संग्रहित झिल्ली की गिरावट का भी अध्ययन किया गया है और झिल्ली की लंबी अवधि के भंडारण की अनुमति देता है जो एक पैकेजिंग प्रोटोकॉल नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए झिल्ली के विकास में आवश्यक जा रहा है, बाद विकसित किया गया है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly (lactic-co-glycolic acid) Purac PDLG5004
Dichloromethane Sigma Aldrich Or Fisher 270997 Or D/1850/17 >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer
Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit Texas Instruments 1076N732 (UV)
473 nm Laser Laser 2000 MBL-III 150 mW
Poly (ethylene glycol) diacrylate Sigma Aldrich 475629 Mn = 250 g/mol, 500 ml
DEMEM + Glutamax Fisher 12077549
Ham’s F12 Labtech biosera LMH1236/500
Fetal Bovine Serum Labtech biosera FB-1090/50
EGF R&D 236-EG-200
Insulin Sigma Aldrich 91077C-1G
Amphotericin Sigma Aldrich A2942-100ml
Penicillin/streptomycin Sigma Aldrich P0781-100ml
DAPI Sigma Aldrich 32670
Propidium iodide Sigma Aldrich P4864
Thrombin Sigma Aldrich T9326
Fibrinogen Sigma Aldrich F3879
p63 Sigma Aldrich P3737
CK3 Merck Millipore CLB218
Hematoxylin SLS HHS16-500ML
Eosin Sigma Aldrich HT110232-1L
Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch Riverside Medical Ltd. Derby, UK Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)
Gamma- irradiation (Sterilization) Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy
Silica gel orange Sigma Aldrich 10087
Cobalt (II) chloride Sigma Aldrich 232696
Copper (II) sulfate Sigma-Aldrich C-1297
Six spot humidity indicator card SCC, USA 6HIC200
Vacuum heat seal machine Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK VS518
Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK BR2805
Scanning Electron Microscope (SEM) Philips/FEI XL-20 SEM
Confocal Microscope Zeiss LSM 510 META
Videne Antiseptic Solution Ecolab, Swindon, UK 3%

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 91 electrospinning microstereolithography स्टेम सेल आला भंडारण अंगीय explants
Microstereolithography और Electrospinning का संयोजन कॉर्नियल उत्थान के लिए niches के साथ लैस झिल्ली उत्पादन करने के लिए
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Ortega, Í., Sefat, F., Deshpande, P., Paterson, T., Ramachandran, C., Ryan, A. J., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration. J. Vis. Exp. (91), e51826, doi:10.3791/51826 (2014).

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