Summary
Vi rapporterer en metode for fabrikasjon av micropockets innenfor elektrospunnede membraner der å studere celleadferd. Spesielt beskriver vi en kombinasjon av microstereolithography og elektrospinning for produksjon av PLGA (Poly (laktid-ko-glykolid)) corneale biomateriale enheter utstyrt med microfeatures.
Abstract
Hornhinnen problemene påvirker millioner av mennesker over hele verden reduserer deres livskvalitet betraktelig. Hornhinnen sykdom kan være forårsaket av sykdommer som Aniridia eller Steven Johnson syndrom samt fra eksterne faktorer som for eksempel kjemiske brannsår eller stråling. Nåværende behandlinger er (i) bruken av hornhinnetransplantater, og (ii) bruk av stamcelle ekspandert i laboratoriet og levert på bærere (for eksempel, fostervann membran); disse behandlingene er relativt vellykket, men dessverre de kan mislykkes etter 3-5 år. Det er et behov for å utvikle og produsere nye korneal biomateriale enheter i stand til å etterligne i detalj det fysiologiske miljø hvor stamceller ligge i hornhinnen. Limbale stamceller er lokalisert i limbus (sirkulært område mellom hornhinne og sclera) i spesifikke nisjer kjent som Palisades av Vogt. I dette arbeidet har vi utviklet en ny plattform-teknologi som kombinerer to banebrytende produksjonsteknikker (microstereolithography og electrospinning) for fabrikasjon av corneale membraner som etterligner i en viss grad limbus. Våre membraner inneholder kunstige micropockets som tar sikte på å gi celler med beskyttelse som Palisades av Vogt gjøre i øyet.
Introduction
Den hornhinnen, avaskulær sentrale ytterste vev i øyet, er en av de viktigste vev som er involvert i syn 1. Det finnes flere typer av celler som opprettholder funksjonen av hornhinnen. Den øvre ytterste lag av hornhinnen består av epitelceller som kan være ca 5-7 lag i tykkelse 2. Dette laget hindrer bakteriell invasjon inn i hornhinnen 3 og tillater oppføring av oksygen fire. Det har blitt rapportert at stamcellene av det corneale epitel ligge i nisjer eller kryptene (med størrelser på 120 til 150 mikrometer) på den perifere delen av hornhinnen som kalles limbus 5,6. Som stamceller dele, dattercellene også kjent som forbigående forsterkerceller reiser ut av nisjene og som divisjonen fortsetter cellene bevege seg sentripetalt innover og oppover, noe som resulterer i terminalt differensierte celler på det sentrale hornhinne region 7,8. Disse cellene blir rutinemessig tørkes bort med blink i øyet exposing nyere celler under ni.
I tillegg til å være plasseringen av de epiteliale stamceller, limbus spiller også en rolle i å holde vaskularisert conjunctiva bort fra hornhinneområdet 10. Skade på limbus kunne være forårsaket av termisk / kjemisk forbrenning, stråling og også genetiske sykdommer 10. Når dette skjer, blir limbus barrieren brytes ned slik at den konjunktivale cellene å bevege seg ut på hornhinnen, vascularizing regionen, forårsaker smerte og blindhet i noen tilfeller. Tilstanden er kjent som limbale stamcellemangel (LSCD) 10.
Forskjellige naturlige underlag har blitt rapportert som mulige stamcelle bærere for å hjelpe i hornhinnen regenerering. For eksempel ble kollagen-baserte membraner som brukes av Dravida et al. 11 og Rama og kolleger 12 rapporterte bruken av fibrin i en undersøkelse med 112 pasienter. I dag er imidlertid den mest brukte metode for behandlinger å bruke menneskelig fostervann membran fra en vev bank og kultur limbale epitelceller på overflaten sin 13,14. Når et monosjikt er dannet, blir fostermembran limt cellesiden opp på skadet kornea som har alle de konjunktivale celler og arrvev kirurgisk fjernet fra det forut for denne celletransplantasjon 14. Foster membran forringer løpet av uker til måneder forlater epitelceller festet til avdekt området for å regenerere epitel 15,16. Denne teknikken har vært vellykket i å gjenopprette visjon men det er fortsatt noen praktiske problemer som begrenser dens utbredt opptak klinisk. Som foster membranen er menneskelig vev det er behov for å gjennomgå screening ved hjelp av god vev banktjenester prosedyrer før de blir brukt for celletransplantasjon på pasienter. Dette screening bare reduserer risikoen for overføring av sykdommer, men kan ikke helt fjerne den 17. I tillegg til dette har det vært rapporter om variasjon i pYtelse av foster membranen på grunn av inter donor variasjon 18,19 og ulike bearbeidingsmetoder 19,20. Ved siden av den lille risikoen for smitteoverføring er det kravet om kirurgiske sentre skal ha tilgang til veldrevne vev banker, ikke tilgjengelige for alle.
Selv foster membranen er relativt vellykket, er det et behov for utvikling av nye syntetiske bionedbrytbare cellebærer alternativer for behandling av korneal sykdom. Syntetiske bærere ville overvinne behovet for banktjenester prosedyrer, så vel som å eliminere den lille risiko for sykdomsoverføring og inter-donor variabilitet. I denne forstand er materialer slik som polyetylenglykol og PLGA 21,22 23,24 undersøkt.
I utviklingen av en syntetisk alternativ til den menneskelige foster membran er det også mulighet til å designe inn i den ønskelige funksjoner for å forhåpentligvis hjelpe overlevelsen av dyrkede celler. Økningenlusion av microfeatures innenfor biomateriale enheter for den spesifikke kontrollen av celle atferd er et voksende område av interesse. Mange forfattere har rapportert arbeidet mot utvikling av kunstige stamceller nisjer 25-30. Denne gruppen har nylig rapportert etableringen av en microfabricated PEGDA fibronectin-biofunctionalized kunstig limbus for levering av limbale epitelceller 22 og en metodikk for fabrikasjon av elektrospunnede biologisk nedbrytbare membraner som inneholder microfabricated lommer for støtte fra limbale epitelceller 31.
Målet med dette arbeidet er å utvikle en ny produksjonsteknologi for utvikling av biomateriale enheter som inneholder microfeatures som etterligner i et omfang de microenvironments der stamceller bor i kroppen. Vi har utviklet en teknikk som kombinerer microstereolithography elektrospinning og som tillater fremstilling av biologisk nedbrytbare mikrostrukturerte membraner som viser flott potensial for vev gjenfødelse applikasjoner.
Det er viktig å legge merke til at selv i dette arbeidet denne teknikken har blitt brukt til fabrikasjon av ringer for hornhinne gjenfødelse, kan teknologien brukes til fabrikasjon av enheter for regenerering av et bredt spekter av epitelvev, f.eks, hud, oral slimhinner, tarm, luftveier, og blære epitel. Nærmere bestemt, i denne studien har vi utviklet en syntetisk bionedbrytbar membran som fungerer på en lignende måte til den fostermembran for å levere celler til hornhinnen. Denne membranen inneholder micropockets på rundt 300 mikrometer (større enn de limbale krypter av Pallisades av Vogt (rundt 150 mikrometer)). Endelig, er det etablert en emballasje protokoll som gjør at disse membraner til å bli lagret ved -20 ° C i mer enn 6 måneder uten å vise noen tegn på sammenbrudd.
Protocol
Etikk Uttalelse: Øynene som brukes i denne studien ble brukt i henhold til erklæringen om åpenhet om Forsøksdyrutvalget:
1. Fabrikasjon av PLGA Biologisk nedbrytbart Membraner Utstyrt med Micropockets
- Ringen stillasene ble skapt av en kombinasjon av microstereolithography og elektrospinnings teknikker 31. I hovedsak kan prosessen oppsummeres i to deler (i) etablering av PEGDA maler ved microstereolithography og (ii) electro på malene for reproduksjon av den underliggende PEGDA struktur (i dette tilfellet en microfabricated ring). Disse to trinnene er beskrevet i detalj nedenfor (figur 1 og 2).
- Fabrikasjon av PEGDA maler ved microstereolithography (microSL)
- Dikte ringene ved hjelp av en 2-lags-modell, med det første lag (L1) som er i bunnen av strukturen og det andre laget (L2) som oppviser seks micropockets med hestesko Morphologies i en rekke størrelser 300-500 mikrometer. Fabrikasjon av PEGDA ringene ble nylig beskrevet av denne gruppen 22.
- Lag L1 ved å tegne en 1,2 cm svart sirkel ved hjelp av noen egnet tegneprogram.
- Lag L2 på samme måte, men inkluderer 8 hvite 0,5 x 0,35 mm hesteskoformede strukturer. Fordel små hvite hestesko innenfor den svarte sirkelen struktur.
- Lagre L1 og L2 i JPEG format.
- I en mørk glassflaske, bland polyetylenglykol diakrylat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) med 1% w / w kamferkinon, en fotoinitiator, en magnetisk rører i 20 min.
- Utvid laserstrålen av microstereolithography satt opp ved hjelp av et teleskopobjekt ordning og deretter projisere det på en datamaskin programmerbar digital multimirror enhet (UV-aktivert DMD startsett). MERK: DMD gjenspeiler bildet (i dette tilfellet en ring) på et speil via en 10 cm brennvidde tube linse. Bildet blir deretter styrt av den sølv-coated speile inn et hetteglass som inneholder fotoherdbare polymer (PEGDA).
- Juster og nøye rengjøre optikk microstereolithography satt opp.
- Sett 300 ul av den PEGDA blandingen i en brønn av en 12-brønners vevkulturplate. Pass på at brønnene er pre-belagt med teflon eller andre non-stick materiale for enkel fjerning av struktur etter herding.
- Slå på blå laser (MBL-III 473 nm, 150 mW) og laste L1 inn i ALP3-grunnleggende programvaren allerede er installert på PC-en. Bestråle det første laget for 60 sek. MERK: ALP3-grunnleggende er et USB-grensesnitt som gir koblingen mellom PC og Digital Micromirror enheten.
- Legg til brønnen 250 mL flere av PEGDA, laste L2 som beskrevet ovenfor, og bestråles L2 for 60 sek.
- Fjern det uherdede polymeren og vaske ringen med isopropanol O / N.
- Dikte ringene ved hjelp av en 2-lags-modell, med det første lag (L1) som er i bunnen av strukturen og det andre laget (L2) som oppviser seks micropockets med hestesko Morphologies i en rekke størrelser 300-500 mikrometer. Fabrikasjon av PEGDA ringene ble nylig beskrevet av denne gruppen 22.
- Fabrikasjon av biologisk nedbrytbart PLGA membraner ved hjelp av electrospinning
MERK: PEGDA ringene ble brukt som mals over hvilke PLGA ble elektrospunnede med PLGA gjengi den underliggende topografi som det er spunnet i løpet av disse malene. Etter sentrifugering, ble arket av PLGA polymer skrelles fra oppsamleren. Den endelige PLGA membran inneholdt ikke de PEGDA ringer som var igjen er festet til det metalliske samleren.- Fordel PEGDA ringer på en galvanisert aluminium ark (12 cm x 20 cm) for å lage en statisk electro samler.
- Fest ringer med ledende karbon tape. MERK: Disse ringene gang dannet kan gjenbrukes som maler for electrospinning.
- Forbered polymeroppløsningen for spinning. Oppløs PLGA (50/50 DL-laktid (52 mol%): glykolid (48 mol%), 44 kg / mol) i diklormetan (DCM) ved 20% vekt / vekt konsentrasjon.
- Rør O / N før bruk.
- Place 4 insulinsprøyter (sløv avsluttet, 0,8 cm indre diameter nåler) på sprøytepumpe. MERK: Fire sprøyter sikret raskere electro enn å jobbe med en enkelt sprøyte.
- Last inn 2,5 ml av PLGA løsning i hver sprøyte.
- Electrospin ved hjelp av en 30 mL / min strømningshastighet og spenninger fra 12 til 15 kV. Igjen en avstand mellom nålene og kollektoren på 15 cm.
- Electrospin for 1 time og 30 min og til slutt løsner nøye PLGA elektrospunnede arket fra solfangeren som støtter PEGDA ringer.
- Skjær elektrospunnede stillasene i 22 mm diameter sirkler ved hjelp av en sirkulær hulle og forlater ringstruktur plassert i sentrum.
- Fabrikasjon av PEGDA maler ved microstereolithography (microSL)
2. Langsiktig Lagring av PLGA Microfabricated Membraner
Merk: PLGA ringene ble fabrikkert og steriliseres av akkrediterte eksterne selskaper; Prøvene ble bestrålt ved en ekstern doseområdet 25-40 KGY.
- Monter membranen i en liten beholder (plast petriskål) og plassere den i en medisinsk karakter bag.
- Bruk filterpapir for å lage små filterposer for tørkemidler. To lage poser, brett filterpapiret (125 mm diameter) og kutte den resulterende halvsirkel i to; deretter forsegle endene sammen ved hjelp av tape.
- Fyll tre filterpapirposer med 1 g silika orange, kobolt (II) klorid og kobber (II) sulfat, henholdsvis.
- Sett de tre sekker med tørkemiddel inne i medisinsk kvalitet pose sammen med den elektrospunnede membran.
- Legg til posen en kommersielt tilgjengelig seks flekk fuktighet indikator kort for å oppdage eventuell fuktighet opphopning under lagringen.
- Bruke et vakuum varmeforseglet maskin å støvsuge og forsegle posen.
- Sende ring membraner til et eksternt selskap for γ-bestråling.
- Oppbevar γ-bestrålt PLGA membraner på et vidt område av temperaturer fra -20 ° C til +37 ° C i et fuktig miljø i en inkubator inneholdende 5% CO 2.
- Post lagring, undersøke fuktigheten indikator for å bekrefte at nivået av luftfuktigheten er under 30%.
- USE Scanning Electron Microscopy (SEM) for å vurdere fiberintegritet.
3. Isolering av limbale eksplantater
Rabbit limbale eksplantater ble isolert fra kaninøyne (hentet fra en gård der kaniner er avlet for forbruk).
- Desinfisere kaninøyne ved bruk av antiseptisk oppløsning (3%).
- Rens øynene ved å fjerne overflødig vev rundt hornhinnen.
- Separer den limbale region (identifisert som en tynn sirkulært område mellom hornhinnen (gjennomsiktig) og sclera (hvit)) fra resten av hornhinnen ved hjelp av et mikroskop disseksjon.
- Skjær i segmenter (rundt 1,5 cm lang) under disseksjon mikroskop.
- Desinfisere limbale segmenter i 1,5% antiseptisk løsning i 1 min.
- Skjær limbale segmenter i små biter (100-500 mikrometer) med en skalpell blad.
- Lagre de små stykker av vevet i kulturmedium (DMEM + Glutamax: Ham's F12 (1: 1), 10% føtalt bovint serum, 1 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2,5 ug / ml amfotericin, 10 ng / ml EGF og 5 ug / ml av insulin) ved 37 ° C og 5% CO2 inntil bruk (ikke mer enn 60 min).
4. utvekst av celler fra limbale eksplantater
Kanin limbale eksplantater ble plassert på begge fersk spunnet microfabricated membraner og membraner som ble vakuumpakket og lagret i 6 måneder ved -20 ° C.
- Coat ring stillas med 15 mL av fibrin-lim (1: 1 blanding av fibrinogen fra humant plasma ved en konsentrasjon på 18.75 mg / ml og trombin fra humant plasma ved en konsentrasjon på 2,5 U / ml) ved hjelp av en celleskrape for fordeling av fibrin jevnt.
- Plasser vev eksplantater direkte på PLGA micropockets ved hjelp av en 25 G nål og et disseksjonsmikroskop.
- Legg cellekulturmedier svært forsiktig for å unngå å demontere eksplantater.
- Endre media hver 3. dag (media oppskrift beskrevet i avsnitt 3.7) og kEEP i kultur i 2 uker i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fix prøvene med 3,7% bufret formaldehyd i 10 min etterfulgt av 3 vasker med PBS.
- Counterstain ved inkubering i 1 pg / ml av 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) eller propidium jodid (PI) i 10 min ved RT.
- Vask 3 ganger i PBS og lagres prøvene dekket med folie.
- Bilde prøvene ved hjelp av et fluorescens-mikroskop ved bølgelengder på 543 nm og 800 nm (to-foton).
5. Innstilling-up Rabbit Wounded Hornhinnen 3D-modeller
- Rengjør og desinfiser kaninøyne som beskrevet ovenfor.
- Sår i kaninøyne ved å dyppe dem i 0,14% ammonium-hydroksyd i 5 min.
- Skyll øynene i PBS og skrape bort epitel med en sclerotome kniv.
- Klipp og isolere hornhinnen-skleral knapp fjerne eventuelle gjenværende vev.
- Plasser hornhinner epithelial side ned påen steril kopp og fyll opp med 0,5% agar gjort i DMEM.
- Når det er satt, satte hornhinner epithelial siden opp, i små petriskåler og legg kultur media (oppskrift beskrevet ovenfor) opp til limbale området. MERK: Ikke dekke hele hornhinnen; holde-organkultur ved luft-væske-grensesnittet.
6. Isolering av limbale eksplantater og inkludering av Ring Stillas i Rabbit Hornhinnen 3D-modeller
- Coat ring membraner med 15 mL av fibrin-lim (1: 1 blanding av fibrinogen ved en konsentrasjon på 18.75 mg / ml og trombin ved en konsentrasjon på 2,5 U / ml) .Bruk en celleskraper, som beskrevet ovenfor.
- Plasser vev eksplantater direkte på PLGA micropockets ved hjelp av en 25 G nål og et disseksjonsmikroskop.
- Plasser ringene med vev explants på de utarmede hornhinner med explants vender opp og på luft-væske vilkårene for grensesnitt. (Disse betingelsene er som tidligere beskrevet 22).
- Opprettholde organkultur modeller for4 uker i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 idet media ble endret hver 2 dager.
7. Vurdering av Hornhinnen Regeneration og Stem Cell Vedlikehold
- Etter 4 uker, fikse hornhinner ved hjelp av 3,7% formaldehyd.
- Behandle hornhinner for konvensjonell histologi å produsere 6 mikrometer parafinsnitt.
- Flekken med hematoxylin og eosin (H & E).
- For immunocytokjemi, dewax seksjonene i xylen (3 minutter), og rehydrere i 100% etanol (1 min), 70% etanol (1 min), og destillert vann (2 min).
- Avgrense de delene ved hjelp av en Dako penn for å avgrense små områder og unngå overdreven bruk av antistoff.
- Behandles de beskrevne områder med 0,05% trypsin (100 mL) i 20 min (37 ° C).
- Vask grundig med PBS og tilsett 100 ul av 10% geiteserum (blokkering) i 1 time.
- Inkuber prøvene med 100 mL av mus monoklonalt antistoff cytokeratinn 3 (CK3) og 100 pl av p63 i 1% geiteserum O / N ved 4 ° C.
- Vask med PBS og behandles med 100 ul biotinylert sekundært anti-mus-antistoff (1: 1 000 i 1% geiteserum) i 1 time ved RT.
- Tilsett 100 ul av FITC-streptavidin (1: 100 i 1% geiteserum) i 30 min ved RT.
- Unn prøvene med DAPI som beskrevet ovenfor.
- Bilde prøvene ved hjelp av et fluorescens-mikroskop ved bølgelengder på 800 nm (to-foton) og 488 nm.
Representative Results
Elektrospunnede microfabricated ringene ble produsert ved hjelp av en kombinasjon av microstereolithography og electrospinning (figur 1 og 2). PEGDA ringer av forskjellige størrelser ble fremstilt ved hjelp av microstereolithography (figur 3); Denne teknikken gjør det mulig for fabrikasjon strukturer i størrelsesorden cm og samtidig inkorporering av microfeatures. I dette tilfellet er ringene av diametre som strekker seg 1,2 til 1,6 cm inneholdende micropockets av 350-500 um ble fremstilt (figur 4).
Når det gjelder fremstilling, sterilisering og emballering av materialer for fremtidig klinisk bruk ble det funnet at vakuumpakking i medisinsk grade poser vesentlig forbedret evne til å oppnå langtidslagring av PLGA membraner (figur 5); bruk av en medisinsk kvalitet pose (PET / folie / LDPE) med tykkelse på 0,12 mm tillatt oss å oppnå en lengre holdbarhet. Dette ble undersøkt ved å sende MEMBRanes til våre samarbeidspartnere i India og membraner ble lagret i en periode på flere måneder ved -20 ° C, ved romtemperatur og ved 37 ° C i bevisst fuktige betingelser (en fuktig inkubator). Figur 5 viser at ved hjelp av bevisst provoserende lagringsbetingelser på 37 ° C under fuktige betingelser, membraner bare var stabile i ca en måned under ikke-vakuumpakket betingelser, men oppnådde 3 måneders lagring under vakuumpakket betingelser (figur 5 og tabell 1).
Tabell 1 viser forbedringen i lagringsforhold som kan oppnås, selv under betingelser utvalgt for å ligge til rette for vannopptak og svelling fiber hvis man tar hensyn til valg av posen brukes.
Ringene støttet celleutvekst fra limbale eksplantater i ulike tilstander (i) ringer rykende fersk og (ii) ringer lagret i 6 måneder (figur 6). Cell overføringen ble oppnådd etter 4 uker når placing PLGA-membraner på 3D sårede modeller. Cellene vokste ut fra vevet eksplantater plassert på membraner skape en ny epitel på tidligere utarmede hornhinner (figur 7). Positive (hornhinner uten behandling) og negative kontroller (sårede hornhinner) ble også opprettholdt i kultur for de samme perioder. De negative kontrollene bekreftet mangelen på dannelse av et nytt epitel i fravær av eventuelt tilsatte celler. Immunocytochemistry viste at cellene vokser ut fra eksplantater ble corneale epitelceller, siden de var positiv for corneal differensiering markør CK3 (figur 7E).
Figur 1. Skjematisk av microstereolithography satt opp for etablering av PEGDA ringer.
her.within-page = "alltid"> 
Figur 2. Skjematisk av electro prosessen ved hjelp PEGDA microfabricated ringer som en maler.
Figur 3 (A) viser et eksempel på en statisk samler (galvanisert aluminiumsplate med PEGDA ringer) for spinning av microfabricated PLGA membraner. (B) og (E) viser forskjellige elektrospunnede matter blir skrellet fra statiske samlere. (C) viser PEGDA maler av forskjellige størrelser fremhever allsidigheten av å bruke microstereolithography for fabrikasjon av underlaget. (D) viser en PLGA microfabricated replika./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. SEM bilde av en PEGDA ring med en hestesko microfeature (A); høy forstørrelse SEM bilde av en microfabricated lomme (B). Fase kontrastbilde av en PLGA ring med en hestesko microfeature (C); høy forstørrelse fasekontrast bilde av en microfabricated lomme (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effekt av temperatur og tid ved lagring av vakuum og ikke-vakuumpakket PLGA (50/50) membraner (44 kg / mol) med mikro-fremstille ringene over 6 måneder. membranintegritet ble merket som fullt intakte fibre (+++), noe fiber hevelse (++), fiber sammenslåing (+) eller ingen intakte fibre (-). SEM bilder og tre tørkemidler (silika orange, kobolt (II) klorid, og kobber (II) sulfat) viser ingen endringer i fiber integritet eller fuktighet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Fluorescens-bilder som viser utvekst av LEC fra limbale eksplantater på nystekte bionedbrytbare PLGA ringer (A, B) og på ringene etter 6 måneders lagring ved -20° C (C, D). Bilder (A) og (B) svarer til celler farget med DAPI (blå) og propidium jodid (rød) hhv. Bilde b et ortogonalt riss av en konfokal z-stabel med et eksplantat plassert på en microfabricated lomme. Bilder (C) og (D) viser positiv farging for p63 (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 (A) viser en kanin hornhinne såret modell med en ring stillas og vev eksplantater plassert på stillaset som tidligere var belagt med fibrin-lim (B) og (C) er positive og negative kontroller.; den positive kontrollen er et friskt rabbi . t hornhinnen og den negative kontrollen en hornhinne hvor epitel ble bevisst fjernet (negativ kontroll ble også dyrket i 4 uker) (D) er en H & E bilde av et vev konstruert hornhinnen etter 4 uker i kultur; figuren viser det nye lagdelte epitel dannet av cellene som kommer ut fra eksplantater plassert på nisjer (E) er et bilde som viser immunocytokjemi celleutvekst fra en limbale eksplantasjon.; atomkjerner er farget med DAPI (blå) og cellene viser positiv farging for cytokeratin 3, en hornhinnen differensiering markør (grønn). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PLGA (50/50) | x; "> Fiber integritet for membraner som er lagret ved 37 ° C fuktig|||||||
| Dag 0 | Måned 1 | Måned 2 | Måned 3 | Måned 4 | Måned 5 | Måned 6 | |
| Non-vakuumpakket | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Støvsugd (Bag A) (PE, PA Composite) Tykkelse: 0,14 mm | +++ | + | - | 64px; "> -- | - | - | |
| Støvsugd (Bag B) (PET / folie / LDPE) Tykkelse: 0,75 mm | +++ | +++ | +++ | + | - | - | - |
Tabell 1. Effekt av vakuum og annen lagring poser på integriteten PLGA (50/50) membraner (44 kg / mol) undersøkte over 6 måneders lagring. Membran integritet ble scoret som fullt intakte fibre (+++), litt fiber hevelse (++), fiber sammenslåing (+) eller ingen intakte fibre (-).
Discussion
Denne studie beskriver (a) en teknikk for fabrikasjon av elektrospunnede membraner innehold microfeatures i dem, og (b) å tilberede slike membraner for klinisk bruk ved vakuumpakking, gamma-stråling og deretter lagring før bruk. I denne søknaden har vi utviklet PLGA membraner som inneholder micropockets som etterligner de fysiske funksjonene i limbale stamcelle nisjer. Målet med denne studien er (i) for å beskrive metoder for å gi leserne den kunnskapen som trengs for å designe og dikte stillasene inneholder microfeatures for forskning på bidraget fra stamcelle nisjer til vev gjenfødelse og (ii) å gi leseren en bedre forståelse av hvordan du lagrer elektrospunnede stillaser for lange perioder av gangen.
I form av klinisk anvendelse, er lagring av ring membraner av overordnet betydning. I dette arbeidet ble nedbrytningen av ringen undersøkt over en periode på 6 måneder. Nedbrytning avmembraner er drevet av hydrolyse så ved ganske enkelt å holde membranene fuktighetsfrie prosessen stanses. Blackwood et al. Rapportert at ved å variere forholdet mellom PLA til PGA, nedbrytning av membranen 32 endres. Denne studie viste også at ved å øke mengden av PGA, nedbrytningshastigheten for elektrospunnede membraner økt in vivo-22. Her har det vist seg at med vakuumpakking membranene sammen med noen tørkemiddel og bestråle dem og lagre dem ved lav temperatur i 6 måneder, er det ingen endring i fiberintegritet og nedbrytning. I dag er 6 måneder så langt som vi har studert med disse membranene som inneholder micropockets men lagring av data for ett år har blitt rapportert på vanlig elektrospunnede membraner ved -20 ° C 22 og vi har nå upubliserte data for deres lagring ved -20 ° C for 2 år uten noen tegn til degradering. Dermed for langtidslagring vil det bli anbefalt å lagre dem tørr ved -206, C, men det er mulig å lagre dem ved RT selv i India i minst 6 måneder (muligens mye lenger). Inkludering av en fuktighetsindikator gir en enkel måte å kontrollere at emballasjen har holdt membraner tørre i så fall vil de være egnet til formålet.
Overføring av celler fra disse ringene til 3D hornhinne modeller ble vist når du plasserer limbale eksplantater innenfor micropockets. Denne gruppen har nylig rapportert overføring av cellene til et in vitro kanin hornhinne modell ved å plassere eksplantater på vanlig PLGA membraner (membraner uten ringstrukturer) for 24. Ved hjelp av den nåværende microfabricated stillaser celle overføring har blitt tatt et skritt videre som vi kan nå spesifikt finne vev explants innenfor microfeatures. Evnen til å plassere de eksplantater direkte i nisjene også tillater kirurgen å bruke membraner direkte i den kirurgiske teater unngå behovet for et renrom først å utvide limbale stamceller. Selv om dette stykke work har vært fokusert på utvikling av enheter for hornhinnesykdom, kan dette microfabrication teknologien også brukes for å utvikle enheter for mange andre programmer. Fremtidig arbeid vil utforske fabrikasjon av konstruksjoner for regenerering av andre vev som hud og bein.
Mens utformingen og innledende fabrikasjonen av PEGDA mikrostrukturer kan være tidkrevende, en gang fremstille strukturene kan brukes om igjen mange ganger uten degradering. Derfor kan den etterfølgende fabrikasjon av PLGA mikrostrukturerte biodegraderbare membraner ved electro bli utført på en tilsvarende sats til fremstilling av ren ('ustrukturerte') membraner etter monteringen av oppsamleren. Selv i dette arbeidet har vi benyttet microstereolithography for fabrikasjon av muggsopp, kan andre fabrikasjon metoder som for eksempel 3D-utskrift eller sprøytestøping også brukes. Følgelig kan den underliggende formen være laget av andre polymerer eller metaller i stedet for PEGDA. Som sådan denne teknikken er svært allsidig og forskere kan enkelt tilpasse metoden for å matche sine egne behov og fasiliteter.
Husets microstereolithography oppsett brukt i denne studien vil ikke tillate utarbeidelse av konstruksjoner med funksjoner henhold 30μm; dette er ikke en begrensning for hornhinnen søknaden beskrevet her, men det kan være avgjørende i utformingen av andre modeller. I så fall andre teknikker som to foton polymerisasjon (2PP) kunne være av interesse men electrospinning teknikken kanskje ikke tillate reproduksjon av strukturer på sub-micron skala (dette blir nå studert av vår gruppe).
Kritiske trinn innenfor fabrikasjon prosessen er (i) Unngå overcuring av PEGDA maler som kan kontrolleres ved å justere tid og mengder fotoinitiator. (Ii) Kontroll av elektrospinnings forhold som temperatur og fuktighet. (Iii) Lagring hensiktsmessig den electrospun ring membraner ved hjelp av vakuum-pakking og tørkemidler.
I sammendrag, ved å plassere limbale vev eksplantater innenfor microfeatures av membranen har vi vist celleutvekst fra eksplantater i nisjer, celleoverføring på en kanin hornhinne såret og etterfølgende re-epitelisering av hornhinnen. Nedbrytningen av membraner som er lagret ved forskjellige temperaturer er også blitt studert og en emballasje protokoll som tillater langtidslagring av membraner har blitt utviklet, hvor sistnevnte er viktig i utviklingen av membraner for klinisk bruk.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) | Purac | PDLG5004 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich Or Fisher | 270997 Or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150 ppm amylene stabilizer |
| Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board & Starter Kit | Texas Instruments | 1076N732 (UV) | |
| 473 nm Laser | Laser 2000 | MBL-III | 150 mW |
| Poly (ethylene glycol) diacrylate | Sigma Aldrich | 475629 | Mn = 250 g/mol, 500 ml |
| DEMEM + Glutamax | Fisher | 12077549 | |
| Ham’s F12 | Labtech biosera | LMH1236/500 | |
| Fetal Bovine Serum | Labtech biosera | FB-1090/50 | |
| EGF | R&D | 236-EG-200 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C-1G | |
| Amphotericin | Sigma Aldrich | A2942-100ml | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100ml | |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32670 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4864 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T9326 | |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F3879 | |
| p63 | Sigma Aldrich | P3737 | |
| CK3 | Merck Millipore | CLB218 | |
| Hematoxylin | SLS | HHS16-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | HT110232-1L | |
| Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch | Riverside Medical Ltd. Derby, UK | Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50) | |
| Gamma- irradiation (Sterilization) | Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40 KGy | ||
| Silica gel orange | Sigma Aldrich | 10087 | |
| Cobalt (II) chloride | Sigma Aldrich | 232696 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
| Six spot humidity indicator card | SCC, USA | 6HIC200 | |
| Vacuum heat seal machine | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | VS518 | |
| Andrew James Vacuum Sealer rolls 28 cm x 40 meter rolls | Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK | BR2805 | |
| Scanning Electron Microscope (SEM) | Philips/FEI XL-20 SEM | ||
| Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 META | ||
| Videne Antiseptic Solution | Ecolab, Swindon, UK | 3% |
References
- Ambati, B. K., et al. Corneal avascularity is due to soluble VEGF receptor-1. Nature. 443, 993-997 (2006).
- Reinach, P., Capó-Aponte, J., Mergler, S., Pokorny, K. Ophthalmic Diseases And Drug DeliveryOphthalmology Research. Ch 2, Ocular Transporters. Tombran-Tin, J., Barnstable, C. J. 2, Humana Press. 17-46 (2008).
- Kinoshita, S., et al. Characteristics of the Human Ocular Surface Epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 20, 639-673 (2001).
- Fatt, I., Bieber, M. T. The steady-state distribution of oxygen and carbon dioxide in the in vivo cornea: I. The open eye in air and the closed eye. Experimental Eye Research. 7, 103-112 (1968).
- Shortt, A. J., et al. Characterization of the Limbal Epithelial Stem Cell Niche: Novel Imaging Techniques Permit In Vivo Observation and Targeted Biopsy of Limbal Epithelial Stem Cells. STEM CELLS. 25, 1402-1409 (2007).
- Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. British Journal of Ophthalmology. 89, 529-532 (2005).
- Thoft, R. A., Friend, J. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 24, 1442-1443 (1983).
- Lehrer, M. S., Sun, T. T., Lavker, R. M. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation. Journal of Cell Science. 111, 2867-2875 (1998).
- Djalilian, A., et al. Down-regulation of Notch signaling during corneal epithelial proliferation. Molecular Vision. 14, 1041-1049 (2008).
- Dua, H. S., Azuara-Blanco, A. Limbal Stem Cells of the Corneal Epithelium. Survey of Ophthalmology. Survey. 44, 415-425 (2000).
- Dravida, S., et al. A biomimetic scaffold for culturing limbal stem cells: a promising alternative for clinical transplantation. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2, 263-271 (2008).
- Rama, P., et al. Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. New England Journal of Medicine. 363, 147-155 (2010).
- Koizumi, N., Inatomi, T., Suzuki, T., Sotozono, C., Kinoshita, S. Cultivated corneal epithelial stem cell transplantation in ocular surface disorders. Ophthalmology. 108, 1569-1574 (2001).
- Fatima, A., et al. Technique of cultivating limbal derived corneal epithelium on human amniotic membrane for clinical transplantation. Journal of Postgraduate Medicine. 52, 257-261 (2006).
- Nubile, M., et al. Amniotic membrane transplantation for the management of corneal epithelial defects: an in vivo confocal microscopic study. British Journal of Ophthalmology. 92, 54-60 (2008).
- Nubile, M., et al. In Vivo Analysis of Stromal Integration of Multilayer Amniotic Membrane Transplantation in Corneal Ulcers. American Journal of Ophthalmology. 151, 809-822 (2011).
- Dua, H. S. Amniotic membrane transplantation. British Journal of Ophthalmology. 83, 748-752 (1999).
- Gicquel, J., et al. Epidermal Growth Factor Variations in Amniotic Membrane Used for Ex Vivo Tissue Constructs. Tissue Engineering Part A. 15, 1919-1927 (2009).
- Connon, C. J., et al. The variation in transparency of amniotic membrane used in ocular surface regeneration. British Journal of Ophthalmology. 94, 1057-1061 (2010).
- Hopkinson, A., McIntosh, R. S., Tighe, P. J., James, D. K., Dua, H. S. Amniotic Membrane for Ocular Surface Reconstruction: Donor Variations and the Effect of Handling on TGF-β Content. Investigative Ophthalmolog., & Visual Science. 47, 4316-4322 (2006).
- Sitalakshmi, G., et al. Ex Vivo Cultivation of Corneal Limbal Epithelial Cells in a Thermoreversible Polymer (Mebiol Gel) and Their Transplantation in Rabbits: An Animal Model. Tissue Engineering Part A. 15, 407-415 (2008).
- Ortega, I., Deshpande, P., Gill, A. A., MacNeil, S., Claeyssens, F. Development of a microfabricated artificial limbus with micropockets for cell delivery to the cornea. Biofabrication. 5, (2013).
- Deshpande, P., et al. Using poly(lactide-co-glycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea. Regenerative Medicine. 5, 395-401 (2010).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34, 5088-5106 (2013).
- Wheeldon, I., Ahari, A. F., Khademhosseini, A. Microengineering Hydrogels for Stem Cell Bioengineering and Tissue Regeneration. Charlottesv Va. 15, 440-448 (2010).
- Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
- Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Langer, R., Peppas, N. A. Bioinspired Materials for Controlling Stem Cell Fate. Accounts Chem. Res. 43, 419-428 (2010).
- Raimondi, M. T., et al. Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing. Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat Meth. 8, 949-955 (2011).
- Truckenmüller, R., et al. Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies. Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).
- Ortega, Í, Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair. Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).
- Blackwood, K. A., et al. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
