ネズミ角膜移植：固体臓器移植の最も一般的な形態を研究するためのモデル

Introduction

角膜移植は、ヒトで行わ移植の最も成功したと一般的なタイプの一つです。この手術が行われる理由は、損傷、感染症^1、または非感染性角膜疾患²の他の形態の結果である。アメリカのアイバンク協会からフィギュアは、46000の上には、（：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.htmlでのWebサイトを参照してください）​​2011年に行われたことを示している。その成功の指標は、同種移植片、角膜1年間故障率10〜15％の範囲で5年での成功率が^70％3-8を超えているということである。多くの研究が示したように、角膜の同種移植の成功は、直接目に免疫学的特権部位であるという事実に関連している。免疫特権部位として角膜の状態を担当する要因は、角膜内の両方血管およびリンパ管の欠如は、抗原提示細胞の相対的欠如、suppres角膜によって産生される因子を含むの免疫エフェクターfuntions ^9-15、MHCの低発現は¹⁶抗原、およびFasLの^17-20の発現。

しかし、成功のためのこれらの移植片を素因これらの要因にもかかわらず、それらは拒絶^3-7を受けない。したがって、この拒絶反応を媒介するそれらのメカニズムを理解するだけでなく、拒絶反応を防止するために、様々な治療法をテストする非常に重要である。そのために、我々はここで、制御の実験環境での角膜移植を研究するために20年以上にわたって使用されている角膜移植のマウスモデルを記述する。移植応答が最終的な移植組織が ​​失敗したか成功したかどうかを決定する協調して働いて、さまざまな要因が関与するので、任意のインビトロモデルにおけるこれらの要因の重要性を理解することは不可能である。結果的に、無傷の動物を用いた研究が成功またはfailuどちらにとって重要などのような要因を決定するために必要とされている移植された組織の再。

動物の他の種は角膜移植を研究するために使用されてきたが、他の種を用いて比較した場合、マウスモデルは、いくつかの利点を有する。最初は、特定の遺伝子を発現するかまたは機能移植におけるより良い研究することができる特異的な免疫学的因子の発現を欠くように遺伝子標的化されたマウスの多くの株が存在することである。また、動物の多くの他の種は存在しないマウスに特異的な多くの試薬（因子を中和する組換え因子および抗体の両方）がある。これらの要因が存在するため、このモデルは、急性角膜の同種移植片の応答^{15、17,18,20 -29}に関与し、関連する因子を同定するために広く使用されている。さらに、角膜移植に関与する因子の多くは、他の組織の移植において機能的であることが知られている。

Protocol

注：この手順で使用するすべての動物は、ビジョンの研究のための協会と眼科文の眼科と視覚研究における動物の使用のためだけでなく、セントルイス大学で動物の監督委員会によって定めるガイドラインに従って扱われます。
注：すべての手術器具やソリューションは、目の微生物感染を制限するために手術前に滅菌される。これは、動物は、この手順のいくつかの痛みを経験しない間、我々は、鎮痛薬を使用しないことに留意すべきである。すべての鎮痛薬は、抗炎症性であり、角膜移植応答は、炎症を伴うため、系抗炎症薬の使用は、角膜移植不全に関与しているかの要因を決定する我々の能力を危うくするので、この理由による。

1.麻酔

1. ケタミン（86mgのIP注射によって、全身麻酔下で、ドナーとレシピエントマウスを置きます。98ミリグラム/ kg）およびキシラジン（13.04 mg / kgを）。
2. 通常、時間に30分を要する作業中は麻酔下でレシピエントマウスにしてください。その結果、常に意識を取り戻すの兆候のためのマウスを監視します。
3. 動物は乾燥を防ぐために麻酔をかけた後に手術を受けることはありません目にpuralube軟膏を適用します。

2。角膜移植

1. ドナー角膜ボタンを取得する。
   1. 動物が完全に麻酔したら、1％トロピカミドおよび2.5％塩酸フェニレフリンの点眼剤のカップルの投与により十分な散瞳を達成。
   2. 水平に頑丈な可動支持体の上に置かれ、ボード上のドナー動物の頭を置きます。目は操作全体を通して水平な位置にあることを保証するために、首全体でテープのストリップで頭を固定します。
   3. アウト、先端がメチルブルーで染色した直径2mmのトレフィンを使用して、中央角膜移植部位を裏打ちする。
   4. 鋭利な刃で、角膜に浸透し、ドナー内皮および基盤となるレンズへの損傷の可能性を減らすためにそれを深めるために前房内にのHealonを注入する。
   5. vannasはさみを持つドナー移植片を切除し、使用するまでハンクス平衡塩溶液を含む皿に置く。
   6. ドナー移植片が除去された後、CO ₂吸入によりドナーマウスを安楽死させる。
2. 移植床の準備。
   1. 受信者に対して2.1.2を通じて、2.1.1で説明したのと同じ手順を繰り返します。
   2. 直径1.5mmのトレフィンを使用して、受信者の移植部位を概説。
   3. 鋭利な刃で、角膜に浸透し、下層のレンズへの損傷の可能性を低減することを深めて前房へのHealonを注入する。
   4. vannasはさみを使って受信者から概説し、中央の角膜のボタンを外して捨てる。
3. 縫合移植
   1. 受取人の角膜のベッドの上で移植ドナーの角膜を置きます。十分なのHealonは、レンズとの直接接触による損傷からドナー内皮細胞を保護するために、ドナー角膜の下にあることを確認してください。
   2. 超微細な先端マイクロピンセットを使用して、その後オフネクタイ、受信者の側への完全な厚さの90％の深さを持つドナーを通じて、ドナー側に11-0ナイロン縫合糸の最初の一口を置く。
   3. 角膜が所定の位置に固定されると、角膜は8~10総縫合糸を有し、ドナー角膜がしっかりと整列し、受信者の角膜の移植床に取り付けられるようにmidcardinal結節縫合を行う。
4. 前房の深化
   1. 前房内にHBSSまたは気泡を注入することによって前房を深め、静かにセルローススポンジで漏れのため、角膜移植片の完全性をチェック。
      注：前房を改質することができない場合、cは確率が高い移植された角膜の将来の評価が非常に困難になり、また、潜在的ドナー角膜内皮機能不全、したがって、移植の失敗につながるataract。
5. 最終的評価
   1. 瞳孔が丸いと前房の深さが正常であることを決定するために、目を守ってください。
      注：瞳孔が丸いされていない場合、これは、虹彩を縫合中に破損したため、移植片が技術的失敗と見なされていることを示します。
   2. 目に抗生物質軟膏を適用します。オプション：7-0絹縫合糸で眼瞼を閉じます。
   3. 彼らは完全に目を覚ましていると、その後個別に手術後2日以上のためにそれらを収容するまで、マウスを観察します。

3.抜糸

1. 上記のように、蓋縫合糸が使用されているような場合には、マウスを麻酔し、48時間後に蓋縫合糸を除去する。
2. 術後7日目のマウスを麻酔。 suturを削除ES角膜移植を確保。縫合糸が除去され、動物が完全に目覚めた後は、そのケージに戻す。

4.臨床評価

1. 、白内障（レンズの曇り）、前房出血（前房中の血液）、適切な深さではない前房、あるいは角膜のかなりの不透明度を含む処置合併症の兆候に目を調べます。 「妥協」として、これらの合併症を証明するものを考えてみましょうとCO ₂吸入によってそれらを安楽死させる。
   1. 無麻酔のマウスのすべての検査を実行します。一方、目のより良いビューを有効にするために目をproptoseできるように、このようにしてマウスを拘束片手でマウスを保持する。観測が完了すると、そのケージに動物を返す。
2. 治療群に不慣れでは角膜移植の兆候を2〜3回、週に移植した角膜を評価するオブザーバを持っている拒絶反応または角膜移植の失敗。手術用顕微鏡またはこれらの観​​察のための水平細隙灯生体顕微鏡のいずれかを使用します。
   1. 以下のようにスケールが定義されている0〜5のスケールを使用して不透明度毎に角膜を評価する。
      1. 不透明度の兆候を持っていないもの角膜0~10のスコアを割り当てます。
      2. 最小限の表面的な不透明性を示すもの角膜にスコア1を割り当てます。
      3. マイルドで深い不透明度を表示しますが根底にある瞳と虹彩はまだ識別可能である角膜へ2のスコアを割り当てます。
      4. 虹彩は、瞳孔の余白を除いて詳細に見ることができない、請求間質不透明度を表示角膜3のスコアを割り当てる。
      5. 密な間質不透明度を表示しない根本的な構造は閲覧できない場合角膜に4のスコアを割り当てます。
      6. 完全に覆い隠さ瞳孔と虹彩との完全な不透明度と集中的な間質浮腫を表示角膜に5のスコアを割り当てます。
   2. また、これを達成するために1〜8の評価尺度を使用して、血管浸潤（新血管形成）の程度ごとに角膜を評価する4つの等しい四分円からなるとして角膜を表示​​し、これらの象限のそれぞれの中の血管の量を決定するその象限の広範な血管新生のために0（無血管）から2の範囲で得点。最終的な血管新生スコアを計算するために各象限から個々のスコアを追加します。
   3. 彼らは5週間までの時点で連続する2つの観察のための3のスコアを持っているかのように急性拒絶された角膜を分類します。
   4. その角膜5週目で透明であったマウスを分類しますが> 45日の時点で混濁を開発後期長期角膜同種移植片拒絶を受けたように、2つの連続した​​時点で3のスコアで、移植を投稿してください。移植片生存を分析するために、カプラン - マイヤー生存曲線を使用する。

モデル5.操作

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脾臓からの単一細胞の調製。

1. 単一細胞を調製するため、第一のドナーマウスを安楽死させる。その後、脾臓を除去します。
2. セルストレーナーに脾臓を置き、それを3ミリリットルのシリンジからシリンジプランジャを混乱させる。
3. ハンクス平衡塩類溶液10mlに再懸濁細胞を洗ってください。
4. 細胞懸濁液10μlを削除し、0.4％トリパンの10μlに青追加し、混ぜる。血球計数器にそれを追加し、中央のグリッド内のセルを数える。チューブ内の細胞数は、細胞数×10 ^4×2（トリパンブルーで希釈係数）10（チューブ内の容積）×である。

前房内への注入。

1. 前述のようにマウスを麻酔。
2. 解剖顕微鏡を使用して注射を行う。各房内注入のために、10 ⁶ 0.005ミリリットルボリューム内の脾臓細胞と33 Gの針を取り付け0.25ミリリットルのマイクロシリンジを使用しています。
   注：その他の操作モデルの特定の因子が、同所角膜同種移植手術後の果たし得る役割を決定するためのいずれかのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する試薬で動物を処理することによって行うことができる。

Representative Results

角膜移植のマウスモデルが正常角膜同種移植片拒絶^19-23と角膜同種移植の受け入れ^{13、15,16,18、24-27}両方のメカニズムを特徴づけるために20年以上にわたって使用されてきた。このモデルは、FasLのを欠く動物は、角膜の同種移植片^15を受け入れることができなかったという点で、角膜の同種移植片の受け入れにFasL発現の重要性を確立するために使用した。また、血管内皮増殖因子受容体1モルホリノ処置は、角膜移植片生存^28を増加させること^を実証するために使用されてきた。コルチコステロイドは、任意の治療上の利点^29を開催して、非常に最近の報告では、このモデルは、角膜移植の前にマウスの前処理かどうかをテストするために使用された。著者らは、このような前処理は、角膜の同種移植片²⁹の生存率を改善したことを示した。これらのレポートは明らかにこのモデルの主な利点があることであることを実証1は、生きている動物にヒトで角膜移植の成功にとって重要であると考えられているそれらのものを学ぶことができます。

この研究室からの以前の研究は、角膜の同種移植片拒絶の原因チーフメカニズムの一つは、角膜の同種移植片^19,20によって発現される特異的アロ抗原に対する全身性遅延型過敏症（DTH）の確立であることを報告している。我々は、以来、ドナー角膜同種移植片で表さアロ抗原に対する全身アロ抗原に対するDTH寛容の確立がそのような移植片の生存を改善するかどうかをテストするためにこのモデルを使用しています。 図1に示すように、BALB / cマウスは、これらの角膜の同種移植片の平均生存期間によって測定される角膜の同種移植片受容を改善しなかったC57BL / 10（B10）同種抗原に対して寛容化。このように拒否された角膜の平均生存期間は、マウスが寛容化されたかどうか同じであった。我々はまた、手段として皮膚移植応答を使用して同様の研究を行った全身DTHの寛容化の効果を試験する。 （これらの研究は、DTH寛容は、B10のアロ抗原に向けて、BALB / cマウスに設立された際に、皮膚移植は、いくつかの（B10。D2およびC.B10-H-2 ^B）を有することを実証した、またはB10同種抗原のすべてがいずれかの平均生存時間の増加が表示されませんでした図2）。我々は、抗原特異的DTH応答を確立していたBALB / cマウスは、角膜または皮膚同種移植片のいずれかのためにそのような公差から任意の測定可能な利益を得ていなかったこれらの研究から結論。これらのデータはまた、角膜移植のマウスモデルを研究する生成された情報は、時刻に、固体組織移植の他の形態に直接適用可能であることを示している。

図1のBALB / cマウスをC57BL / 10（B10）マウスからの10 ⁶脾細胞と前房に注入した。 （P> 0.05）を示さなかった。

前房への脾臓細胞の図2の注射は同種皮膚移植片の生存に影響を与えない。BALB / cマウスは、C57BL / 10マウスからの10 ⁶個の脾臓細胞を前房内に注入した。 1週間後、これらのマウスは、別々のn = 10、B10.D2、nは7、C.B10-H-2 ^B、N = 7匹のマウスを、C57BL / 10から皮膚を移植し、比較した注入しC57BL / 10皮膚を移植し、N = 10結果は平均生存時間+ SEMとして表現さ​​れていなかったマウス。

Discussion

ここで説明する角膜移植のマウスモデルは、因子が最良の拒絶^{15,17,18,20、26-30}と角膜の受け入れ^21-25両方に関連付けられているかを予測するモデルでのヒト角膜同種移植片拒絶を研究する研究者を可能に同種移植片。患者が治療又は予防のいずれか拒絶³¹のいずれかに局所または全身ステロイド治療を与えられたヒト角膜移植とは異なり、このモデルは、典型的には、そのような治療の非存在下での同種移植拒絶に関連するこれらの要因を決定するために使用される。通常、移植の30〜40日以内に起こる急性の角膜同種移植拒絶反応のためのモデルに加えて、我々はまた、マウスと後期の多くの機能を模倣で45日後に移植を生じるような拒絶反応の後期長期モデルを提示これまでの動物でモデル化されていない-termおよび慢性拒絶^32,33。

T彼のモデルの強みは1つが、角膜同種移植の受け入れの比較的高速の責任だけでなく、角膜の同種移植失敗の最も責任あるメカニズムを決定され、様々なメカニズムを分析することができますということです。このモデルはまた、いずれかのヒトの免疫系に非常に類似している免疫系を保有する動物において様々な治療戦略をテストすることができる。そのために、マウスの要因だけでなく、トランスジェニックマウスおよび遺伝子標的マウスと反応する多くの試薬の存在は、他の種との場合よりも非常に多くの複数の因子の評価を可能にする。角膜同種移植片の成功と失敗の両方にとって重要であるので、多くの異なる要因を評価するこの能力は、目のサイズの増加に実行することが容易である有意な正のある他の動物モデルに対するこのマウスモデルを使用しての賛成でどの手術でこれらの種。

このモデルのいくつかの弱点がありますが、我々は強度がはるかにそれを上回ると考えています。上で言及した、最も重要なの一つは、マウスにおいて、角膜移植を行うことに関与して技術的な専門知識である。によるマウスの目のサイズが小さいため、これは、移植を行うならびに縫合糸の除去の両方の、顕微手術に熟達している人を必要とする。その結果、反復練習を習得し、この技術で熟練度を維持するために必要である。第二の弱点は、マウスはヒトに非常に似ているが、それらは同じではないことである。これらの動物は、人間の角膜を行うよりも、新生血管形成に向けた大きな傾向を示す。さらに、このモデルは、フックスジストロフィー²のような内皮細胞の機能不全を治療することを意味する外科手術を模倣しない。記載されているプロトコルで使用されるもののような最近の今年の全層移植に先立ち、採用された。現在、角膜のみ内皮部を含む内皮移植が採用されている、35。このような移植は、このような小さな動物でこの手術を行うのが困難にこれまで、マウスにおいてモデル化されていない。

後半の長期除去（> 45日）のためのモデルのこのバージョンに固有の2つの要因が目立つ。マウスが後期長期拒絶反応を研究するために、2〜3ヶ月の最低維持されなければならないということであるモデルは、このフォームの最初の弱点。そして第二に、角膜を第一の電位急性拒絶反応を生き残る必要があります。このような急性の拒絶は、受信者^{17、20 -24}の50から70パーセントで起こる。したがって、その移植急性拒絶されるマウスを生着ます後期中期拒否1を研究すると、45日後の生着まで生存しないであろう。これを緩和するために、我々は、雄マウスにおける不良率は、それが唯一の雄マウスことをお勧めします後期用語拒絶反応を研究するために雌マウス（原稿準備中）で観察されたものよりも小さいので、であることを見出した使用される。我々はまた、ステロイド治療で角膜同種移植片生存を延長しようとしましたが、これは特に有用であることを証明しなかった（個人的観測）、従ってステロイド治療が使用することをお勧めしません。これらの合併症と思わ約半分または同種角膜を移植したものの幾分より45日後まで明確なままになります警告にもかかわらず、これはまだ遅く、長期の拒絶に関連するこれらの要因を研究するために非常に有用なモデルである。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154