小鼠角膜移植模型，研究实体器官移植的最常见形式

Introduction

角膜移植是最成功的和常见的类型移植在人执行的一个。为什么进行该手术的原因是损伤，感染性疾病^1，或其他形式的非感染性角膜病²的结果。从美国眼库协会的数据显示，46000在2011年进行（见网站：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html）。其成功的标志是有一年不合格率同种异体角膜移植物的范围从10％至15％，并在5年的成功是超过^70％3-8。因为许多研究已经显示，角膜移植的成功是直接关系到一个事实，即眼睛的免疫特权部位。负责角膜状态作为免疫特权部位因素包括缺乏既血管和淋巴管在角膜中，相对缺乏抗原呈递细胞的因子，由角膜该suppres产生免疫效应器funtions ^9-15，MHC的低表达抗原^16，和FasL ^17-20的表达。

然而，尽管这些因素诱发这些移植成功的，它们经历排斥^3-7。因此，了解这些调解这种排斥反应的机制，以及测试各种治疗，以防止排斥反应是至关重要的。为此，我们在这里描述角膜移植是已经使用了超过20年，研究角膜移植在受控的实验环境的小鼠模型。自移植反应涉及协同工作的许多不同的因素，这将最终确定移植的组织是否失败或成功，则它不可能了解这些因素中的任何体外模型中的重要性。因此，使用完整的动物研究是必需的，以确定哪些因素是重要的成功或者failu重新移植组织。

而其它种类的动物被用来研究角膜移植中，当相比于使用其他种类的鼠模型中具有几个优点。第一个是表示某些转基因的或已被基因靶向至缺乏特异性免疫因子，其功能在移植可以更好地研究了表达小鼠的许多菌株的存在。此外，还有许多试剂（包括重组因子和抗体是中和因子）是特定于小鼠，并且不为其他许多种动物的存在。由于这些因素的存在，该模型已被广泛用于鉴定参与急性角膜移植反应^{15，17,18,20 -29}有关因素。此外，有许多参与角膜移植的因素也是已知的是功能在其他组织中的移植。

Protocol

注意：在此过程中使用的所有动物都按照研究协会在视觉与眼科语句在眼科和视觉研究用动物，以及订定圣路易斯大学动物监督委员会的指导方针进行处理。
注：所有手术器械和解决方案之前进行消毒手术，以限制眼睛微生物感染。应当指出的是，虽然动物做这个过程遇到一些痛苦，我们不使用止痛剂。这样做的理由是因为所有的止痛药是消炎和自角膜移植反应涉及炎症，使用抗炎药物会损害我们确定参与角膜移植失败哪些因素的能力。

1.麻醉

1. 氯胺酮（86腹腔注射将在全身麻醉供体和受体的小鼠。98毫克/公斤）和甲苯噻嗪（13.04毫克/千克）。
2. 保持麻醉状态下的受体小鼠在整个这通常需要30分钟到一个小时的过程。因此，不断地监视鼠标苏醒的迹象。
3. 申请puralube软膏，不会接受手术后的动物被麻醉，以防止干眼。

2.角膜移植术

1. 获得捐赠的角膜按钮。
   1. 一旦动物完全麻醉，达到充分散瞳由一对夫妇1％托吡卡胺和2.5％盐酸去氧肾上腺素的眼药水管理。
   2. 放置供体动物的头部水平在电路板上放置在一个坚固的可移动的支持。固定头的整个颈部带的条带，以保证眼睛处于整个操作的水平位置。
   3. 使用2毫米直径的环钻，其前端被染成用甲基蓝，出行角膜中央部位移植。
   4. 用锋利的刀片，穿透角膜与注入healon进入前房加深它减少损坏施主内皮和底层透镜的机会。
   5. 切除供体移植物与vannas剪刀，并放入含有Hanks平衡盐溶液，直到使用一盘菜。
   6. 后供体移植物已被移除，通过安乐死_二氧化碳吸入供体小鼠。
2. 准备移植床。
   1. 如在2.1.1中描述过2.1.2收件人重复相同的步骤。
   2. 使用1.5毫米直径的环钻，勾勒出收件人移植部位。
   3. 用锋利的刀片，穿透角膜与注入healon进入前房加深它来减少损伤的机会底层透镜。
   4. 使用vannas剪刀取下收件人概述角膜中央按钮并丢弃。
3. 缝合接枝
   1. 将供体角膜在移植床收件人的角膜。确保有足够的healon是在角膜供体，以保护捐赠者的内皮细胞通过镜头直接接触伤害。
   2. 使用超细尖microforceps，放置11-0尼龙缝线咬头到捐助方，通过与全层到收件人的面为90％深度的捐助，然后打结。
   3. 一旦角膜被固定到位，执行midcardinal间断缝合，使得所述角膜有8至10个总缝线和供体角膜牢固地排队与和连接到接收方的角膜移植物床。
4. 深化前房
   1. 通过注入的HBSS或气泡进入前房加深前房并轻轻检查角膜移植物的完整性对于泄漏用纤维素海绵。
      注意：如果前房不能改革则是C的概率高ataract这将使得移植角膜的未来的评估很困难，也将有可能导致供体角膜内皮功能紊乱，因此移植物衰竭。
5. 终期评估
   1. 观察的眼睛，以确定瞳孔是圆的，前房深度是正常的。
      注意：如果瞳孔不圆这表明缝合虹膜过程中损坏，因此，移植被认为是一个技术故障。
   2. 应用抗生素软膏的眼睛。可选：合上眼睑用7-0丝线缝合。
   3. 观察小鼠直到它们完全清醒，然后分别容纳他们最少两天后手术。

3.拆线

1. 在盖体缝合用于这些情况下，麻醉上述老鼠和盖子取下缝合处48小时。
2. 麻醉小鼠术后7天。取出suturES确保角膜移植。一旦缝线被删除，动物已经完全觉醒，将其放回笼子。

4.临床评价

1. 检查眼适应症手术并发症，包括，白内障（晶状体混浊），前房出血（血液中的前房）的前房，它是适当的深度，或角膜的显著不透明度不。想想那些表现出这些复杂的“妥协”，并通过_二氧化碳吸入安乐死他们。
   1. 执行对未麻醉的小鼠的所有考试。按住鼠标，用一只手从而抑制鼠标，这样另一方面可以proptose眼睛，使眼睛更好的视野。一旦观测完成后，返回到动物的笼子。
2. 有一个观察者不熟悉治疗组评估所移植的角膜每周2至3次，角膜移植的迹象排斥或角膜移植失败。请使用手术显微镜或水平裂隙灯生物显微镜对这些意见。
   1. 评估用于使用比例为0〜5的不透明度的尺度定义如下每角膜：
      1. 分配给0分给那些有混浊的迹象眼角膜。
      2. 指定1分给那些表现出最小的浅表角膜混浊。
      3. 分配给2分，以用于显示轻度和更深的不透明性，但潜在的瞳孔和虹膜仍是有迹可寻的眼角膜。
      4. 分配3分至角膜中显示基质的不透明度，其特征在于所述虹膜不能看到详细除瞳孔边缘的。
      5. 分配的4分至角膜中显示致密的基质混浊并且如果没有下面的结构能够被观看。
      6. 分配给5分，以角膜中显示完整的不透明性和密集的间质水肿，瞳孔与虹膜完全遮蔽。
   2. 还评估每个角膜供使用的1〜8的等级规模要做到这一点的血管浸润（新血管形成）的程度，查看角膜作为组成4相等象限并确定在每一个象限中具有的血管的量分数，范围从0（无船），以2象限广泛的血管。添加单独得分从各象限来计算最终新生血管得分。
   3. 归类为急性排斥，如果他们有连续两次观测的比分为3点的时间最多5周的眼角膜。
   4. 分类小鼠的角膜是透明的5个星期，但发展混浊，有时>45天植入后，用连续两个时间点分3，具有经过后期长期的角膜移植排斥反应。采用Kaplan-Meier生存曲线分析移植物的存活。

5.操纵的模型

在左：40PX;“>

制备单细胞脾。

1. 制备单细胞，首先安乐死的供体小鼠。然后，取出脾脏。
2. 将脾脏在细胞过滤并破坏其与由3毫升注射器的注射器柱塞。
3. 在10毫升Hanks平衡盐溶液中洗涤细胞并重新悬浮。
4. 删除10微升细胞悬液，加入10微升0.4％台盼蓝混匀。补充一点，对血球和细胞计数在中央格。细胞在管的数量是细胞数目×10 ^4×2（稀释因子中的台盼蓝）×10（在管体积）。

注射进入前房。

1. 麻醉小鼠，如前所述。
2. 执行使用解剖显微镜注射。对于每个房内注射，使用10 ⁶脾细胞中0.005毫升容积并配有一个33克针一0.25毫升微升注射器。
   注意：其他操作该模型可通过治疗动物与充当要么拮抗剂或激动剂，以确定特定因素可能起以下原位角膜移植术中的作用的试剂进行。

Representative Results

已用于角膜移植的小鼠模型中超过20年，成功刻画两个角膜移植排斥反应^19-23和角膜移植验收^{13，15,16,18，24-27}机制。该模型被用于建立在角膜移植接受FasL表达的重要性，在该动物缺乏FasL的不能够接受角膜移植物^15。它也被用来表明，血管内皮生长因子受体1啉治疗显著增加角膜移植存活^28。在一个非常最近的一份报告此模型来之前，角膜移植测试是否小鼠的预处理与皮质类固醇举行任何治疗益处^29。研究者发现，这种预处理确实提高角膜移植物²⁹的存活率。这些报道清楚地表明，该模型的主要优点是人们可以在活的动物研究是那些被认为是重要的角膜移植在人体中的成功的东西。

从这个实验室以前的研究报告说，负责角膜移植排斥反应的主要机制之一是建立系统性的迟发型超敏反应（DTH），以通过角膜移植^19，20表示具体的同种抗原的。我们既然用这个模型来测试建立系统性的同种抗原的DTH耐受捐助角膜移植异体抗原表达是否能改善这种移植物的存活率。 如图1中 ，BALB / c小鼠耐受到C57BL / 10（B10）同种抗原通过平均存活时间测量这些角膜移植并不能改善角膜移植接受。因此，平均存活时间为拒绝眼角膜是相同的小鼠是否耐受与否。我们也进行类似的研究利用皮肤移植反应的一种手段的检测的系统性DTH tolerization的有效性。这些研究表明，当建立于BALB / c小鼠的DTH公差朝B10同种抗原，皮肤移植物承载一些（B10.D2和C.B10-H-2 ^b）或所有的B10同种抗原没有表现出任何增加的平均存活时间（ 图2）。我们从这些研究中已建立的抗原特异性DTH反应的BALB / c小鼠没有从这种容忍任何可测量的好处对于任一角膜或皮肤移植物的结论。这些数据还表明，生成学习角膜移植的小鼠模型中的信息将在次，直接适用于其他形式的固体组织移植。

图1的BALB / c小鼠注射进入前房与来自C57BL / 10（B10）的小鼠10 ⁶脾细胞。 （P> 0.05）。

图2.注射脾细胞进入前房不会影响的同种皮肤移植物的存活。BALB / c小鼠注射到前房与来自C57BL / 10小鼠10 ⁶个脾细胞。一周后，这些小鼠被单独移植了来自C57BL / 10的皮肤中，n = 10，B10.D2中，n = 7，C.B10-H-2 ^B，N = 7只小鼠和相比了未注射和移植了C57BL / 10的皮肤中，n = 10，结果表示为平均存活时间+ SEM小鼠。

Discussion

这里描述角膜移植的小鼠模型使研究人员研究人类角膜移植排斥反应的模型，该模型预测的因素是什么，最好既排斥^{15,17,18,20，26-30}和角膜的验收^21-25关联移植。不象人类角膜移植，其中给予患者或者局部或全身激素治疗，以任一治疗或预防排斥^31，该模型通常用于确定那些是相关的同种异体移植排斥反应在不存在这样的治疗的因素。除了一款型号为急性角膜移植排斥反应，这通常发生在移植的30〜40天，我们也存在发生45天后植入小鼠和模仿很多后期的特征，例如拒绝较晚期模型-term和慢性排斥反应^32,33迄今还没有被模仿的动物。

牛逼他的模型的优势是可以解剖，负责对角膜移植的接受率比较高，以及确定哪些机构最负责角膜移植失败的各种机制。该模型还允许人们在动物中它具有免疫系统，这是非常类似于人类的免疫系统测试不同的治疗策略。为此，许多试剂与鼠因子以及转基因和基因靶向的小鼠中发生反应的存在，允许这么多因素的评价比将是与其他物种的情况。这个能力来评价如此很多都是很重要的两个成功的角膜移植物和失败不同因素有利于使用该小鼠模型中相对于其它的动物模型手术容易进行，其中的一个显著正由于眼睛的尺寸增大这些物种。

虽然有这种模式的几个弱点，我们相信实力远远超过他们。其中最显著，这是上面提到的，是涉及在小鼠中进行角膜移植的技术专长。由于鼠眼的小尺寸，这需要有人谁是擅长显微，无论是在执行缝线的移植以及去除。因此，反复练习掌握，并在此技术维护能力是必需的。第二个弱点是，当小鼠非常相似于人类，它们是不相同的。这些动物显示对新生血管形成一个更大的趋势，比人的眼角膜。此外，这种模式将不会模仿意味着治疗血管内皮细胞功能障碍像Fuch的萎缩²的外科手术。在此之前最近一年的全层移植像是在描述协议中使用的那些被雇用。目前，累及角膜的唯一内皮部分内皮移植已使用34，35。这样移植没有模拟迄今对小鼠由于在这样的小动物进行该手术的难度。

对于后期的长期抑制（> 45天）两个因素独此版本的车型中脱颖而出。为了研究后期的长期排斥，必须保持至少两到三个月的第一个弱点这种形式的模型是老鼠的。其次，眼角膜必须先生存潜在的急性排斥反应。例如急性排斥反应发生在50到收件人¹⁷的^{70％，20 -24。}因此，研究后期长期抑制人会灌输小鼠的移植将被敏锐地拒绝，将无法生存，直到45天后植入。为了减轻此我们已经发现，废品率雄性小鼠小于所观察到雌性小鼠（手稿中制备），并由此来研究末期术语排斥它是表示只雄性小鼠被使用。我们也试图延长角膜移植物存活与类固醇治疗，但这并不能证明是特别有用的（个人意见），因此不建议使用类固醇治疗。尽管这些并发症和可能的大约一半或稍微那些植入同种异体角膜将保持清零​​，直到45天后的警告，这仍然是研究那些相关的后期长期的抑制因素，一个非常有用的模式。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Surgical Microscope	Zeiss	Rebuilt
1 ml Syringe	BD	305122
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309602
Vannus Scissors	Stortz	E-3387
11-0 Sutures	Alcon	717939M
Trephine 2.0 mm	Katena	K 2-7520
Trephine 1.5 mm	Katena	K 2-7510
Tricaine Hydrochloride 0.5%	Alcon	NDC 0065-0741-12
Healon	Abbott	Healon OVD
Forceps	FST	11251-20
7-0 Sutures	Alcon	8065
2.5% Phenylephrine HCl	Alcon	NDC 61314-342-02
1% Tropicamide	Bausch & Lomb	NDC-24208-585-59
Hamilton Syringe	Hamilton	7654-01
33 gauge needle	Hamilton	90033
Cell Strainer (100 μm nylon)	BD Falcon	352360
Hemocytometer	Cardinal Health	B3175
Trypan Blue	Sigma	T8154